牙齿相关干细胞的新用途.pdf

牙齿相关干细胞的新用途。提供了牙齿相关干细胞在制备用于预防或治疗牙齿相关疾病、免疫性疾病、自身免疫性疾病、与T淋巴细胞异常活化或升高相关的疾病、红斑狼疮或系统性红斑狼疮的产品，或者制备用于修复牙齿相关组织的产品中的新用途。还提供了包含牙齿相关干细胞的组合物以及使用牙齿相关干细胞预防或治疗疾病的方法。

权利要求书
1.  牙齿相关干细胞在制备用于预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情的产品中的用途，或者在制备用于牙齿相关组织形成或修复的产品中的用途。

2.  根据权利要求1的用途，其中所述的牙齿相关干细胞选自：牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、和根尖牙乳头干细胞。

3.  根据权利要求1或2的用途，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物，例如所述的牙齿相关干细胞来自选自以下的哺乳动物：人、猪(例如五指山小型猪、贵州香猪)、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊、山羊。

4.  根据权利要求1至3任一项的用途，其中所述的与牙齿相关的疾病或病情或者牙齿相关组织形成或修复选自：牙周病、牙周炎、牙齿缺损、牙齿组织缺损、牙齿缺损修复、牙齿相关组织缺损和修复、牙齿相关组织替代物再生、等等。

5.  牙齿相关干细胞在制备用于预防或治疗免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、红斑狼疮、或者系统性红斑狼疮的产品中的用途。

6.  根据权利要求5的用途，其中所述的牙齿相关干细胞选自：牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、和根尖牙乳头干细胞。

7.  一种组合物，其包含有效量的牙齿相关干细胞和任选的药学可接受的载体。

8.  根据权利要求7的组合物，其中所述的牙齿相关干细胞选自：牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、和根尖牙乳头干细胞。

9.  根据权利要求7或8的组合物，其是用于预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情，或者用于牙齿相关组织形成或修复，或者用于预防或治疗免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、红斑狼疮、或者系统性红斑狼疮。

说明书牙齿相关干细胞的新用途
本申请为申请号为201080005266.5、发明名称为“牙齿相关干细胞的新用途”的发明申请的分案申请。 
发明领域
本发明涉及牙齿相关干细胞的新用途。具体地，本发明涉及牙齿相关干细胞在制备用于预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情的产品中的用途，或者在制备用于牙齿相关组织形成或修复的产品中的用途；还涉及牙齿相关干细胞在制备用于预防或治疗免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、红斑狼疮、或者系统性红斑狼疮的产品中的用途；还涉及根据上述用途的治疗方法；还涉及包含牙齿相关干细胞的组合物。 
背景技术
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的原始细胞，可分为胚胎干细胞和成体干细胞。在成体组织及器官中普遍存在着特异的成体干细胞，目前已经发现的例如来源于人的牙齿相关干细胞都是来源于中胚层的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)，包括牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)、脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)、牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)和根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla，SCAP)(1-4，即指文献1至4，下同)，它们可以来源于多种动物(例如哺乳动物，例如人)。研究表明牙齿相关干细胞具有很高的增殖能力和多向分化潜能，能够向成骨细胞、脂肪细胞、神经样细胞分化。当把牙齿相关干细胞和三维支架材料的复合物植入到裸鼠皮下时，能够产生自体牙髓牙本质复合体样结构和牙骨质牙周膜复合体样结构(1,3)。目前在自体小型猪模型上已经应用PDLSCs和SCAP成功再生出生物牙根(4)。目前国际上干细胞研究焦点之一集中在建立各种组织成体干细胞库，进行干细 胞的临床试验研究。 
根据WHO(2003)统计数字表明，牙齿相关疾病所波及的人群范围已远远超过其它任何一种疾病。目前，全世界每年用于牙齿疾病的治疗费用已超过200亿美元。在牙齿相关疾病中，牙周病是一种全世界范围内发病率很高的细菌感染性疾病，最终导致牙齿支持组织丧失和牙齿缺失，并能引起一系列的全身系统性疾病(13)；而牙齿缺失可对人体消化系统和全身健康造成严重的影响，同时也会使患者产生不良的社会心理影响。但目前对牙周病及牙齿组织缺损没有好的药物或治疗方法进行治疗或修复；有关牙齿缺失的治疗主要仍是采用人工材料制作牙齿的替代物。 
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是以多脏器受累和血中存在多种抗体为特征的自身免疫病，常规的免疫抑制或免疫调节治疗可使多数患者的生存期延长，生活质量得到改善。1996年意大利学者Marmont首先报道用自体骨髓移植治疗重症红斑狼疮取得成功后,国内外迅速开展了自体外周血干细胞移植和自体骨髓移植治疗重症SLE等多种难治性免疫病，取得了较好的疗效。造血干细胞移植能使部分患者达到病情控制，但其费用高、并发症多，病情复发率高达40%-50%，不能被常规使用；并且，移植后虽然部分患者有可能达到长期缓解，但均不能彻底根治自身免疫性疾病，部分患者存在复发的问题。 
因此，目前仍然需要可有效治疗某些牙齿相关疾病和某些免疫性疾病的新颖方法。 
发明内容
本发明的目的是提供有效治疗某些牙齿相关疾病和某些免疫性疾病的新颖方法。本发明人在研究中现出人意料地发现牙齿相关干细胞例如牙周膜干细胞(PDLSCs)不但在自体的牙齿中使缺损的牙齿组织再生，而且能在异体缺损的牙齿组织使牙齿组织再生，同时PDLSCs还对异常升高的T淋巴细胞有抑制作用。本发明基于上述研究结果得以完成。 
发明概述
本发明首先涉及PDLSCs在制备用于预防或治疗牙周病，牙齿缺损修复的产品中用途。 
本发明还涉及PDLSCs在制备用于预防或治疗与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或症状的产品中用途。 
本发明还涉及一种预防或治疗牙周病，修复缺损牙齿组织的方法，其包括给予需预防或治疗牙周病或需修复缺损牙齿组织的宿主以有效预防或治疗量或修复缺损牙齿组织量的PDLSCs。 
本发明涉及一种预防或治疗与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或症状的方法，其包括给予T淋巴细胞异常升高的宿主预防或治疗有效量的PDLSCs。 
发明详述
更详细地，本发明提供了以下的各个方面以及各个方面的具体项。 
本发明第一方面提供了牙齿相关干细胞在制备用于预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情的产品中的用途，或者在制备用于牙齿相关组织形成或修复的产品中的用途。 
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的牙齿相关干细胞选自：牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、和根尖牙乳头干细胞。 
