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1、(10)申请公布号 CN 102719540 A (43)申请公布日 2012.10.10 CN 102719540 A *CN102719540A* (21)申请号 201210193101.6 (22)申请日 2012.06.12 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 福州艾迪康医学检验所有限公司 地址 350004 福建省福州市台江区五一路 26 号 (72)发明人 方国伟 周晓椟 王淑一 徐建成 (74)专利代理机构 福州智理专利代理有限公司 35208 代理人 丁秀丽 (54) 发明名称 利用荧光定量 PCR 技术检测 PML-RAR 融合 基因相对表达量的检测试剂盒。
2、 (57) 摘要 本发明涉及一种利用荧光定量 PCR 技术检 测 PML-RAR 融合基因相对表达量的检测试剂 盒, 它包括下列份数比的物质 : 红细胞裂解液、 TRIzol、 氯仿、 无水乙醇、 反转录 PCR 试剂、 检测体 系 PCR 反应液、 阳性对照品和阴性对照品 ; 本发明 该试剂盒具有精度高, 结果便于判读、 扩增效率和 速率均达到最佳等优点, 省去了繁琐的条件摸索 环节, 大大提升了实验效率。 该试剂盒经测试特异 性好, 灵敏度高, 操作简便。有助于临床上急性早 幼粒细胞白血病 (APL) 患者体内 PML-RAR(L 型 /S 型 ) 融合基因的微量残留检测, 对于及时干预 。
3、治疗避免血液学复发、 调整治疗方案、 评价治疗效 果、 预测预后、 预防临床复发都具有重要意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 3 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种利用荧光定量 PCR 技术检测 PML-RAR 融合基因相对表达量的检测试剂盒, 其 特征在于 : 它包括下列份数比的物质 : 10 红细胞裂解液 50 人份, 50ml, 、 TRIzol50 人份, 50ml、 氯仿 50 人份, 30ml、 无水乙醇 5。
4、0 人份, 40ml、 反转录 PCR 试剂 50 人份, 0.8ml、 检测体 系 PCR 反应液 50 人份, 1.15ml、 阳性对照品和阴性对照品。 2. 根据权利要求要求 1 所述的利用荧光定量 PCR 技术检测 PML-RAR 融合基因 相对表达量的检测试剂盒, 其特征在于 : 所述的 10 红细胞裂解液为 : NH4CL 82mg/ml、 NAHCO38.4mg/ml、 EDTA-NA2 3.72mg/ml、 DEPC-ddH2O 定容至配制体积。 3. 根据权利要求要求 1 所述的利用荧光定量 PCR 技术检测 PML-RAR 融合基因相对 表达量的检测试剂盒, 其特征在于 :。
5、 所述的反转录 PCR 试剂包括 : 5RT buffer 120l、 RT Enzyme 25l、 Random Primer 30l。 4. 根据权利要求要求 1 所述的利用荧光定量 PCR 技术检测 PML-RAR 融合基因 相对表达量的检测试剂盒, 其特征在于 : 所述的检测体系 PCR 反应液包括 : Taq 聚合酶 1l, dNTPs4l, Tris-HCl buffer 12.5l, 镁离子 2l, 检测目的基因用上游引物为 : L-F0.8l 或 S-F0.8l, 下游引物为 L/S-R0.8l, 目的基因探针为 LS-Probe 0.4l, 检测内参基因 Abl 用引物为 a。
6、bl-F0.8l, abl-R 0.8l, 内参基因探针为 abl-Probe 0.4l ; 其中, 检测目的基因用上下游引物和目的基因探针的比例优选为 : S-F : L/S-R : LS-Probe 的摩尔比为 2 ; 2 ; 1 ; 检测内参基因 abl 用上下游引物和内参基因探针的比例优选为 : abl-F : abl-R : abl-Probe 的摩尔比为 2 : 2 : 1 ; 所使用的扩增 PML-RARL 型 /S 型融合基因的引物和探针分别为 : L-F:AGGTCTTCCTGCCCAACAG S-F:TGCGCCTGCAGGACCTCAG L/S-R:AAGGCTTGTAG。
