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1、(10)申请公布号 CN 103432007 A (43)申请公布日 2013.12.11 CN 103432007 A *CN103432007A* (21)申请号 201310273342.6 (22)申请日 2010.01.22 200910000981.9 2009.01.23 CN 201080005266.5 2010.01.22 A61K 6/00(2006.01) A61K 35/32(2006.01) C12N 5/0775(2010.01) A61P 1/02(2006.01) A61P 37/02(2006.01) (71)申请人 首都医科大学 地址 100069 北京市。
2、丰台区右安门外西头条 10 号 (72)发明人 王松灵 施松涛 丁刚 (74)专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专 利商标事务所 11038 代理人 程泳 (54) 发明名称 牙齿相关干细胞的新用途 (57) 摘要 牙齿相关干细胞的新用途。提供了牙齿相关 干细胞在制备用于预防或治疗牙齿相关疾病、 免 疫性疾病、 自身免疫性疾病、 与 T 淋巴细胞异常活 化或升高相关的疾病、 红斑狼疮或系统性红斑狼 疮的产品, 或者制备用于修复牙齿相关组织的产 品中的新用途。还提供了包含牙齿相关干细胞的 组合物以及使用牙齿相关干细胞预防或治疗疾病 的方法。 (66)本国优先权数据 (62)分案原申请数据 (5。
3、1)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 19 页 附图 10 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书19页 附图10页 (10)申请公布号 CN 103432007 A CN 103432007 A *CN103432007A* 1/1 页 2 1. 牙齿相关干细胞在制备用于预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情的产品中的用途, 或者在制备用于牙齿相关组织形成或修复的产品中的用途。 2. 根据权利要求 1 的用途, 其中所述的牙齿相关干细胞选自 : 牙髓干细胞、 脱落乳牙牙 髓干细胞、 牙周膜干细胞、 和根尖牙乳头干细胞。 3.根据权利要求1或。
4、2的用途, 其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物, 例如所述的 牙齿相关干细胞来自选自以下的哺乳动物 : 人、 猪 ( 例如五指山小型猪、 贵州香猪 )、 牛、 马、 猴、 大鼠、 小鼠、 豚鼠、 羊、 绵羊、 山羊。 4. 根据权利要求 1 至 3 任一项的用途, 其中所述的与牙齿相关的疾病或病情或者牙齿 相关组织形成或修复选自 : 牙周病、 牙周炎、 牙齿缺损、 牙齿组织缺损、 牙齿缺损修复、 牙齿 相关组织缺损和修复、 牙齿相关组织替代物再生、 等等。 5. 牙齿相关干细胞在制备用于预防或治疗免疫性疾病或病情、 自身免疫性疾病或病 情、 与 T 淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、 与 T。
5、 淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、 红斑狼疮、 或者系统性红斑狼疮的产品中的用途。 6. 根据权利要求 5 的用途, 其中所述的牙齿相关干细胞选自 : 牙髓干细胞、 脱落乳牙牙 髓干细胞、 牙周膜干细胞、 和根尖牙乳头干细胞。 7. 一种组合物, 其包含有效量的牙齿相关干细胞和任选的药学可接受的载体。 8. 根据权利要求 7 的组合物, 其中所述的牙齿相关干细胞选自 : 牙髓干细胞、 脱落乳牙 牙髓干细胞、 牙周膜干细胞、 和根尖牙乳头干细胞。 9.根据权利要求7或8的组合物, 其是用于预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情, 或者 用于牙齿相关组织形成或修复, 或者用于预防或治疗免疫性疾病或病情。
6、、 自身免疫性疾病 或病情、 与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、 与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病 情、 红斑狼疮、 或者系统性红斑狼疮。 权 利 要 求 书 CN 103432007 A 2 1/19 页 3 牙齿相关干细胞的新用途 0001 本申请为申请号为 201080005266.5、 发明名称为 “牙齿相关干细胞的新用途” 的发 明申请的分案申请。 发明领域 0002 本发明涉及牙齿相关干细胞的新用途。具体地, 本发明涉及牙齿相关干细胞在制 备用于预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情的产品中的用途, 或者在制备用于牙齿相关组 织形成或修复的产品中的用途 ; 还涉及牙齿相关干细胞在制。