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物。在一个实施方案中，所述的牙齿相关干细胞来自选自以下的哺乳动物：人、猪(例如五指山小型猪、贵州香猪)、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊、山羊。 
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物，并且选自：牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)、脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)、牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)和根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla，SCAP)。 
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的与牙齿相关的疾病或病情或者牙齿相关组织形成或修复选自：牙周病、牙周炎、牙齿缺损、牙齿组织缺损、牙齿缺损修复、牙齿相关组织缺损和修复、牙齿相关组织替代物再生、等等。 
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的牙齿相关干细胞用于自体或者异体的牙齿相关的疾病或病情，或者用于自体或异体的牙齿相关组织形成或修复。 
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的牙齿相关组织包括但不限于牙齿、牙根、牙髓、牙龈等等，以及其它与牙齿内部、牙齿表层、 牙齿表面或者牙齿周围相关的组织。 
本发明第一方面及其各子项的特征和优点同样适用于本发明其它任一方面及其各子项。 
本发明第二方面提供了牙齿相关干细胞在制备用于预防或治疗免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、红斑狼疮、或者系统性红斑狼疮的产品中的用途。 
根据本发明第二方面任一项的用途，其中所述的牙齿相关干细胞选自：牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、和根尖牙乳头干细胞。 
根据本发明第二方面任一项的用途，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物。在一个实施方案中，所述的牙齿相关干细胞来自选自以下的哺乳动物：人、猪(例如五指山小型猪、贵州香猪)、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊、山羊。 
根据本发明第二方面任一项的用途，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物，并且选自：牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)、脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)、牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)和根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla，SCAP)。 
根据本发明第二方面任一项的用途，其中所述的牙齿相关干细胞用于自体或者异体的免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、红斑狼疮、或者系统性红斑狼疮。 
本发明第二方面及其各子项的特征和优点同样适用于本发明其它任一方面及其各子项。 
本发明第三方面提供了预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情的方法，或者形成或修复牙齿相关组织的方法，该方法包括给有需要预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情的宿主施用有效量的牙齿相关干细胞，或者该方法包括给有需要形成或修复牙齿相关组织的宿主施用有效量的牙齿相关干细胞。 
根据本发明第三方面任一项的方法，其中所述的牙齿相关干细胞选自：牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、和根尖牙乳头 干细胞。 
根据本发明第三方面任一项的方法，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物。在一个实施方案中，所述的牙齿相关干细胞来自选自以下的哺乳动物：人、猪(例如五指山小型猪、贵州香猪)、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊、山羊。 
根据本发明第三方面任一项的方法，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物，并且选自：牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)、脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)、牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)和根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla，SCAP)。 
根据本发明第三方面任一项的方法，其中所述的与牙齿相关的疾病或病情或者牙齿相关组织形成或修复选自：牙周病、牙周炎、牙齿缺损、牙齿组织缺损、牙齿缺损修复、牙齿相关组织缺损和修复、牙齿相关组织替代物再生、等等。 
根据本发明第三方面任一项的方法，其中所述的牙齿相关干细胞用于自体或者异体的牙齿相关的疾病或病情，或者用于自体或异体的牙齿相关组织形成或修复。 
根据本发明第三方面任一项的方法，其中所述的牙齿相关组织包括但不限于牙齿、牙根、牙髓、牙龈等等，以及其它与牙齿内部、牙齿表层、牙齿表面或者牙齿周围相关的组织。 
根据本发明第三方面任一项的方法，其中所述的宿主是哺乳动物。在一个实施方案中，所述的宿主是选自以下的哺乳动物：人、猪(例如五指山小型猪、贵州香猪)、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊、山羊。 
在本发明第三方面任一项方法的一个实施方案中，其包括以下步骤： 
(a)采集人牙周膜； 
(b)培养hPDLSCs； 
(c)任选地冷冻保存hPDLSCs； 
(d)任选地融化hPDLSCs，以及任选地对hPDLSCs检查支原体、细菌、集落形成效率、间质干细胞标记模式和核型分析； 
(e)制备hPDLSCs片； 
(f)将HA/TCP置于容纳有hPDLSCs片的器皿中； 
(j)在任选的牙周初始治疗后，将hPDLSCs片与HA/TCP植入到牙周损伤缺陷处； 
(k)任选的进行临床和放射照相评价、血液学和免疫学评价。 
本发明第三方面及其各子项的特征和优点同样适用于本发明其它任一方面及其各子项。 
本发明第四方面提供了预防或治疗免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、红斑狼疮、或者系统性红斑狼疮的方法，该方法包括给有此需要的宿主施用有效量的牙齿相关干细胞。 
根据本发明第四方面任一项的方法，其中所述的牙齿相关干细胞选自：牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、和根尖牙乳头干细胞。 
根据本发明第四方面任一项的方法，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物。在一个实施方案中，所述的牙齿相关干细胞来自选自以下的哺乳动物：人、猪(例如五指山小型猪、贵州香猪)、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊、山羊。 