7、ATGCGGGGTA L/S-Probe:FAM-CAGAGCAGCAGTTCTGAAGA-TAMRA 所使用的扩增 abl 内参基因的引物和探针, 分别为 : abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。 5.根据权利要求要求1所述的利用荧光定量PCR技术检测PML-RAR融合基因相对表 达量的检测试剂盒, 其特征在于 : 所述阳性对照品分别为含有PML-RARL型/S型融合基因 的溶液 ; 所述阴性对照品为无 PML-RAR(L 型 /S 型 。
8、) 融合基因的溶液。 6.根据专利要求1-5所述的利用荧光定量PCR技术检测PML-RAR融合基因相对表达 量的检测试剂盒, 其特征还在于 : 它作为检测急性早幼粒细胞白血病患者体内 PML-RARL 型或 S 型融合基因微量残留。 权 利 要 求 书 CN 102719540 A 2 1/6 页 3 利用荧光定量 PCR 技术检测 PML-RAR 融合基因相对表达 量的检测试剂盒 所属技术领域 0001 本发明涉及一种临床检验用途的基因相对表达量的检测试剂盒, 采用 Taqman 探针实时荧光定量 PCR 技术, 用于检测人类急性早幼粒细胞白血病 (APL) 患者体内的 PML-RAR(L 。
9、型 /S 型 ) 融合基因表达水平, 同时对高危人群进行较为准确的筛查。该试剂 盒可有效的节约检测时间, 提高检测精度。 技术背景 0002 急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocyticleukemia, APL)是急性髓系白血病 的一种特殊类型, 其特异性标志为染色体 t(15 ; 17)(q22 ; q21) 易位, 形成 PML-RAR 融合 基因。 约85以上的APL患者存在特异性染色体易位t(15 ; 17)(q22 ; q21), 形成PML-RAR 融合基因。约 95的 PML-RAR 基因存在细胞内, 是判断 APL 预后、 复发的重要依据, 大规 模临床调研表。
10、明分子学复发的患者在早期给予干预治疗可获得较好的预后。 0003 PML-RAR 融合基因具有异质性, 在其形成过程中, RAR 上的断裂点总是位于第 2个内含子内, 但是PML上的断裂点存在很多变异, 主要集中在3个断裂点丛集区(bcr) : 断 裂点 bcrl 在 PML 第 6 个内含子内, 形成长型转录本 (L) ; 断裂点 bcr2 在 PML 第 6 个外显子 内, 产生可变型转录本 (V) ; 断裂点 bcr3 在 PML 第 3 个内含子内, 产生短型转录本 (S)。其 中以长型 (L 型 ) 和短型 (S 型 ) 异构体为主, 可变型 (V 型 ) 最少见。通过对 PML-R。
11、AR 融 合基因亚型的长期临床观测, L 型 APL 患者的预后优于 S 型, 因此跟踪检测 PML-RAR 融合 基因可早期发现分子复发, 及时干预治疗, 避免血液学复发, 并根据 PML-RAR 融合基因结 果调整治疗方案, 这对评价治疗效果、 预测预后、 预防临床复发都具有重要意义。 0004 目前临床上已经将 PML-RAR 融合基因作为动态评估患者病情及预后的手段之 一。常用的检测技术有荧光原位杂交技术 (FISH)、 RT-PCR、 RQ-PCR 等方法。FISH 法尽管结 果较为直观, 但是试验过程繁琐, 涉及试剂种类繁多, 费时费力, 且结果需经验丰富的专业 人士来判读, 结果。
12、判读存在较大的主观性。而单纯 RT-PCR 法则为终点定量, 无法对起始模 板量进行准确的估算。此外, 由于砷剂及全反式维甲酸的应用, APL 治疗效果得到很大的提 高, 微小残留病是其复发的主要原因, 因而急需一种高敏感性、 高特异性、 高自动化程度、 污 染控制好的方法来对 PML-RAR 融合基因 mRNA 残留进行检测。 0005 RQ-PCR 采用 Taqman 探针荧光定量技术, 综合生物学、 酶学和荧光化学于一体, 从 扩增到结果分析均在 PCR 反应管封闭状态下进行, 解决了 PCR 产物污染而导致假阳性的问 题, 同 时也提高了敏感度, 其结果用拷贝数表示, 实现了对 PCR。
13、 产物的准确定量, 易于统一 标准, 与定性 PCR 技术相比, 具有特异度好, 灵敏度高, 线性关系好, 操作简单, 自动化程度 高、 防污染, 有较大的线性范围等优点。能够满足 PML-RAR 融合基因 mRNA 微量残留的检 测, 被认为是目前首选检测方法, 用于评价治疗效果、 预测预后。实时荧光定量 PCR 中常见 的方法有 SYBR GreenI 染料法, 双探针杂交法以及 Taqman 技术等。其中 SYBR GreenI 由于 是非饱和染料, 特异性不如双探针杂交法以及 Taqman 法, 必须通过观察溶解曲线来判断其 说 明 书 CN 102719540 A 3 2/6 页 4。