7、备用于预防或治疗免疫性疾病 或病情、 自身免疫性疾病或病情、 与 T 淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、 与 T 淋巴细胞 异常升高有关的疾病或病情、 红斑狼疮、 或者系统性红斑狼疮的产品中的用途 ; 还涉及根据 上述用途的治疗方法 ; 还涉及包含牙齿相关干细胞的组合物。 背景技术 0003 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的原始细胞, 可分为胚胎干细胞和成体干 细胞。在成体组织及器官中普遍存在着特异的成体干细胞, 目前已经发现的例如来源于人 的牙齿相关干细胞都是来源于中胚层的间充质干细胞 (mesenchymal stem cells,MSCs), 包括牙髓干细胞 (dental pulp。
8、 stem cells, DPSCs)、 脱落乳牙牙髓干细胞 (stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)、 牙周膜干细胞 (periodontal ligament stem cells, PDLSCs) 和根尖牙乳头干细胞 (stem cells from apical papilla, SCAP) (1-4, 即指文献 1 至 4, 下同 ), 它们可以来源于多种动物 ( 例如哺乳动物, 例如人 )。研究表 明牙齿相关干细胞具有很高的增殖能力和多向分化潜能, 能够向成骨细胞、 脂肪细胞、 神经 样细胞分化。当把牙齿相关干。
9、细胞和三维支架材料的复合物植入到裸鼠皮下时, 能够产生 自体牙髓牙本质复合体样结构和牙骨质牙周膜复合体样结构 (1,3)。目前在自体小型猪模 型上已经应用 PDLSCs 和 SCAP 成功再生出生物牙根 (4)。目前国际上干细胞研究焦点之一 集中在建立各种组织成体干细胞库, 进行干细 胞的临床试验研究。 0004 根据 WHO(2003) 统计数字表明, 牙齿相关疾病所波及的人群范围已远远超过其它 任何一种疾病。目前, 全世界每年用于牙齿疾病的治疗费用已超过 200 亿美元。在牙齿相 关疾病中, 牙周病是一种全世界范围内发病率很高的细菌感染性疾病, 最终导致牙齿支持 组织丧失和牙齿缺失, 并能。
10、引起一系列的全身系统性疾病 (13) ; 而牙齿缺失可对人体消化 系统和全身健康造成严重的影响, 同时也会使患者产生不良的社会心理影响。但目前对牙 周病及牙齿组织缺损没有好的药物或治疗方法进行治疗或修复 ; 有关牙齿缺失的治疗主要 仍是采用人工材料制作牙齿的替代物。 0005 系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus, SLE) 是以多脏器受累和血中 存在多种抗体为特征的自身免疫病, 常规的免疫抑制或免疫调节治疗可使多数患者的生存 期延长, 生活质量得到改善。1996 年意大利学者 Marmont 首先报道用自体骨髓移植治疗重 症红斑狼疮取得成功后 , 国内外。
11、迅速开展了自体外周血干细胞移植和自体骨髓移植治疗 重症 SLE 等多种难治性免疫病, 取得了较好的疗效。造血干细胞移植能使部分患者达到病 说 明 书 CN 103432007 A 3 2/19 页 4 情控制, 但其费用高、 并发症多, 病情复发率高达 40%-50%, 不能被常规使用 ; 并且, 移植后 虽然部分患者有可能达到长期缓解, 但均不能彻底根治自身免疫性疾病, 部分患者存在复 发的问题。 0006 因此, 目前仍然需要可有效治疗某些牙齿相关疾病和某些免疫性疾病的新颖方 法。 发明内容 0007 本发明的目的是提供有效治疗某些牙齿相关疾病和某些免疫性疾病的新颖方法。 本发明人在研究中。
12、现出人意料地发现牙齿相关干细胞例如牙周膜干细胞 (PDLSCs) 不但在 自体的牙齿中使缺损的牙齿组织再生, 而且能在异体缺损的牙齿组织使牙齿组织再生, 同 时 PDLSCs 还对异常升高的 T 淋巴细胞有抑制作用。本发明基于上述研究结果得以完成。 0008 发明概述 0009 本发明首先涉及 PDLSCs 在制备用于预防或治疗牙周病, 牙齿缺损修复的产品中 用途。 0010 本发明还涉及 PDLSCs 在制备用于预防或治疗与 T 淋巴细胞异常升高有关的疾病 或症状的产品中用途。 0011 本发明还涉及一种预防或治疗牙周病, 修复缺损牙齿组织的方法, 其包括给予需 预防或治疗牙周病或需修复缺损。
13、牙齿组织的宿主以有效预防或治疗量或修复缺损牙齿组 织量的 PDLSCs。 0012 本发明涉及一种预防或治疗与 T 淋巴细胞异常升高有关的疾病或症状的方法, 其 包括给予 T 淋巴细胞异常升高的宿主预防或治疗有效量的 PDLSCs。 0013 发明详述 0014 更详细地, 本发明提供了以下的各个方面以及各个方面的具体项。 0015 本发明第一方面提供了牙齿相关干细胞在制备用于预防或治疗与牙齿相关的疾 病或病情的产品中的用途, 或者在制备用于牙齿相关组织形成或修复的产品中的用途。 0016 根据本发明第一方面任一项的用途, 其中所述的牙齿相关干细胞选自 : 牙髓干细 胞、 脱落乳牙牙髓干细胞、。