根据本发明第四方面任一项的方法，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物，并且选自：牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)、脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)、牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)和根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla，SCAP)。 
根据本发明第四方面任一项的方法，其中所述的牙齿相关干细胞用于自体或者异体的免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、红斑狼疮、或者系统性红斑狼疮。 
根据本发明第四方面任一项的方法，其中所述的宿主是哺乳动物。在一个实施方案中，所述的宿主是选自以下的哺乳动物：人、猪(例如五指山小型猪、贵州香猪)、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊、山羊。 
本发明第四方面及其各子项的特征和优点同样适用于本发明其它任一方面及其各子项。 
本发明第五方面提供了一种组合物，其包含有效量的牙齿相关干细胞和任选的药学可接受的载体。 
根据本发明第五方面任一项的组合物，其中所述的牙齿相关干细胞选自：牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、和根尖牙乳头干细胞。 
根据本发明第五方面任一项的组合物，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物。在一个实施方案中，所述的牙齿相关干细胞来自选自以下的哺乳动物：人、猪(例如五指山小型猪、贵州香猪)、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊、山羊。 
根据本发明第五方面任一项的组合物，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物，并且选自：牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)、脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)、牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)和根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla，SCAP)。 
根据本发明第五方面任一项的组合物，其是用于预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情，或者用于牙齿相关组织形成或修复，或者用于预防或治疗免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、红斑狼疮、或者系统性红斑狼疮。 
根据本发明第五方面任一项的组合物，其中所述的有效量是可以有效地用于预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情的剂量，或者是要以有效地用于牙齿相关组织形成或修复的剂量，或者是要以有效地用于预防或治疗免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、红斑狼疮、或者系统性红斑狼疮的剂量。 
本发明第五方面及其各子项的特征和优点同样适用于本发明其它任一方面及其各子项。 
根据本发明上下文的详细记载，本发明令人满意地实现上上述的各个方面及其各子项。 
下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。 
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此 外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。 
本发明人在研究中现出人意料地发现PDLSCs等牙齿相关的干细胞不但在自体的牙齿中使缺损的牙齿组织再生，而且能在异体缺损的牙齿组织使牙齿组织再生。本发明基于上述研究结果得以完成。因此，本发明涉及牙齿相关干细胞例如PDLSCs在制备用于预防或治疗牙周病，牙齿缺损修复的产品中用途(例如图8所示)；还涉及一种预防或治疗牙周病，修复缺损牙齿组织的方法，其包括给予需预防或治疗牙周病或需修复缺损牙齿组织的宿主以有效预防或治疗量或修复缺损牙齿组织量的牙齿相关干细胞例如PDLSCs。 
此外，本发明提出生物牙根再生的新理念；利用自体异体SCAP/DPSCs和PDLSCs再生出了具有生物学功能的生物牙根，在新形成的功能性生物牙根上再进行冠的修复，恢复患者的咀嚼功能(例如图10所示)；提供生物牙根再生的具体实施方法，为进一步对生物牙根再生的机理进行深入研究及生物牙根的商品化提供依据。因此，本发明涉及生物牙根再生的新理念，并涉及SCAP，DPSCs，PDLSCs等牙齿相关的干细胞在生物牙根再生中的用途。本发明还涉及生物牙根再生的具体实施办法，其中包括牙周膜干细胞膜片的制备及其所需最佳细胞数及最佳生长时间。 
再者，本发明涉及牙齿相关干细胞例如PDLSCs在制备用于预防或治疗与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或症状的产品中用途。本发明还涉及一种预防或治疗与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或症状的方法，其包括给予T淋巴细胞异常升高的宿主预防或治疗有效量的牙齿相关干细胞例如PDLSCs。本发明进一步涉及牙齿相关干细胞例如SHED在预防或治疗系统性红斑狼疮病等自身免疫系统病中用途(例如图11所示)。 
根据本发明，术语“牙周病”包括但不限于牙周炎。 
根据本发明，术语“缺损牙齿组织”包括但不限于宿主牙齿的各种缺损情况，如各种原因引起的牙齿脱落。 
根据本发明，术语“宿主”通常指哺乳动物，包括但不限于人，猪，牛，马等。在一个实施方案中，术语“宿主”是指人、猪(例如五指山小型 猪、贵州香猪)、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊、山羊。 
根据本发明，术语“产品”是指适于PDLSCs应用的各种形式。根据本发明，术语“产品”还指适于牙齿相关干细胞应用的各种形式，例如组合物、药物组合物等。 
根据本发明，术语“与牙齿相关的疾病或病情”是指本文所述宿主罹患或者表现的疾病、病情、体症、身体状态等，这些疾病、病情、体症、身体状态等与牙齿相关。 
根据本发明，术语“牙齿相关组织形成或修复”或者术语“牙齿相关组织的形成或修复”或者“形成或修复牙齿相关组织”等，它们具有相同或近似的含义，并且通常是指本文所述宿主的牙齿相关组织进行形成、修复、生成、再生、培养等处理或操作，或者对牙齿相关组织异常(例如缺损)进行形成、修复、生成、再生、培养等处理或操作。 
根据本发明，术语“组合物”是具有本领域技术人员通常理解的含义，并且通常是指可接或间接(例如临用前稀释)用于临床使用的形式，例如剂型、药物剂型、给药形式、等。在临床应用领域或者药物领域，术语“组合物”还通常与“药物组合物”具有同等含义。 
可改变本发明组合物或药物组合物中牙齿相关干细胞的实际剂量水平，以便所得的干细胞量能有效针对具体宿主、患者在特定组合物及其组成以及相应给药方式的情况下得到所需的治疗或预防反应。剂量水平须根据具体干细胞的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度、疾病或病情的治疗进程、形成和修复(以及生成、再生、培养等)处理或操作的进程、以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，干细胞的剂量以及施用时间从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。因此，就本发明而言，本领域技术人员在本发明详细公开的信息的教导下，可以根据例如但不限于上述的具体情况来确定在具体情况下所适用的具体剂量，而无需要作具体限定。特别是，可以参考本发明实施例部分中所用的具体量来确定任一情况下的使用量，例如在本发明下文使用了具体剂量的五指山小型猪PDLSCs，本领域技术人员可根据上述剂量并结合本领域公知技术教导将该剂量换算为人用条件下的剂量。 
