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1、(10)申请公布号 CN 102586392 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102586392 A *CN102586392A* (21)申请号 201210079970.6 (22)申请日 2012.03.25 C12Q 1/06(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/33(2006.01) (71)申请人 中国水产科学研究院黄海水产研究 所 地址 266071 山东省青岛市市南区南京路 106 号 (72)发明人 贾玉东 孟振 刘新富 高淳仁 雷霁霖 (74)专利代理机构 青岛海昊知识产权事务所有 限公司 37201 代理人 曾庆国 。
2、(54) 发明名称 一种大菱鲆未受精卵的质量检测方法 (57) 摘要 本发明涉及一种大菱鲆未受精卵的质量 检测方法， 当大菱鲆未受精的卵子 RNA 浓度在 0.7800.001g/ 卵 时， 且 Pr RNA DNA 为 227-250 12-13.5 1-1.2 时， 受精率和孵化率 最高， 此时卵子质量最佳。 本发明的方法可以快速 有效的对大菱鲆卵子质量进行检测， 从而可以快 速确定待研究的卵子是否符合生产需求， 提高了 生产效率， 同时进一步完善了硬骨鱼类卵子质量 评价体系， 为研究其他养殖海水鱼类卵子质量评 价提供了有效平台和借鉴。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 。
3、4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种评价大菱鲆未受精卵质量的标准， 其特征在于， 所述的标准如下 ： 质量 好 的 大 菱 鲆 未 受 精 卵， 其 RNA 浓 度 为 0.7800.001g/ 卵， 且 Pr RNA DNA 为 227-250 12-13.5 1-1.2。 2. 一种大菱鲆未受精卵的质量检测方法， 其特征在于， 是用权利要求 1 所述的标准来 判定大菱鲆未受精卵的质量好坏。 3. 权利要求 2 所述的检测方法， 其具体操作如下 ： 首先精确计数卵子的数量。
4、， 然后将收 集的卵子用无菌蒸馏水冲洗后， 通过常规的分子生物学方法获得 DNA， DNA， Pr 的含量， 最后 确定卵子的质量。 4. 如权利要求 3 所述的检测方法， 其特征在于所述的精确计数卵子的量， 是采用 大菱鲆卵子快速计数板来计数的， 其中计数板包括有一个基板， 在基板内有用于测量大 菱鲆卵子数量的测量孔， 所述的测量孔的尺寸 ( 长 宽 高 ) 为 10mm10mm1mm、 20mm20mm1mm、 40mm40mm1mm 或 124mm50mm1mm 中的任一种或几种 ； 且测量孔的 底部开有不少于一个的用于排水的筛孔， 筛孔的直径在 0.5mm 以内。 5. 如权利要求 3。
5、 所述的检测方法， 其特征在于所述的计数板， 还包括有一个用于承载 基板的底座。 6. 如权利要求 3 所述的检测方法， 其特征在于所述的基板， 其长 宽 高尺寸为 130mm128mm5mm ； 设置有四排测量孔， 第一排为 10 个 10mm10mm1mm 的测量孔， 第二 排为 5 个 20mm20mm1mm 的测量孔， 第三排为 3 个 40mm40mm1mm 的测量孔， 第四排为 1 个 124mm50mm1mm 的测量孔。 7. 如权利要求 3 所述的检测方法， 其特征在于所述的 DNA， DNA， Pr 的含量， 是分别采用 CTAB， Trizol， SDS 裂解提取法来获得的。