14、 特异性 ; 而双探针法杂交法成本又较为昂贵。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种扩增效率和速率均最佳的利用荧光定量 PCR 技术检 测 PML-RAR 融合基因相对表达量的检测试剂盒。 0007 本发明的技术方案如下 : 其特征在于 : 它包括下列份数比的物质 : 红细胞裂解液 (50 人份, 50ml) 、 TRIzol(Invitrogen 公司) (50 人份, 50ml) 、 氯仿 (50 人份, 30ml) 、 无水 乙醇 (50 人份, 40ml) 、 反转录 PCR 试剂 (50 人份, 0.8ml) 、 检测体系 PCR 反应液 (50 人份, 1.15ml) 、 。
15、阳性对照品和阴性对照品 ; 0008 其中反转录 PCR 试剂包括 : 5RT buffer(120l)、 RT Enzyme(25l) 、 Random Primer(30l) 。 0009 检 测 体 系 PCR 反 应 液 包 括 :Taq 聚 合 酶 (1l), dNTPs(4l), Tris-HCl buffer(12.5l), 镁离子 (2l), 检测目的基因用上游引物为 : L-F(0.8l)或 S-F (0.8l) , 下游引物为 L/S-R(0.8l) (L-R 与 S-R 相同, 故 L/S-R 既可以表示为 L-R 也可 以表示为 S-R) , 目的基因探针为 LS-Pr。
16、obe(0.4l) , 检测内参基因 Abl 用引物为 abl-F (0.8l) , abl-R(0.8l) , 内参基因探针为 abl-Probe(0.4l) 。其中, 检测目的基因用 上下游引物和目的基因探针的比例优选为 : S-F : L/S-R : LS-Probe 的摩尔比为 2 ; 2 ; 1。 0010 检测内参基因 Abl 用上下游引物和内参基因探针的比例优选为 : abl-F : abl-R : abl-Probe 的摩尔比为 2 : 2 : 1。 0011 L-F:AGGTCTTCCTGCCCAACAG 0012 S-F:TGCGCCTGCAGGACCTCAG 0013 L。
17、/S-R:AAGGCTTGTAGATGCGGGGTA 0014 L/S-Probe:FAM-CAGAGCAGCAGTTCTGAAGA-TAMRA 0015 abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG 0016 abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC 0017 abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA 0018 进一步地, 所述阳性对照品分别为含有PML-RAR(L型或者S型, 或者同时包含有 L 型和 S 型 ; 上述几种类型合并简写成 : L 型 /S 型 ) 融合基因的溶液 ; 所述阴性对照品为无 PML-RAR(L 型 /。
18、S 型 ) 融合基因的溶液。 0019 本发明的有益效果 : 本发明将实时荧光 PCR 技术结合采用 Tapman 探针, 利用双标 准曲线的方法, 分别构建内参基因 abl 和目的基因 PML-RAR(L 型 /S 型 ) 融合基因的定量 标准曲线, 检测受测者体内的 PML-RAR(L 型 /S 型 ) 融合基因相对于内参基因的表达水 平。相比于以往的免疫组化方法和现今流行的 CT 法, 该试剂盒具有精度高, 结果便于 判读、 扩增效率和速率均达到最佳等优点。 加之该试剂盒将反应体系所需的引物、 探针进行 合理配比和优化, 使实验条件达到最佳, 从而省去了繁琐的条件摸索环节, 大大提升了实。
19、验 效率。该试剂盒经测试特异性好, 灵敏度高, 操作简便。有助于临床上急性早幼粒细胞白血 病 (APL) 患者体内 PML-RAR(L 型 /S 型 ) 融合基因的微量残留检测, 对于及时干预治疗避 免血液学复发、 调整治疗方案、 评价治疗效果、 预测预后、 预防临床复发都具有重要意义。 本 试剂盒用于辅助临床上人类急性早幼粒细胞白血病 (APL) 早期预防、 早期诊断的辅助性指 说 明 书 CN 102719540 A 4 3/6 页 5 标 ; 还可对高危人群进行较为准确的筛查。 附图说明 : 0020 图 1 是应用本发明试剂盒检测 PML-RARL 型为阳性的结果图。 0021 图 2。