本发明牙齿相关干细胞可以单独(即以原样形式)或以药物组合物的形式给药。本发明药物组合物可根据给药途径配成各种适宜的剂型。使用 一种或多种生理学上可接受的载体，包含赋形剂和助剂，它们有利于将牙齿相关干细胞加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂形式取决于所选择的给药途径，可以按照本领域熟知的常识进行制造。在本发明的一个实施方案中，所述牙齿相关干细胞存在于细胞相容的介质(例如，生理盐水如0.9%生理盐水，等等)中。在本发明的一个实施方案中，所述牙齿相关干细胞存在于细胞相容的介质中，并且在低温下保存，例如在冷藏、冷冻等条件下保存，并且可任选在在临用前复溶成适用根据本发明精神而施用的形式。 
附图说明
图1.人PDLSCs免疫分子的表达：应用流式细胞术检测fPDLSCs和cPDLSCs相关免疫分子的表达。HLA-I,HLA-ΠDR,CD80和CD86的表达情况如图所示：fPDLSCs(76.2%±5.8%,n=5)和cPDLSCs(78.5%±6.4%,n=5)表达HLA-I，但是不表达HLA-ΠDR和共刺激分子CD80、CD86。 
图2.PDLSCs抑制T淋巴细胞增殖：(a)fPDLSCs/cPDLSC不会引起同种异体T淋巴细胞增殖。(b)fPDLSCs/cPDLSC剂量依赖性地抑制丝裂原PHA引起的T淋巴细胞增殖。(c)延迟加入fPDLSCs/cPDLSC也能够抑制PHA引起的T淋巴细胞增殖。(d)fPDLSCs/cPDLSC能够抑制双向混合淋巴细胞反应。 
图3.PDLSCs通过分泌PGE2抑制T淋巴细胞增殖：(a)在Transwell培养实验中，PDLSCs也能抑制T淋巴细胞增殖，提示PDLSCs分泌可溶性因子来发挥免疫抑制作用。(b)在单纯PDLSCs培养上清和MLR上清中都存在TGF-β1，但是两者之间没有显著性差异。(c)PGE2的浓度在MLR中显著性升高。(d)中和实验表明抗TGF-β1抗体没有恢复T淋巴细胞增殖，PGE2抑制剂抵消了PDLSCs的免疫抑制作用,提示PGE2是介导PDLSCs免疫抑制作用的主要因子。(e,f)PDLSCs的免疫抑制作用并没有引起T淋巴细胞的凋亡(e),与单纯用PHA刺激T淋巴细胞后的凋亡率一致(f)。(g)PDLSCs引起的被抑制的T淋巴细胞用PHA或者IL-2再刺激时可以重新恢复增殖。 
图4.HGF和IL-10的测定：在单纯PDLSCs培养上清和MLR上清中都没有测到HGF和IL-10，说明这两种因子没有参与PDLSCs介导 的免疫抑制作用。 
图5.PDLSCs介导的牙周组织再生：(a)在-4w和0w,四组的临床指标之间没有显著性的差异。但是治疗后12周,自体或者同种异体PDLSCs移植组的PD,GR和AL与空白对照组和HA/TCP相比显著恢复。(b,c,d,e)CT扫描显示治疗前都有明显的牙周骨缺损，而且缺损程度相近。治疗后12周，自体PDLSCs组(h)和同种异体PDLSCs组(i)完全获得了牙周骨再生。空白对照组几乎没有骨组织再生(f),而HA/TCP组的骨缺损程度加重(g).(j,k,l,m)组织学研究发现自体或者同种异体PDLSCs组在骨缺损区有明显的新骨和牙周组织再生。但是,典型的牙周炎表现如深牙周袋、缺乏新生骨和牙周纤维在HA/TCP组和空白对照组仍然清晰可见。PD:探诊深度,GR:牙龈退缩,AL:附着丧失,D:牙本质,C:牙骨质,PDL:牙周膜,B:骨。 
图6.同种异体PDLSCs移植不会引起免疫排斥反应：(a)在如图所示的各个时间点，同种异体PDLSCs移植组的CD3+,CD4+,CD8+T淋巴细胞没有显著性差异；(b)在移植后3天，CD3+,CD4+,CD8+T淋巴细胞数目以及活化T淋巴细胞的标志物——CD40L的表达情况在四个治疗组之间没有明显差异。 
图7.移植后12w的免疫状况：在治疗后12w，CD3+,CD4+,CD8+T淋巴细胞数目以及活化T淋巴细胞的标志物——CD40L的表达情况在四个治疗组之间也没有明显差异。 
图8.描绘了本发明的一个实施例中PDLSCs介导的牙周组织再生。 
图9.描绘了在小型猪上成功再生生物牙根。 
图10.描绘了在小型猪上进行生物牙根再生获得成功。 
图11.描绘了脱落乳牙牙髓干细胞治疗系统性红斑狼疮鼠血清及肾脏组织学改变。 
图12.说明同种异体人牙周膜干细胞(hPDLSCs)用于治疗牙周病的标准操作的一个实例。 
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解,在不背离本发明的精神和范围的前提下,可以对本发明进行各种变化和修饰。 
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。 
实施例1：PDLSCs对T淋巴细胞增殖的抑制作用
材料和方法
1)、人PDLSCs
选取首都医科大学附属北京口腔医院口腔颌面外科门诊拔除的18-28岁的健康患者的正常第三磨牙，按照以往文献报道的方法分离和培养PDLSCs(3)。人体组织的利用得到首都医科大学伦理委员会的批准。为了下一步实验中应用冻存牙周膜干细胞(cryopreserved periodontal ligament stem cells，cPDLSCs)，将部分新鲜分离的牙周膜干细胞(freshly isolated periodontal ligament stem cells，fPDLSCs)冻存在液氮中3个月。3个月后，冻存细胞在37℃水浴中快速解冻、接种、常规培养。在本研究中，应用的细胞都在第2-4代。在同一实验中，应用同一代的fPDLSCs和cPDLSCs。 
2)、外周血单个核细胞
应用梯度密度离心法分离健康供者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。 
3)、抗体
本研究中应用抗人白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-I、HLA-ΠDR、CD80、CD86抗体(BD Biosciences)，抗CD3、CD4、CD8、CD40L、转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)抗体(Abcam),抗IL-10、FITC标记的抗小鼠IgG抗体(AbD Serotec)。
4)、流式细胞术
为了研究PDLSCs表面相关免疫分子的表达，将1.0×106fPDLSCs或者cPDLSCs分别与抗HLA-I、HLA-ΠDR、CD80或者CD86抗体室温下孵育1小时。经过磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗后，细胞再与FITC标记的抗小鼠IgG二抗室温下孵育30分钟。孵育结束后上流式细胞仪(BD Inmmunocytometry Systems)检测表达情况。 
5)、混合淋巴细胞反应
作为刺激细胞，5.0×104fPDLSCs或者cPDLSCs先在直线加速器下照射20Gy，然后加入等细胞量的同种异体PBMCs，在96孔板、0.2mlRPMI-1640中共同孵育5天。在结束反应前18个小时，每孔加入1μCi的3H-thymidine(3H-TdR)。18个小时后，在玻璃纤维滤纸上收集细胞，应用液体闪烁仪(PerkinElmer)计算3H-TdR掺入率。3H-TdR掺入率的结果以每分钟计数±标准差(CPM±SD)来表示。 
为了研究PDLSCs对增殖T淋巴细胞的影响以及此种影响是否具有剂量依赖性，在丝裂原促增殖实验中，以终浓度为0.5μg/mL的PHA(Sigma-Aldrich)刺激PBMCs(5.0×104)增殖，与不同剂量的自体fPDLSCs或者cPDLSCs共孵育5天(PDLSCs的量分别为1.0×104,5.0×104,2.5×105,5.0×105)。结束孵育前18小时每孔加入1μCi的3H-TdR，18小时后收集细胞并且计算3H-TdR掺入率。 
进一步研究延迟加入PDLSCs是否会影响T淋巴细胞增殖。先用终浓度为0.5μg/mL的PHA刺激PBMCs(5.0×104)增殖2天，然后加入同等剂量的fPDLSCs或者cPDLSCs再共同孵育3天。3天后测定3H-TdR掺入率。 
