一种从四方藤中提取纯化岩白菜素的方法.pdf

本发明公开了一种从四方藤中提取纯化岩白菜素的方法，将四方藤粉碎，过筛，按照质量体积比为1：8~20加入乙醇溶液回流提取，固液分离得到滤液，将滤液浓缩，向浓缩液中加入大孔树脂静态吸附，将吸附后的大孔树脂上柱，依次先用蒸馏水、乙醇溶液除去杂质、洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩得到岩白菜素粗品，将岩白菜素粗品用乙醇重结晶得到岩白菜素纯品。本发明原料来源广泛，价格便宜，生产成本低，生产条件温和，对环境污染小。

1.  一种从四方藤中提取纯化岩白菜素的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将四方藤粉碎，过筛，按照质量体积比为1：8~20加入40~60%的乙醇溶液回流提取；
（2）固液分离得到滤液，将滤液浓缩至其原体积的1/2~1/3，同时回收溶剂;
（3）向浓缩液中加入大孔树脂静态吸附6~8小时，大孔树脂选自AB-8、D3520、D101；
（4）将吸附后的大孔树脂上柱，依次先用蒸馏水、10%的乙醇溶液除去杂质；
（5）用20%的乙醇溶液洗脱，收集20%乙醇洗脱液；
（6）将20%乙醇洗脱液浓缩，得到岩白菜素粗品；
（7）将岩白菜素粗品用乙醇重结晶得到岩白菜素纯品。

2.  根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤（2）中，固液分离的方法为过滤或离心分离，滤液浓缩至岩白菜素浓度2mg/mL。

3.  根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤（4）中,用2倍柱体积的蒸馏水和2倍柱体积的10%乙醇除去杂质。

4.  根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤（5）中,用7倍柱体积的20%乙醇洗脱。

5.  根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤（6）中,所述的浓缩方法为真空浓缩或膜浓缩。

6.  根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤（7）中,用95%的乙醇进行重结晶。

一种从四方藤中提取纯化岩白菜素的方法
技术领域
本发明涉及一种从四方藤中提取、纯化岩白菜素的方法，属于天然药物开发利用技术领域。
背景技术
四方藤（CissusPterocladaHayata）属于葡萄科（Vitaceae）白粉藤属（CissusLinn.）植物，因其茎、枝、叶柄呈锐四方形而得名，又名方藤、宽筋藤、蚂蝗藤等。四方藤主要分布于我国的广西、广东、云南等南方地带，资源丰富，其性酸、涩、甘、平，具有活血散瘀、祛风湿、舒筋络、消炎等功效，在我国民间广泛用于风湿痹痛、腰肌劳损、外伤、出血等病痛的治疗，具有良好疗效。例如百色地区农民直接用四方藤鲜叶捣烂外敷止血；百色医院将四方藤制成粉剂和注射剂，用于治疗内外伤出血，十二指肠出血，胃炎等疾病。四方藤收载于《广西中草药》、《广西药用植物名录》、《中国药典》（1977年版一部）、《中药大辞典》等典籍中，因其来源丰富、价格低廉、疗效广泛而显著，是一种极具有开发利用价值的特色民族药用植物。尽管四方藤在我国少数民族民间具有悠久的药用历史与经验，但由于四方藤化学成分与药理研究的缺乏，在四方藤有效成分的开发利用上，尚未有深度产品的出现，其在市场上仍以原药材的形式出售，价格低廉。岩白菜素的结构：