20、 是应用本发明试剂盒检测 PML-RARL 型为阴性的结果图。 0022 图 3 是应用本发明试剂盒检测 PML-RARS 型为阳性的结果图。 0023 图 4 是应用本发明试剂盒检测 PML-RARS 型为阴性的结果图。 具体实施方式 0024 实施例 1 0025 本发明试剂盒包括 : 它包括下列份数比的物质 : 红细胞裂解液 (50 人份, 50ml, 10) 、 TRIzol (50 人份, 50ml) 、 氯仿 (50 人份, 30ml) 、 无水乙醇 (50 人份, 40ml) 、 反转录 PCR 试剂 (50人份, 0.8ml) 、 检测体系PCR反应液 (50人份, 1.15m。
21、l) 、 阳性对照品和阴性对照品 ; 0026 其中 10 红细胞裂解液 (NH4CL 82mg/ml、 NAHCO3 8.4mg/ml、 EDTA-NA2 3.72mg/ ml、 DEPC-ddH2O 定容至配制体积) 。 0027 反转录PCR试剂包括:5RT buffer (120l)、 RT Enzyme (25l) 、 Random Primer (30l) 。 0028 检 测 体 系 PCR 反 应 液 包 括 :Taq 聚 合 酶 (1l), dNTPs(4l), Tris-HCl buffer(12.5l), 镁 离子 (2l), 检测目的基因用上游引物为 : L-F(0.8。
22、l)或 S-F (0.8l) , 下游引物为 L/S-R(0.8l) (L-R 与 S-R 相同, 故 L/S-R 既可以表示为 L-R 也可 以表示为 S-R) , 目的基因探针为 LS-Probe(0.4l) , 检测内参基因 Abl 用引物为 abl-F (0.8l) , abl-R(0.8l) , 内参基因探针为 abl-Probe(0.4l) 。其中, 检测目的基因用 上下游引物和目的基因探针的比例优选为 : S-F : L/S-R : LS-Probe 的摩尔比为 2 ; 2 ; 1。 0029 检测内参基因 Abl 用上下游引物和内参基因探针的比例优选为 : abl-F : ab。
23、l-R : abl-Probe 的摩尔比为 2 : 2 : 1。 0030 其中 : L-F:AGGTCTTCCTGCCCAACAG ; 0031 S-F:TGCGCCTGCAGGACCTCAG ; 0032 L/S-R:AAGGCTTGTAGATGCGGGGTA ; 0033 L/S-Probe:FAM-CAGAGCAGCAGTTCTGAAGA-TAMRA ; 0034 abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG ; 0035 abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC ; 0036 abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA 00。
24、37 所述阳性对照品分别为含有PML-RAR(L型/S型)融合基因组溶液 ; 所述阴性对 照品为不含 PML-RAR(L 型 /S 型 ) 融合基因组溶液。 0038 实施例 2 0039 本方法的操作流程 : 0040 (1) 抽提血液中的组织 RNA: 在洁净的 1.5ml 的离心管中加入 1ml 红细胞裂解液, 取抗凝血 0.5ml 混匀。室温静置 10min ; 5000rpm 离心 5min, 弃上清, 收集底部的细胞 ; 再次 加入 0.5ml 红细胞裂解液, 5000rpm 离心 5min, 弃上清, 收集底部的细胞 ; 向细胞中加入 1ml 说 明 书 CN 102719540。
25、 A 5 4/6 页 6 TRIzol, 反复吹打直至沉淀完全溶解, 室温静止5min ; 加入0.2ml氯仿, 震荡均匀 ; 14000rpm 4离心 10min, 吸取上清层转移至另一新的离心管中 ; 加入等体积的异丙醇, 上下充分混 匀, 室温静置 10min ; 14000rpm 4离心 10min, 弃上清, 加入 75% 乙醇 1ml, 轻轻上下颠倒洗 涤管壁 ; 14000rpm 4离心 5min, 弃乙醇 ; 室温干燥 10-15min, 加入 20lRNase-free 水溶 解沉淀。 0041 (2) 采用反转录 PCR 试剂将 RNA 反转为 cDNA。 0042 (3)。