在证实PDLSCs能够抑制丝裂原PHA引起的T淋巴细胞增殖后，我们观察PDLSCs对双向混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，MLR)的影响。来自两个不同个体的PBMCs(5.0×104)与等量的第三方fPDLSCs或者cPDLSCs共同孵育5天。结束孵育前18小时每孔加入1μCi的3H-TdR，孵育结束后收集细胞、计算3H-TdR掺入率。 
6)、与PDLSCs共孵育后的T淋巴细胞的再次刺激
为了观察PDLSCs对T淋巴细胞的增殖抑制是否可逆，我们进行了再激活实验。PBMCs(5.0×104)先与等量的PDLSCs和PHA(0.5μg/mL)共同孵育5天，然后把通过梯度密度离心法获得的T淋巴细胞与PHA(0.5μg/mL)或者重组人白介素2(interleukin2,IL-2,50U/mL;R&D systems)共同反应2天。2天后，应用3H-TdR掺入法测定T淋巴细胞增殖率。 
7)、Transwell培养实验
为了观察通过细胞-细胞直接接触还是PDLSCs分泌可溶性因子来 介导PDLSCs对T淋巴细胞的增殖抑制，我们进行了Transwell培养实验。Transwell培养系统(Costar)具有直径为0.4μm孔径的微膜，此微膜可以把两种细胞人为地分隔开来。将PBMCs(5.0×104)与PHA(0.5μg/mL)置于Transwell培养系统的上腔,而5.0×104PDLSCs(从本实验开始，本研究的以下部分都用fPDLSCs)接种在下腔。5天后，应用 3H-TdR掺入法测定T淋巴细胞增殖率。 
8)、可溶性因子的测定及中和实验
当发现可溶性因子介导PDLSCs对T淋巴细胞的增殖抑制后，我们应用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immumosorbent assay，ELISA)来测定单纯PDLSCs的培养上清(接种1-5天)和MLR培养上清(5.0×104PDLSCs,等量PBMCs和0.5μg/mL的PHA)中TGF-β1(R&D systems),HGF(R&D systems),前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2;Assay Designs)和IL-10(R&D systems)的浓度。通过酶标仪(Molecules Devices)在450nm(TGF-β1,HGF和IL-10)或者405nm(PGE2)读取光密度值。 
然后进行中和实验，在Transwell培养系统中建立MLR的反应体系，包括PBMCs(5.0×104),PDLSCs(5.0×104)和PHA(0.5μg/mL)，在反应的同时分别加入以下抗体或者试剂：抗TGF-β抗体(10ng/mL),抗HGF抗体(10ng/mL)和抗IL-10抗体(10ng/mL)或者PGE2的抑制剂吲哚美辛(5μmol/L;Sigma-Aldrich)。5天后，通过3H-TdR掺入法测定T淋巴细胞增殖率。 
9)、测定凋亡T淋巴细胞的百分率
建立MLR的反应体系，包括PBMCs(5.0×104),PDLSCs(5.0×104)和PHA(0.5μg/mL)，5天后应用Annexin V-Fluos凋亡试剂盒(Roche Diagnostics)来测定凋亡T淋巴细胞的百分率。 
实施例2：PDLSCs介导的牙周骨缺损修复
1)、材料和方法
五指山小型猪和贵州香猪(6-8月龄，体重30-40千克)由中国农业大学实验动物中心提供。本实验通过首都医科大学伦理委员会批准。小型猪尖牙PDLSCs的分离和培养方法同人PDLSCs。按照文献报道的方法(13)，制备12只雌性五指山小型猪的牙周炎骨缺损模型，总共制备24处下颌第一恒磨牙的牙周炎骨缺损。24处缺损随机分为以下4个组：【1】 空白对照组，不做任何治疗；【2】单纯材料组，翻瓣、刮治、移植HA/TCP支架材料(武汉理工大学提供)、明胶海绵覆盖缺损、缝合；【3】自体PDLSCs移植组，翻瓣、刮治、移植HA/TCP支架材料+2.0×107五指山小型猪PDLSCs、明胶海绵覆盖缺损、缝合；【4】异体PDLSCs移植组，翻瓣、刮治、移植HA/TCP支架材料+2.0×107香猪PDLSCs、明胶海绵覆盖缺损、缝合。在制备牙周炎骨缺损模型前(-4w)、移植治疗前(0w)和治疗后12w进行临床检查，包括探诊深度(probing depth，PD)、牙龈退缩(gingival recession，GR)和附着丧失(attachment loss，AL)。在0w和治疗后12w应用CT(Siemens)观察骨再生的情况。在-4w、治疗后1-7d、2w、4w、8w和12w进行血常规检查、血生化检查、免疫球蛋白检查和T淋巴细胞相关标志物的检查，包括CD3+细胞计数、CD4+细胞计数、CD8+细胞计数以及活化T淋巴细胞的标志物——CD40L的表达情况。在治疗后12w，处死动物，从实验部位获取标本，固定、脱钙、石蜡包埋，行HE染色，观察组织再生情况。 
通过Student’t检验和方差分析进行统计学分析,p<0.05认为是有统计学差异。 
2)、结果和说明
2-1)、PDLSCs具有低免疫原性
首先观察到人PDLSCs的免疫表型，发现fPDLSCs(76.2%±5.8%,n=5)和cPDLSCs(78.5%±6.4%,n=5)表达HLA-I，但是不表达HLA-ΠDR和共刺激分子CD80、CD86(图1)，与体外培养扩增的BMSCs表达状况相似(23)。 
进一步研究PDLSCs作为抗原提呈细胞对T淋巴细胞增殖的影响。实验组为预先经过直线加速器20Gy照射的5.0×104PDLSCs与等量的同种异体PBMCs共孵育。作为阳性对照的T淋巴细胞增殖组为：5.0×104PBMCs与与等量的同种异体PBMCs共孵育。单独培养等量的PBMCs为阴性对照。结果表明，实验组PDLSCs没有引起同种异体PBMCs增殖，而阳性对照组可以引起显著的 
T淋巴细胞增殖(图2a)，提示PDLSCs具有低免疫原性。 
2-2)、PDLSCs能够抑制T淋巴细胞增殖
进一步观察PDLSCs对丝裂原和同种异体抗原引起的T淋巴细胞增殖的影响。将fPDLSCs和cPDLSCs接种，细胞量分别为：1.0×104, 5.0×104,2.5×105和5.0×105，然后加入自体PBMCs(5.0×104)和终浓度为0.5μg/mL的PHA。PHA刺激PBMCs(5.0×104)增殖为阳性对照。结果发现，PHA刺激的PBMCs增殖明显地被fPDLSCs或者cPDLSCs所抑制，而且这种抑制是剂量依赖性的。此种免疫抑制作用必须要求PDLSCs的存在，而不是由体积效应(bulk effect)引起，因为在增殖反应体系中加入等量的自体PBMCs不会引起抑制作用(图2b)。此外，即使在PHA刺激PBMCs(5.0×104)增殖后两天再加入PDLSCs，仍然能够明显抑制T淋巴细胞的增殖(图2c)。我们进一步观察PDLSCs对MLR的影响。来自两个不同个体的PBMCs和第三方的PDLSCs共同孵育。结果表明，fPDLSCs和cPDLSCs都能够抑制双向MLR(图2d)。本部分实验数据表明，PDLSCs能够剂量依赖性地和抗原非特异性地抑制同种异体T细胞受体引起的和丝裂原引起的T淋巴细胞增殖。 
2-3)、PDLSCs通过分泌PGE2抑制T淋巴细胞增殖
我们进一步研究PDLSCs抑制T淋巴细胞增殖的机制问题。为了阐明是否通过PDLSCs和PBMCs细胞-细胞直接接触引起，我们首先进行了Transwell培养实验，将PDLSCs和PBMCs人为地分隔开来。研究结果表明，无论是Transwell培养实验还是细胞-细胞直接接触实验，都能够取得相近的T淋巴细胞增殖抑制效果，提示这种免疫抑制作用与细胞-细胞直接接触无关，而是依靠可溶性因子的存在(图3a)。 
通过ELISA，我们测定单纯PDLSCs培养上清中和MLR上清中几种可能性的可溶性因子。无论PDLSCs培养上清还是MLR上清，都没有发现HGF和IL-10(图4)。然后我们继续观察TGF-β1和PGE2，因为这两者被认为是BMSCs发挥免疫调节功能的主要因子(7,25)。如图3b和图3c所示,在接种后1-5d的PDLSCs培养上清中，TGF-β1和PGE2的浓度相对稳定，没有明显的波动。但是，在MLR上清中，PGE2的浓度达15.19±1.26ng/ml，与单纯PDLSCs培养的浓度相比明显升高，TGF-β1的浓度为1459.79±109.49pg/mL，没有明显变化。 