岩白菜素又名虎儿草素、岩白菜内酯，分子式为C₁₄H₁₆O₉，是一种具有异香豆素结构的天然化合物。岩白菜素及其衍生物具有抗炎、止咳、镇痛、抑菌、抗氧化等多种药理活性。岩白菜素已作为镇咳祛痰药收载于《中华人民共和国药典》各版本中，在临床上用于支气管炎、肺气肿、胃炎等疾病的治疗，具有良好疗效，是一种药理活性广泛、疗效显著、毒副作用低的天然药物。
由于化学合成的困难，岩白菜素主要用从天然药用植物中提取、纯化法制备。目前，岩白菜素提取方法的报道较多，而对于其纯化方法的报道较少。岩白菜素的提取方法主要有索式提取法、超声波提取法、超临界提取法、有机溶剂回流提取法、碱提取法等。然而，目前用于纯化岩白菜素提取物的方法难于规模化制备。如硅胶柱层析法是实验室常用的分离手段，但硅胶不能回收，洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯、氯仿等有毒有机溶剂，成本高，操作难度大，不能用于产业化制备；重结晶法，必须是待结晶溶液中岩白菜素的含量高达一定程度时才能使用，普通的岩白菜素提取物，在没有经过其它方法富集之前，比较难于结晶而无法直接用重结晶法纯化。鉴于此，目前有机溶剂提取法尚停留在获得含有岩白菜素粗提物的阶段，而要利用该提取法大批量制备岩白菜素纯品，必须开发出可产业化放大、成本低的纯化方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适合产业化放大，成本低的从四方藤中制备原料药岩白菜素的方法。
本发明通过如下技术方案实现的。
一种从四方藤中提取纯化岩白菜素的方法，包括如下步骤：
（1）将四方藤粉碎，过筛，按照质量体积比为1：8~20加入40~60%的乙醇溶液回流提取；
（2）固液分离得到滤液，将滤液浓缩至其原体积的1/2~1/3，同时回收溶剂;
（3）向浓缩液中加入大孔树脂静态吸附6~8小时，大孔树脂选自AB-8、D3520、D101；
（4）将吸附后的大孔树脂上柱，依次先用蒸馏水、10%的乙醇溶液除去杂质；
（5）用20%的乙醇溶液洗脱，收集20%乙醇洗脱液；
（6）将20%乙醇洗脱液浓缩，得到岩白菜素粗品；
（7）将岩白菜素粗品用乙醇重结晶得到岩白菜素纯品。
上述步骤（2）中，固液分离的方法为过滤或离心分离，滤液浓缩至岩白菜素浓度2mg/mL。
上述步骤（4）中,用2倍柱体积的蒸馏水和2倍柱体积的10%乙醇除去杂质。
上述步骤（5）中,用7倍柱体积的20%乙醇洗脱。
上述步骤（6）中,所述的浓缩方法为真空浓缩或膜浓缩。
上述步骤（7）中,用95%的乙醇进行重结晶。
本发明的优点在于：采用40~60%的酒精提取，具有绿色无毒、提取率高、成本低、易回收利用等优点；采用大孔树脂纯化和富集，具有吸附量大、可重复利用、易于产业化放大、成本低等优点，经过大孔树脂纯化后，可获得岩白菜纯度在80%以上的粗品；将大孔树脂纯化后是岩白菜素粗品，经过乙醇溶液重结晶便可获得满足作为原料药使用的岩白菜素纯品；本发明原料来源广泛，价格便宜，生产成本低，生产条件温和，对环境污染小。
附图说明
图1为本发明提取纯化工艺流程图；
图2不同大孔树脂的静态饱和吸附率；
图3不同大孔树脂的静态解吸率。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
将500g的四方藤粉末，加入50%乙醇溶液，使四方藤粉末的质量与乙醇的体积比为1:20，回流提取1次，每次2h，离心、过滤、弃去废渣收集得到滤液，将滤液浓缩，同时回收溶剂。将浓度为2.0mg/mL的浓缩液，按体积与大孔树脂质量为1:1的比例，加入AB-8大孔树脂中进行静态吸附，吸附时间为8h，然后上柱。先用2倍柱体积的蒸馏水和2倍柱体积的10%乙醇除去杂质，然后再用7倍柱体积20%乙醇溶液进行洗脱，收集20%乙醇洗脱部分。将洗脱液浓缩，得到岩白菜素粗品10.3g，95%乙醇重结晶后得到岩白菜素纯品8.9g。
实施例2
将1Kg的四方藤粉末，加入50%乙醇溶液，使四方藤粉末与乙醇的质量体积比为1:15，回流提取2次，每次2h，离心、过滤、弃去废渣收集得到滤液，将滤液浓缩，同时回收有机溶剂。将浓度为2.0mg/mL的浓缩液，按体积与大孔树脂质量为1:1的比例，加入D3520大孔树脂中进行静态吸附，吸附时间为8h，然后上柱。先用2倍柱体积的蒸馏水和2倍柱体积的10%乙醇除去杂质。然后再用7倍柱体积20%乙醇溶液进行洗脱，收集20%乙醇洗脱部分。将洗脱液浓缩，得到岩白菜素粗品20.5g，95%乙醇重结晶后得到岩白菜素纯品17.6g。