6、。 权 利 要 求 书 CN 102586392 A 2 1/4 页 3 一种大菱鲆未受精卵的质量检测方法 技术领域 0001 本发明属于卵子质量检测技术领域， 具体是一种大菱鲆未受精卵的质量检测方 法。 背景技术 0002 大菱鲆 (Scophthalmus maximus) 是当前欧洲的重要海水养殖鱼类之一， 自 1992 年大菱鲆被引进中国以来， 在水产科研工作者和养殖企业的共同努力下， 大菱鲆在工业化 养殖领域取得了重大成效， 最高年产量达5万吨以上， 年产值逾40亿元， 从而成为我国水产 养殖业一个新的经济增长点。 0003 在大菱鲆等硬骨鱼类人工繁养殖过程中， 卵子的质量是影响繁殖。
7、性能的一个关键 因素， 它直接关系到胚胎的发育以及仔、 稚、 幼鱼的成活和生长， 与养殖效率密切相关。 雌性 亲鱼的营养状况和养殖环境中的光照、 水温变化是影响卵子质量的主要因素， 此外人工繁 育过程催产剂的使用和不同的养殖模式也会对卵子的质量产生影响， 因此需要对卵子的质 量进行客观、 快速的检测， 从而优化亲鱼培育， 提高养殖效率， 同时筛选出的高质量卵子也 为深入研究海水硬骨鱼类胚胎发育调控机制提供了有效的平台和保障。 目前对大菱鲆卵子 质量的评价通常是对其外观形态及生产性状检测， 如色泽、 沉浮性、 受精率和死亡率等。从 外观上进行检测虽然速度快， 但准确率低 ； 而通过孵化率来检测，。
8、 虽然具有最高的准确率， 但却耗时耗力， 无法在最短时间内给出实验结果数据。 因此， 提供一种快速有效的大菱鲆卵 子质量评价方法， 可为大菱鲆规模化苗种选育提供技术基础。 发明内容 0004 本发明目的是提供一种评价大菱鲆卵子质量的新方法， 采用此方法可以弥补现有 技术的不足， 进一步完善卵子质量评价体系。 0005 本发明通过对大菱鲆未受精卵子内脱氧核糖核酸 (deoxyribonucleic acid， DNA)、 核糖核酸(ribonucleic acid， RNA)和蛋白质(protein， Pr)含量的检测， 同时结合相 应的卵子受精率和孵化率的测定， 建立一种评价大菱鲆卵子质量的新。
9、方法， 为大菱鲆卵子 质量评价提供可靠的技术手段。 0006 申 请 人 在 长 期 的 研 究 中 发 现，当 大 菱 鲆 未 受 精 的 卵 子 RNA 浓 度 在 0.7800.001g/ 卵时， 且 Pr RNA DNA 为 227-250 12-13.5 1-1.2 时， 受精率和 孵化率最高， 此时卵子质量最佳。 0007 本发明的方法， 具体操作如下 ： 首先精确计数卵子的数量， 然后将收集的 卵子用 无菌蒸馏水冲洗后， 通过常规的分子生物学方法获得 DNA， DNA， Pr 的含量， 最后确定卵子的 质量。 0008 上述精确计数卵子的量， 可以采用手工计数的方法， 也可以采用。
10、便携式大菱鲆卵 子快速计数板来计数， 所述的计数板包括有一个基板， 其特征在于， 在基板内有用于测量 大菱鲆卵子数量的测量孔， 所述的测量孔的尺寸 ( 长 宽 高 ) 为 10mm10mm1mm、 说 明 书 CN 102586392 A 3 2/4 页 4 20mm20mm1mm、 40mm40mm1mm 或 124mm50mm1mm 中的任一种或几种 ； 且测量孔的 底部开有不少于一个的用于排水的筛孔， 筛孔的直径在 0.5mm 以内。 0009 上述的计数板， 还包括有一个用于承载基板的底座。 0010 上述的基板， 其长 宽 高尺寸为 130mm128mm5mm ； 可以设置有四排测量。
11、 孔， 第一排为 10 个 10mm10mm1mm 的测量孔， 第二排为 5 个 20mm20mm1mm 的测量孔， 第三排为 3 个 40mm40mm1mm 的测量孔， 第四排为 1 个 124mm50mm1mm 的测量孔。 0011 所述的获得DNA， DNA， Pr的含量， 分别采用CTAB， Trizol， SDS裂解提取法来获得。 0012 本发明的方法可以快速有效的对大菱鲆卵子质量进行检测， 从而可以快速确定待 研究的卵子是否符合生产需求， 提高了生产效率， 同时进一步完善了硬骨鱼类卵子质量评 价体系， 为研究其他养殖海水鱼类卵子质量评价提供了有效平台和借鉴。 附图说明 0013 。