我们通过在MLR体系中添加特异性的抗TGF-β,IL-10,HGF抗体和PGE2抑制剂来观察其恢复T淋巴细胞增殖的能力，进一步确定PDLSCs抑制T淋巴细胞增殖的主要因子。结果发现，加入PGE2抑制剂能够显著恢复T淋巴细胞的增殖，而且此时的增殖力同单纯用PHA刺激PBMCs的增殖力相近(图3d)。而实验体系中加入抗TGF-β,IL-10, HGF的中和抗体并没有恢复T淋巴细胞的增殖(图3d)。这些数据表明PGE2是介导PDLSCs抑制T淋巴细胞增殖的主要因子。 
就BMSCs的免疫抑制机制而言，虽然目前尚不清楚哪一种因子发挥主导性的作用以及某些研究还存在不一致，但是大多数的研究认识还是通过BMSCs分泌抗增殖的可溶性因子比如IL-10,HGF,TGF-β1,PGE2,吲哚胺-2,3-二氧化酶和一氧化氮(5,6,17,19,20,24-28)引起。Beyth等(28)报道IL-10是BMSCs免疫抑制作用的主要介导因子。DiNicola等(7)通过抗体中和实验发现TGF-β1和HGF是发挥作用的主要因素。另有研究表明PGE2的抑制剂能够抵消BMSCs的免疫抑制作用(25)。这些研究都表明了可溶性因子参与了BMSCs的免疫抑制作用。我们的研究提示PGE2是PDLSCs抑制T淋巴细胞增殖的主要因子。 
2-4)、PDLSCs的免疫抑制作用与T细胞凋亡无关，而是诱导T细胞无能
进一步研究PDLSCs的免疫抑制作用是否引起了T淋巴细胞的凋亡。现发现，在PDLSCs、PBMCs和PHA的反应体系中，凋亡的T淋巴细胞比例与单纯PBMC、PHA反应体系相似，排除了T淋巴细胞凋亡是引起免疫抑制的可能性(图3e,f)。然后，把被PDLSCs抑制了5天的T淋巴细胞提取，用PHA或者IL-2再刺激两天。结果发现，已经被抑制了的T淋巴细胞再次明显增殖，这种增殖程度与单纯PHA刺激PBMCs的程度相近似(图3g)。因此，可以认为PDLSCs的T淋巴细胞增殖抑制是可逆的，通过诱导T淋巴细胞无能引起。 
2-5)、PDLSCs介导的牙周组织再生
鉴于PDLSCs的免疫调节特性，研究同种异体PDLSCs能否修复小型猪牙周炎骨缺损模型。在移植后12周，同种异体移植PDLSCs组的PD为3.5±0.6mm,自体移植组的PD为3.3±0.4mm,HA/TCP组为13.1±1.1mm,空白对照组为10.6±1.3mm。统计学分析表明自体或者同种异体PDLSCs移植组与HA/TCP组和空白对照组相比牙周组织得到了明显再生,而自体或者同种异体PDLSCs组之间并没有显著差异(图5a)。CT扫描显示自体和同种异体PDLSCs组的牙槽骨明显再生，基本恢复到了正常水平，而HA/TCP组和空白对照组仅仅少量再生或者没有再生(图5a-h)。组织学观察表明，在自体和同种异体PDLSCs组，明显再生出新骨、牙骨质和牙周纤维，在HA/TCP组和空白对照组，仍 可见明显的牙周炎表现，包括深牙周袋、缺乏新生骨和牙周纤维(图5j-m)。此外，与移植治疗前4w相比，治疗后各时间点的血常规检查(表1)、血生化检查(表2)、免疫球蛋白检查(表3)和免疫学相关指标(图6，图7)都没有明显变化，表明同种异体移植PDLSCs修复牙周炎骨缺损没有排斥反应的发生。 
表1 

表2 

表3 

此外，根据本实施例的另一次试验结果见图8，其中详细描绘了PDLSCs介导的牙周组织再生，从图中显示的结果表明，与本实施例中上面的试验结果一致。 
总之，本发明表明，PDLSCs表达HLA-Ⅰ,不表达HLA-ⅡDR、CD80和CD86，也不会引起同种异体T淋巴细胞增殖，提示PDLSCs具有低免疫原性；PDLSCs能够抑制丝裂原和同种异体抗原引起的T淋巴细胞增殖；PDLSCs不会引起T淋巴细胞的凋亡，T淋巴细胞再次受到刺激时可以恢复增殖能力；PDLSCs通过分泌PGE2来发挥其免疫抑制功能；同种异体PDLSCs可以修复小型猪牙周炎骨缺损模型，且不会引起免疫排斥反应。 
实施例3：牙齿相关间充质干细胞介导的生物牙根再生
1)材料和方法
1-1)种子细胞的分离、培养
根尖牙乳头干细胞：麻醉下无菌拔除小型猪尖牙，切取根尖部分根尖牙乳头，用D-Hank's液分别反复清洗，剪碎，置于含Ⅰ型胶原酶(3g/L)和Dispase(4g/L)的消化液，37℃下消化1h，过70μm滤网收集细胞，1000r/min离心10min，用培养液重新悬浮成单细胞悬液。按0.01～1×105/孔分别将根尖牙乳头细胞及牙周膜细胞接种于6孔板中，在α-MEM培养基(含15%胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)37℃、5%CO2培养，每2～3天换液1次。达80％融合时传代培 养。 
牙髓干细胞：麻醉下无菌拔除小型猪尖牙，劈开牙齿取牙髓组织，用D-Hank's液分别反复清洗，剪碎，消化，培养，具体步骤同根尖牙乳头细胞。 
牙周膜干细胞：麻醉下无菌拔除小型猪尖牙，轻轻剥离其周围的牙周组织，取中段的牙周组织，用D-Hank's液分别反复清洗，剪碎，消化，培养，具体步骤同根尖牙乳头细胞。 
1-2)牙周膜细胞膜片制备
将生长旺盛的2×105第二或第三代牙周膜干细胞接种在60mm培养皿，培养成分为α-MEM培养基(含15%胎牛血清，100μmol/L的L-抗坏血酸2-磷酸，2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)。培养10—14天，培养皿边缘细胞出现皱褶，用较钝刀片或细胞刮子将细胞膜片整体揭下来，过程中细胞膜片不要干燥。 
1-3)支架材料
将羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料做成类似牙根的外形，尺寸为：直径5mm，长度15mm的圆锥体。羟基磷灰石/磷酸三钙为多孔网状结构,孔径多为200～500μm，牙髓干细胞复合在羟基磷灰石/磷酸三钙三维支架上，在生物反应器内生长第5天的牙髓干细胞，细胞充分伸展，细胞表面的突起和分泌颗粒很多，，连接成一片，直径多在20-50μm。 
1-4)回植前细胞复合
将1×108培养至第3代的根尖牙乳头干细胞悬于培养基，将牙根型支架材料置于含细胞的培养基，在37°C摇床上充分混合2h，将支架材料小心夹出，放置于培养皿中，将剩余的细胞悬液小心滴加于支架材料上，静置4h后加培养液，在生物反应器内培养5d后回植。 
1-5)回植方法
分别选取小型猪的缺牙区。切开黏膜，翻开黏骨膜用瓣，暴露牙槽嵴顶。用种植机以800转/分钟的速度在牙槽骨内钻一个与羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料形状相似的孔，将上述根尖牙乳头干细胞/牙髓干细胞与牙根形羟基磷灰石/磷酸三钙混合后在生物反应器内培养5—7天，牙周膜干细胞膜片包绕羟基磷灰石/磷酸三钙表面，回植于小型猪牙槽骨内。 
2）结果和讨论
牙周膜细胞片应用于牙周组织工程已经有一段时间的历史，但常规采 用Recell温度响应培养皿，培养皿的表面使用了一种温度敏感的疏水材料PIPA-Am。当温度高于32℃时，表面具有疏水性，适合细胞的附着和生长，当温度降低，聚合体变得亲水及膨胀，自然释放细胞。收获细胞只需将温度降到20℃即可，无需酶消化和处理，可以保留细胞表面功能和活性。但培养皿需要特殊的材料PIPA-Am，因此我们摸索出了应用普通的培养皿制备牙周膜细胞膜片的方法，培养基成分中加入100μmol/L的L-抗坏血酸2-磷酸，可以促进细胞快速增殖，并能分泌大量细胞外基质胶原成分，将所有细胞连接在一起，生长到一定程度后，我们将整个细胞膜片完整揭下来。细胞膜片不破坏细胞外基质连接形成的支架，不破坏细胞表面蛋白的粘附增殖及分化等功能，可促进回植体内后形成牙周组织。正常牙周膜特别薄约0.2mm，如果采用支架材料，相对较厚，材料降解后遗留的空隙是个问题，牙周膜片避免了此问题。 
由于重力及营养供应的因素，对细胞支架复合物进行静止性三维培养的过程中，发现细胞多聚集到支架材料的底部和表面，材料内部黏附的细胞数量很少。培养过程中，静止培养还限制了细胞生长的深度，而牙髓干细胞在支架材料内部均匀分布，才能形成均匀一致的组织。想要让细胞能在支架材料内部也能很好的生长，营养物质能够有效的在支架内部传输和及时的排出细胞代谢废物很重要。生物反应器虽然还不能模拟体内循环系统的物质交换机制，但可在支架材料内部产生流体力学环境，如果控制好力学强度的大小，既可减少对细胞的损伤作用，又可为细胞的生长提供有利的力学环境。本实验中细胞复合到材料后在生物反应器内培养5天，生物反应器动力性三维培养促进了支架内部营养物质的交换，促进了种子细胞在支架材料中的均匀分布，有利于细胞保持成骨表型及促进细胞外基质在支架材料中的沉积。 