实施例3
将10Kg的四方藤粉末，加入60%乙醇溶液，使四方藤粉末与乙醇的质量体积比为1:10，回流提取3次，每次2h，离心、过滤、弃去废渣收集得到滤液，将滤液浓缩，同时回收有机溶剂。将浓度为2.0mg/mL的浓缩液，按体积与大孔树脂质量为1:1的比例，加入D101大孔树脂中进行静态吸附，吸附时间为8h，然后上柱。先用2倍柱体积的蒸馏水和2倍柱体积的10%乙醇除去杂质。然后再用20%乙醇溶液进行洗脱，收集20%乙醇洗脱部分。将洗脱液浓缩，得到岩白菜素粗品200.6g，95%乙醇重结晶后得到岩白菜素纯品169.7g。
岩白菜素粗品的收率在2%左右，经过HPLC检测纯度均在80%以上，经过95%的乙醇重结晶后即可获得岩白菜素纯品，收率在1.7%左右，因不同产地、季节采收的四方藤中岩白菜素的含量差异较大，收率偏高、偏低均属正常现象。本法采用可重复利用的大孔树脂与重结晶结合的方法制备岩白菜素，具有操作简洁、成本低、易于产业化放大的优点。
实施例4大孔树脂选型研究
大孔树脂具有极性、弱极性、非极性等多种类型，在本发明中，发明人选择了LSA-700（极性）、LSA-700B（极性）、D941（极性）、AB-8（弱极性）、D3520（非极性）、D101（非极性）这7种大孔树脂作为考察对象，通过静态与动态吸附、解吸来确定适合用于纯化四方藤中岩白菜素的大孔树脂。
静态吸附实验结果如图2所示，可见LSA-700、LSA-700B、AB-8、D101、D941、D3520六种大孔树脂在静态吸附24h后，均已接近饱和吸附，其静态吸附率均超过90%，其中AB-8、D101、D3520三种树脂的静态饱和吸附率高于其它3种。生产中要求树脂吸附量大且解吸附率高，以保证有效成分最大限度地回收。故发明人进一步利用大孔树脂的解吸实验来优选树脂，其实验结果如图3所示。
从图3可知，上述六种大孔树脂在静态解吸时表现出明显的差异性：其中D101、AB-8、D3520树脂的解吸附能力较强，均超过80%，适合用于四方藤中岩白菜素的分离纯化；而LSA-700、LSA-700B、D941树脂的解吸附能力较弱，只有约30%，在纯化过程中不利原料回收，造成原料浪费，故不选用。
另外，经过动态实验表明D101、AB-8、D3520这三种树脂对岩白菜素的动态饱和吸附量、动态解吸率均相当，没有明显差异，故发明人选用D101、AB-8、D3520这3种大孔树脂用于四方藤中岩白菜素的分离纯化。
实施例5乙醇浓度与用量的选择优化
采用薄层色谱（TLC）对不同浓度乙醇流出液中成分进行检测，展开剂的条件为氯仿:乙酸乙酯:甲醇=5:4:2.5，其结果如表1所示。由表1可知，蒸馏水与10%的乙醇洗脱大孔树脂时，并无岩白菜素被洗出，此时洗脱液中主要为水溶性杂质；当洗脱液为20%的乙醇时，根据TLC跟踪，发现有岩白菜素被洗脱。随着乙醇浓度的增加，岩白菜被洗脱的同时其它脂溶性杂质也随之流出，不利于岩白菜素的纯化亦造成溶剂浪费、成本增加，故在后续实验中进一步考察乙醇浓度为20%、40%、60%时的洗脱情况，其结果如表1、2、3所示。



由此可见，先用2倍柱体积（BV）的水、2倍柱体积10%的乙醇溶液洗脱可以除去杂质，再用7倍柱体积20%的乙醇水溶液洗脱，所得到的岩白菜素粗品纯度高，对于AB-8、D101、D3520三种大孔树脂，分别为84.98%、88.13%、82.18%。
实施例6上样浓度的优化
当提取完毕，进行固液分离后，提取液中岩白菜素的量是一定，但提取液浓缩的程度直接影响到提取液中岩白菜素的浓度，岩白菜素的浓度对大孔树脂吸附、解吸是有影响的，故发明人考察上样浓度的影响。表4、5、6为提取液中岩白菜素含量均为39.94mg时的实验结果。



从上述实验结果可见，当上样浓度为1.997mg/ml≈2mg/ml时，大孔树脂的吸附量和解吸率最佳，故浓缩至岩白菜素的浓度约为2mg/mL时进行上样（用液相色谱法进行检测）。
大孔树脂对提取液中岩白菜素的吸附率会随着吸附时间的增长而变大，发明人在静态吸附实验中发现当吸附时间8h以上时，吸附率变化幅度不大，并考虑到生产周期，故将吸附时间定为8h。