12、图 1 ： 本发明用到的计数板的立体结构示意图 ； 0014 图 2 ： 本发明用到的计数板的平面示意图 ； 0015 其中 ： 1、 基板 2、 测量孔 3、 筛孔 4、 底座。 具体实施方式 0016 下面结合实施例对本发明的方法进行详细描述 ： 0017 1) 确定卵子量 ： 0018 用吸管分别吸取 1ml、 3ml、 5ml、 10ml 大菱鲆卵子和卵巢液的混合物， 置于便携式 大菱鲆卵子快速计数板顶板内大小不一的方格内， 然后计算得出每毫升卵子和卵巢液的混 合物中的卵子数， 最后根据卵子和卵巢液的混合物体积得出卵子数量 ； 0019 计数板可以用塑料等材质制成， 例如用于制备 96。
13、 孔细胞培养板的材料也可 以用 来制备本发明的计数板。 在外形上， 计数板同目前使用的细胞培养板类似(如图1)， 包括有 作为载体的基板 1， 和用于盛放基板 1 的底座 4， 底座 4 可以用来承接由基板 1 中漏出的液 体。 0020 基板 1 为一个长方形面板， 一种尺寸如下 ： 长 130mm、 宽 128mm、 高 5mm， 再基板上 可以设有大小不同的 19 个测量孔 2， 第一排 10 个 ( 长 10mm、 宽 10mm、 高 1mm)、 第二排 5 个 ( 长 20mm、 宽 20mm、 高 1mm)、 第三排 3 个 ( 长 40mm、 宽 40mm、 高 1mm)、 第四。
14、排 1 个 ( 长 124mm、 宽 50mm、 高 1mm)， 测量孔 2 与测量孔 2 之间的距离为 2mm， 测量孔 2 底部有圆形的 筛孔 3、 孔直径在 0.5mm 以内 ( 图 1)。因为大菱鲆正常卵子直径在 0.9-1.1mm 之间， 所以 10mm10mm1mm 方格内卵子数目约为 100 个、 20mm20mm1mm 方格内卵子数目约为 400 个、 40mm40mm1mm 方格内卵子数目约为 1600 个、 124mm50mm1mm 方格内卵子数目约 为 6200 个。而筛孔 3 的尺寸可以保证卵子不会漏出， 而液体则可以排出， 从而保证测量时 的准确性。筛孔 3 的数目可。
15、以为任意多个。 0021 另外， 测量孔 2 在基板 1 上的分布也有很多的选择， 即可以是单一大小的测量孔， 也可以是不同大小的测量孔之间的组合， 具体根据使用者的习惯确定。 0022 2) 三种物质提取、 定量的描述 ： 0023 精确计数卵子数量后， 取 100 个卵， 无菌蒸馏水冲洗 3 次后， 分别采用 CTAB， 说 明 书 CN 102586392 A 4 3/4 页 5 Trizol， SDS 裂解提取法提取 DNA， RNA， Pr， 利用紫外分光光度计检测其浓度。 0024 DNA 提取和定量 0025 取卵子 100 个， 置于 1.5ml EP 管中， 适当剪切后立即加。
16、入 0.5ml 65预热的 2CTAB 提缓冲液， 充分混匀， 65保温 10 20min ； 0026 加入等体积的氯仿， 轻轻颠倒离心管混匀， 室温下， 12000rpm， 离心 10min ； 0027 将上清液转入另一个 1.5ml EP 管中， 加入 1/10 体积的 10的 CTAB， 混合均匀， 0028 加入等体积氯仿， 颠倒混匀， 室温下 12000rpm， 离心 10min ； 取上清， 重复该步骤 一次 ； 0029 将上层水相转入另一新的1.5ml EP管中， 加入2倍体积无水乙醇， 混匀， 室温静 置 30min 后， DNA 以沉淀形式出现， 用枪头小心挑出沉淀， 。
17、并将沉淀转移到 1.5ml 的离心管 中， 用70的乙醇洗沉淀两次， 室温干燥沉淀， 肉眼观察DNA呈无色胶冻样， 加50l超纯水 溶解 DNA ； 0030 DNA 浓度的测定 ： 用紫外分光光度计 (Nanodrop) 检测 DNA 的浓度， 计算得出卵 子 DNA 含量。 0031 RNA 提取和定量 0032 加 1ml Trizol 到卵子中 (100 个 )， 反复吹打， 使卵子充分溶解， 室温静置 5min 后， 转入 1.5m1 经 DEPC 处理 EP 管 ； 0033 每 EP 管加入 200l 氯仿， 在漩涡器上剧烈振荡 15 30s， 充分混匀 ； 0034 在 4下，。