回植6～9月后，回植的生物牙根在X线片表现为不透射的高密度影，周围有低密度影像环绕。组织学上，再生的生物牙根组织形态与新生的骨组织完全不同，是由许多处于不同生长阶段的球形硬组织团块组成，球形团块相互连接成网状。新生的球形硬组织体积较小，外面围绕着疏松排列呈蓝紫色的细胞，推测可能是成牙本质细胞或成牙骨质细胞，中央为均匀、粉染的基质。较成熟的球形硬组织团块体积较大，中间基本不含细胞，或可见极少量被包埋于其中的细胞碎片。团块中有类牙本质样的结构，其中可见排列不规则的牙本质小管样结构，也有类似牙骨质样的结构，镜下表 现为较均匀一致的硬组织。新形成的硬组织区域外为纤维结缔组织包绕，未见炎细胞浸润，部分区域内还可见类似Sharp's纤维样的结构插入正在形成的类牙骨质和牙本质样结构中。 
由上述公开的技术方案可见，本发明对于利用生物牙根再生修复牙齿缺失有十分重要和深远的意义：首先，本发明提出了基于组织工程技术的生物牙根再生的新理念。其次，本发明将生物牙根再生的新理念在大型动物小型猪上实施，获得成功，证明该发明方法可行，有望成为一种新的修复方式应用于临床。第三，本发明提供的具体实施方法系统、可靠，为进行生物牙根再生的深入研究及商品化提供理论依据和技术支持。 
在本实施例方法中，提供的一个实验结果见图9所示，其中详细描绘了在小型猪上成功再生生物牙根的情况。其中，A：实验流程图；（B,C）：形成了牙本质牙骨质样结构及牙周膜样结构（HE染色）；D：牙周膜COLⅠ染色阳性；E：牙本质牙骨质样结构Dsp染色阳性；F～I：再生生物牙根扫描电镜（SEM）观察：F：HA/TCP材料呈多孔隙结构（100-400um）；H：新形成的牙周膜纤维插入新形成的牙本质牙骨质结构及牙槽骨内（G图箭头所指）；I：新形成的牙本质样结构（G图粗箭头所指）。 
在本实施例方法中，提供的另一个实验结果见图10所示，与图9类似，图10中详细描绘了在小型猪上进行生物牙根再生获得成功的情况。 
实施例4：脱落乳牙牙髓干细胞移植治疗系统性红斑狼疮(SLE)
1)材料和方法
1-1)人SHED
选取拔除的6-8岁的健康患者的正常乳牙，按照以往文献报道的方法分离和培养SHED(3)。人体组织的利用得到首都医科大学伦理委员会的批准。 
1-2)人骨髓基质干细胞和外周血单个核细胞
应用梯度密度离心法分离健康供者的骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)和外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。 
1-3)SHED治疗系统性红斑狼疮(SLE)
C57BL/6J and C3MRL-Faslpr/J(MRL/lpr)小鼠(雌性,6-7周龄),Beige nude/nude Xid(III)小鼠(雌性,8-12周龄)由提供。本实验通过首 都医科大学伦理委员会批准。实验分为以下3个组：1、空白对照组(n=3)，不做任何治疗。2、移植BMMSCs组(n=3)。3、移植SHED组(n=3)。在全麻下，将SHED或BMMSCs(1x105cells/10g体重，细胞悬浮于100ml PBS)通过尾静脉注射入16周龄MRL/lpr小鼠，对照组注射生理盐水。在小鼠20周龄时将其处死，取外周血、肾脏、长骨(股骨和胫骨)标本。肾脏标本固定、石蜡包埋，行HE、trichrome、periodic acid-schiff(pas)染色，观察肾小球基底膜功能异常恢复及肾小球膜细胞过度增长恢复情况。通过ELISA检测血清dsDNA-IgG,dsDNA-IgM，ANA水平，检测尿中和血清中补体3(complement3，C3)、肌酸酐(creatinine)、尿蛋白(urine protein)水平。 
2)结果和说明
SLE是以多脏器受累和血中存在多种抗体为特征的自身免疫病，许多研究证实T、B淋巴细胞过度活化是SLE发病中的关键环节。T、B淋巴细胞来源于淋巴干/祖细胞，而MSCs在淋巴干/祖细胞增殖分化中具有重要的作用，所以MSCs在SLE致病中的作用越来越受到关注。SLE患者MSCs存在异常，它分化的骨髓基质细胞不能较好地支持淋巴细胞生长，淋巴细胞的生长依赖于淋巴细胞本身和骨髓基质细胞分泌的各种细胞因子，骨髓基质细胞的异常参与了淋巴细胞的异常活化。Majumdar等研究表明MSCs表达大量的细胞黏附分子，在细胞间黏附、归巢、支持造血、调节免疫细胞功能中起重要作用。当把肿瘤细胞种植人异体小鼠时，肿瘤细胞会被宿主免疫系统清除，而当肿瘤细胞和MSCs同时注入异体小鼠后，肿瘤细胞可在受体内存活，表明MSCs在体内具有免疫抑制功能。MSCs在分化成其他细胞类型时仍保留其免疫调节作用，这就意味着移植的MSCs可发挥长期的免疫调节作用。 
体外实验证实SHED具有MSCs生物学及免疫学特性，可以与T淋巴细胞相互影响。与BMMSCs相比，SHED通过恢复外周血Tregs/Th17比例，减少Th17细胞数目发挥免疫学效应。16周龄的MRL/lpr小鼠注射SHED后，可以发现小梁骨再生，破骨细胞活性受到了抑制。注射SHED的小鼠与注射BMMSCs的小鼠一样，重建了成骨细胞微环境，从而改善了其功能紊乱。MRL/lpr小鼠注射SHED后，虽说Treg水平未提高，但Treg/Th17细胞比例明显增高，这表明SHED的免疫调节功能可能源于Treg抑制自身免疫而Th17则可促进自身免疫 和炎症。 
在本实施例方法中，提供的一个实验结果见图11所示，其中详细描绘了脱落乳牙牙髓干细胞治疗系统性红斑狼疮鼠血清及肾脏组织学改变的情况。从图中结果可见本实施例实现了本发明的目的。 
总之，本发明表明，从脱落的乳牙牙髓可提取出SHED，它是来源于中胚层的间充质干细胞，具有MSCs的生物学和免疫学特性及功能。尽管SHED的免疫调节作用机制尚未明确，但由于它的免疫调节作用，在自身免疫病方面有潜在的治疗作用，SHED移植可作为治疗自身免疫病的新尝试。 
实施例5：同种异体人牙周膜干细胞(hPDLSCs)用于治疗牙周病的标准操作实例
本实施例参考图12来说明同种异体人牙周膜干细胞(hPDLSCs)用于治疗牙周病的标准操作的一个实例： 
(a)采集人牙周膜(periodontal ligament，PDL)。从18-28岁患者采集正常的阻生第三磨牙(impacted third molar)。将PDL轻轻地从牙表面分离。 
(b)培养hPDLSCs。分离hPDLSCs。原始培养15天后，来自一个阻生第三磨牙的hPDLSCs的数量约为4.90±0.34×105(P0;n=10)。再培养另外15天后，hPDLSCs的数量(P3)增加到8.86±0.46×106(n=10)。hPDLSCs对CD146和CD90显阳性。 
(c)冷冻保存hPDLSCs。将第三代hPDLSCs用10%DMSO和90%FBS冷冻保存，并保存在液氮中。 
(d)融化hPDLSCs。融化之后，对hPDLSCs检查支原体、细菌、集落形成效率、间质干细胞标记模式和核型分析。 
(e)制备hPDLSCs片。在100mm培养皿中对三种不同细胞数(1×105,1×106和2×106;n=3)培养12-15天，在1×106和2×106组中形成细胞片，但在1×105组中未形成细胞片。为此，将1×106的hPDLSCs接种到100mm培养皿中，达15天。 
(f)然后，将40mg HA/TCP置于这些培养皿中。 
(g)hPDLSCs片与HA/TCP的全图。 
(h)口腔牙周损伤图。 
在牙周初始治疗(i)之后，将两个同种异体hPDLSCs片与HA/TCP植入到3mm×5mm×7mm的牙周损伤缺陷处(j)。 
(k)接下来的项目包括临床和放射照相评价、血液学和免疫学评价。 
参考文献：
1．Gronthos,S.,M.Mankani,J.Brahim,P.G..Robey,and S.Shi.2000.Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro and in vivo.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97:13625-13630. 