26、 试剂配置 : 按检测人份数配置检测体系 PCR 反应液各 Xl, 每人份 23l 分 装 : 0043 X=23l 反应液 (8 份内参 (标准曲线) +8 份目的基因 (标准曲线) +n 份标本 +1 份阳性对照 +1 份阴性对照 +1 份空白对照) ; n 0 0044 (4) 加样 : 向检测体系 PCR 反应液中加入 2l 的 cDNA ; 阳性对照和阴性对照直接 加 2 l 阳性对照品和阴性对照品 ; 空白对照加 2l 生理盐水或不加任何物质。 0045 (5)检测 : 检测在实时荧光 PCR 仪上进行, 可用仪器包括 ABI7300, 7500(美国 Applied Biosys。
27、tems 公司) 等。反应条件 : 95预变性 1min ; 95 15s, 58 35sec 40 个 循环, 荧光信号于 58 35sec 时采集。 0046 (6) 结果判断 : 将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上, 系统根据标准曲线和 CT 值自动计算出拷贝数。 0047 1) 内参阳性时, 检测结果才认为有效 ; 0048 2) 阳性判断标准 : , Ct35, 为阳性 ; 35 Ct 38, 为疑似阳性, 需要再次验证 ; Ct 38, 为阴性。 0049 实施例 3 0050 采用本发明检测试剂盒检测临床标本 0051 取送检的急性早幼粒细胞白血病 (APL) 患者抗凝血标本。
28、共 80 例, 按实施例 2 所述 方法提取基因组 RNA、 配制试剂并检测。 0052 取 2l 的每份标本加入检测体系 PCR 反应液中。同时做阳性, 阴性, 空白对照, 内 参基因 / 目的基因的标准曲线各一份。一台 96 孔的荧光 PCR 仪可同时检测 38 份样品, 每 个样本重复检测 2 次, 一份阳性对照, 一份阴性对照和一份空白对照。检测时间仅为 100 分 钟。 0053 实验结果与特检实验室的报告结果相比较, 确定样品检测的准确率。部分阳性结 果如下表 : 0054 说 明 书 CN 102719540 A 6 5/6 页 7 0055 0056 表 1 为本次实验结果和 。
29、PCR 实验室结果的对比, 从上表可以看出, 60 例样本中 59 例与特检实验室的检测结果相符, 仅 1 例不符, 尤其是微量残留检测结果, 与特检实验室的 结果完全吻合, 整体符合率达到 98.33%。说明本发明检测试剂盒与特检利用常规荧光定量 方法相比, 不但检测结果准确性高, 而且缩短了检测时间, 提高了检测效率。 0057 实施例 4 临床样品检测 0058 取待检的临床样品 4 份, 按实施例 2 所述方法提取基因组、 配制试剂并检测。 0059 取 2l 的每份样品加入检测体系 PCR 反应液中。同时做阳性, 阴性, 空白对照各 一份。用荧光 PCR 仪检测, 时间为 100 分。
30、钟。 0060 样品 1 的检测结果图如图 1 所示, 内参基因 abl 的扩增信号显示被检样本基因组 提取成功, 检测结果有效, 样品 1 的 PML-RARL 型 CT 值 38 之后无扩增信号, 所以样品 2 为 PML-RAR 融合基因 L 阴性。 0062 样品 3 的检测结果图如图 3 所示, 内参基因 abl 的扩增信号显示被检样本基因组 说 明 书 CN 102719540 A 7 6/6 页 8 提取成功, 检测结果有效, 样品 1 的 PML-RARS 型 CT 值 38 之后无扩增信号, 所以样品 4 为 PML-RAR 融合基因 S 阴性。 说 明 书 CN 102719540 A 8 1/3 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 102719540 A 9 2/3 页 10 0003 序 列 表 CN 102719540 A 10 3/3 页 11 序 列 表 CN 102719540 A 11 1/2 页 12 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102719540 A 12 2/2 页 13 图 4 说 明 书 附 图 CN 102719540 A 13 。