18、 12,000rpm 离心 15min， 离心后 EP 管内分三相 ： 下层红色的酚相， 中间 层为白色氯仿相， 上层为无色的水相 ； 0035 将上层水相小心吸 400l 至经 DEPC 处理的新 EP 管中， 加入等体积的异丙醇， 室温放置 15min 后， 4， 12,000rpm 离心 10min ； 0036 弃去上清， 用 1ml 75的乙醇 (0.1 DEPC 作溶剂 ) 清洗沉淀， 剧烈震荡， 4以 7,500rpm 离心 10min， 用微量移液器将乙醇吸尽， 室温放置数分钟风干， 肉眼观察 RNA 呈无 色胶冻样最佳 (15min 左右 ) ； 0037 RNA 浓度的测定。
19、 ： 50l 超纯水溶解 RNA， 用紫外分光光度计 (Nanodrop) 检测 RNA 的浓度， 计算得出卵子 RNA 含量。 0038 Pr 提取和定量 0039 把卵子 (100 个 ) 适当剪切后， 加入 150l 融解 SDS 裂解液， 混匀， 充分裂解 (3-5min) ； 0040 充分裂解后， 10000 14000rpm 离心 3-5min， 取上清， 用紫外分光光度计 (Nanodrop)562nm 处 BCA 法测定蛋白浓度， 计算得出卵子蛋白子含量。 0041 通过受精率和孵化率检测该方法的准确度。 0042 将同一来源的卵子， 一部分测定 DNA、 RAN、 Pr 的。
20、含量， 一部分进行受精率和孵化率 的检测。同时对不同处理、 养殖条件下的卵子进行平行实验， 在相同的条件下受精和孵化， 利用便携式大菱鲆卵子快速计数板统计受精率和孵化率。 0043 受精率统计 ： 卵子受精 2 4 小时后， 吸管分别吸取 1ml、 3ml、 5ml、 10ml 大菱鲆卵 子和海水的混合物， 置于便携式大菱鲆卵子快速计数板顶板内大小不一的方格内， 待海水 从方格底部筛孔中流出后， 在倒置显微镜下观察受精卵发育情况 ( 正常受精卵此时发育至 说 明 书 CN 102586392 A 5 4/4 页 6 四细胞期， 未受精卵发育停止 )， 根据方格容纳量不同， 计数卵子， 计算得出。
21、卵子受精率 ； 受 精率正常发育卵子数 / 总卵数 0044 孵化率统计 ： 卵子受精后， 每间隔12小时， 吸取沉于孵化网箱底部的死卵(发育正 常的卵子浮于水层表面 )， 置于便携式大菱鲆卵子快速计数板顶板内大 小不一的方格内， 根据方格容纳量不同， 计数发育失败的卵子数 ； 待仔鱼孵化后， 统计孵化仔鱼总数， 计算得 出孵化率 ； 0045 孵化率孵化仔鱼数 /( 沉卵总数 + 孵化仔鱼数 ) 0046 在胶南通用水产有限公司亲鱼车间内进行试验， 取产卵期的雌性亲鱼 20 尾， 分别 挤卵后用吸管分别吸取两次各 10ml 的卵子和卵巢液的混合物， 并用本发明的计数板确定 个数后， 其中 1。
22、0ml 的卵子用于进行受精率和孵化率的检测， 10ml 用于提取三种分子， 并定 量。将 20 组的数据进行分析后， 得到如下表的数据 ： 0047 RNA(g/ 卵 ) Pr RNA DNA 受精率 孵化率 0.2050.001 231-251 3-4 1-1.2 33.200.35 22.701.48 0.7800.001 227-250 12-13.5 1-1.2 86.832.21 66.494.76 0.2300.012 231-258 3.5-4.7 1-1.1 44.660.85 30.724.69 0048 结果显示未受精的卵子 RNA 浓度在 0.7800.001g/ 卵时， 且 Pr RNA DNA 在 227-250 12-13.5 1-1.2 时， 受精率和孵化率最高， 此时卵子质量最佳。 0049 在不同养殖厂对不同来源大菱鲆的卵子质量进行检测， 结合受精率和孵化率的验 证， 结果表明本发明的检测标准可以有效的确定卵子的质量好坏， 从而为养殖和科研提供 了翔实和有效的试验数据。 说 明 书 CN 102586392 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102586392 A 7 。