2．Miura,M.,S.Gronthos,M.Zhao,B.Lu,L.W.Fisher,P.G.Robey,S.Shi.2003.SHED:Stem cells from human exfoliated deciduous teeth.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100:5807-5812. 
3．Seo,B.M.,M.Miura,S.Gronthos,P.M.Bartold,S.Batouli,J.Brahim,M.Young,P.G..Robey,C.Y.Wang,and S.Shi.2004.Multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament.Lancet.364:149-155. 
4．Sonoyama,W.,Y.Liu,D.Fang.,T.Yamaza,B.M.Seo,C.Zhang,H.Liu,S.Gronthos,C.Y.Wang,S.Wang and S.Shi.2006.Mesenchymal stem cell-mediated functional tooth regeneration in swine.PLoS ONE.1:79-92. 
5．Le Blanc,K.,C.Tammik,K.Rosendahl,E.Zetterberg,and O.Ringden.2003.HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells.Exp.Hematol.31:890-896. 
6．Di Nicola,M.,C.Carlo-Stella,M.Magni,M.Milanesi,P.D.Longoni,P.Matteucci,S.Grisanti,and A.M.Gianni.2002.Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli.Blood.99:3838-3843. 
7．Djouad,F.,P.Plence,C.Bony,P.Tropel,F.Apparailly,J.Sany,D.Noel,and C.Jorgensen.2003.Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals.Blood.102:3837-3844. 
8．Tse,W.T.,J.D.Pendleton,W.M.Beyer,M.C.Egalka,and E.C.Guinan.2003.Suppression of allogeneic T-cell proliferation by human marrow stromal cells:implications in transplantation.Transplantation.75:389-397. 
9．Lazarus H,Curtin P,Devine S,et al.Role of mesenchymal stem cells(MSC)in allogeneic transplantation:early phase1clinical results[abstract].Blood2000;392:1691. 
10．Le Blanc,K.,I.Rasmusson,B.Sundberg,C.G.otherstrom,M.Hassan,M.Uzunel,and O.Ringden.2004.Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells.Lancet.363:1439-1441. 
11．Pierdomenico,L.,L.Bonsi,M.Calvitti,D.Rondelli,M.Arpinati,G.Chirumbolo,E.Becchetti,C.Marchionni,F.Alviano,V.Fossati,N.Staffolam,M.Franchina,A.Grossi,and G.P.Bagnara.2005.Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp.Transplantation.80:836-842 
12．Kinane,D.F.,G.J.Marshall.2001.Periodontal manifestations of systemic disease.Aust Dent J.46:2-12. 
13．Liu,Y.,Y.Zheng,G.Ding,D.Fang,C.Zhang,P.M.Bartold,S.Gronthos,S.Shi,and S.Wang.2008.Periodontal ligament stem cell-mediated treatment for periodontitis in miniature swine.Stem cells.26:1065-1073. 
14．Seo,B.M.,M,Miura,W.Sonoyama,C.Coppe,R.Stanyan,and S.Shi.2005.Recovery of stem cells from cryopreserved periodontal ligament.J.Dent.Res.84:907-912. 
15．Muller,I.,S.Kordowich,C.Holzwarth,G.Isensee,P.Lang,F.Neunhoeffer,M.Dominici,J.Greil,and R.Handgretinger.2008.Application of multipotent mesenchymal stromal cells in pediatric patients following allogeneic stem cell transplantation.Blood.Cells.Mol.Dis.40:25-32. 
16．Ringden,O.,M.Uzunel,I.Rasmusson,M.Remberger,B.Sundberg,H.Lonnies,H.U.Marschall,A.Dlugosz,A.Szakos,Z.Hassan,B.Omazic,J.Aschan,L.Barkholt,and K.Le Blanc.2006.Mesenchymal stem cell for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease.Transplantation.81:1390-1397. 
17．Uccelli,A.,V.Pistoia,L.Moretta.2007.Mesenchymal stem cells:a new strategy for immunosuppression?Trends.Immunol.28:219-226. 
18．Giordano,A.,U.Galderisi,I.R.Marino.2007.From the laboratory bench to the patient’bedside:an update on clinical trials with mesenchymal stem cells.J.Cell.Physiol.211:27-35. 
19．Krampera,M.,S.Glennie,J.Dyson,D.Scott,R.Laylor,E.Simpson,and F.Dazzi.2003..Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide.Blood.101:3722-3729. 
20．Maccario,R.,M.Podesta,A.Moretta,A.Cometa,P.Comoli,D.Montagna,L.Daudt,A.Ibaticia,G.Piaggio,S.Pozzi,F.Frassoni,and F.Locatelli.2005.Interaction of human mesenchymal stem cells with cells involved in alloantigen-specific immune response favors the differentiation of CD4+T-cell subsets expressing a regulatory/suppressive phenotype.Haematologica.90:516-525. 
21．Corcione,A.,F.Benvenuto,E.Ferretti,D.Giunti,V.Cappiello,F.Cazzanti,M.Risso,F.Gualandi,G.L.Mancardi,V.Pistoia,and A.Uccelli.2006.Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions.Blood.107:367-372. 
22．Sotiropoulou,P.A.,S.A.Perez,A.D.Gritzapis,C.N.Baxevanis,and M.Papamichail.2006.Interactions between human mesenchymal stem cells and natural killer cells.Stem.Cells.24:74-85. 
23．Devine,S.M.,and R.Hoffman.2000.Role of mesenchymal stem cells in hematopoieticstem cell transplantation.Curr.Opin.Hematol.7:358-363. 
24．Aggarwal,S.,and M.F.Pittinger.2005.Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses.Blood.105:1815-1822. 
25．Le Blanc,K.,and O.Ringden.2005.Immunobiology of human mesenchymal stem cells and future use in hematopoietic stem cell transplantation.Biol.Blood.Marrow.Transplant.11:321-334. 
26．Le Blanc,K.,and O.Ringden.2006.Mesenchymal stem cells:properties and role in clinical bone marrow transplantation.Curr.Opin.Immunol.18:586-591. 
27．Sato K,Ozaki K,Oh I,et al.2007.Nitric oxide plays a critical role in suppression of T cell proliferation by mesenchymal stem cells.Blood;109:228-234. 
28．Beyth S,Borovsky Z,Mevorach D,et al.2005.Human mesenchymal stem cells alter antigen-presenting cell maturation and induce T-cell unresponsiveness.Blood;105:214-2219。