14、 牙周膜干细胞、 和根尖牙乳头干细胞。 0017 根据本发明第一方面任一项的用途, 其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物。 在一个实施方案中, 所述的牙齿相关干细胞来自选自以下的哺乳动物 : 人、 猪 ( 例如五指山 小型猪、 贵州香猪 )、 牛、 马、 猴、 大鼠、 小鼠、 豚鼠、 羊、 绵羊、 山羊。 0018 根据本发明第一方面任一项的用途, 其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物, 并且选自 : 牙髓干细胞 (dental pulp stem cells, DPSCs)、 脱落乳牙牙髓干细胞 (stem cells from human exfoliated deciduous teet。
15、h, SHED)、 牙周膜干细胞 (periodontal ligament stem cells, PDLSCs)和根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla, SCAP)。 0019 根据本发明第一方面任一项的用途, 其中所述的与牙齿相关的疾病或病情或者牙 齿相关组织形成或修复选自 : 牙周病、 牙周炎、 牙齿缺损、 牙齿组织缺损、 牙齿缺损修复、 牙 齿相关组织缺损和修复、 牙齿相关组织替代物再生、 等等。 0020 根据本发明第一方面任一项的用途, 其中所述的牙齿相关干细胞用于自体或者异 说 明 书 CN 103432007 A 4 3/19 页 5。
16、 体的牙齿相关的疾病或病情, 或者用于自体或异体的牙齿相关组织形成或修复。 0021 根据本发明第一方面任一项的用途, 其中所述的牙齿相关组织包括但不限于牙 齿、 牙根、 牙髓、 牙龈等等, 以及其它与牙齿内部、 牙齿表层、 牙齿表面或者牙齿周围相关的 组织。 0022 本发明第一方面及其各子项的特征和优点同样适用于本发明其它任一方面及其 各子项。 0023 本发明第二方面提供了牙齿相关干细胞在制备用于预防或治疗免疫性疾病或病 情、 自身免疫性疾病或病情、 与 T 淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、 与 T 淋巴细胞异常 升高有关的疾病或病情、 红斑狼疮、 或者系统性红斑狼疮的产品中的用途。 。
17、0024 根据本发明第二方面任一项的用途, 其中所述的牙齿相关干细胞选自 : 牙髓干细 胞、 脱落乳牙牙髓干细胞、 牙周膜干细胞、 和根尖牙乳头干细胞。 0025 根据本发明第二方面任一项的用途, 其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物。 在一个实施方案中, 所述的牙齿相关干细胞来自选自以下的哺乳动物 : 人、 猪 ( 例如五指山 小型猪、 贵州香猪 )、 牛、 马、 猴、 大鼠、 小鼠、 豚鼠、 羊、 绵羊、 山羊。 0026 根据本发明第二方面任一项的用途, 其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物, 并且选自 : 牙髓干细胞 (dental pulp stem cells, DPSCs)、 脱。
18、落乳牙牙髓干细胞 (stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)、 牙周膜干细胞 (periodontal ligament stem cells, PDLSCs)和根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla, SCAP)。 0027 根据本发明第二方面任一项的用途, 其中所述的牙齿相关干细胞用于自体或者异 体的免疫性疾病或病情、 自身免疫性疾病或病情、 与 T 淋巴细胞异常活化有关的疾病或病 情、 与 T 淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、 红斑狼疮、 或者系统性红斑狼疮。 0028 本发明。
19、第二方面及其各子项的特征和优点同样适用于本发明其它任一方面及其 各子项。 0029 本发明第三方面提供了预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情的方法, 或者形成或 修复牙齿相关组织的方法, 该方法包括给有需要预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情的宿 主施用有效量的牙齿相关干细胞, 或者该方法包括给有需要形成或修复牙齿相关组织的宿 主施用有效量的牙齿相关干细胞。 0030 根据本发明第三方面任一项的方法, 其中所述的牙齿相关干细胞选自 : 牙髓干细 胞、 脱落乳牙牙髓干细胞、 牙周膜干细胞、 和根尖牙乳头 干细胞。 0031 根据本发明第三方面任一项的方法, 其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物。 在一个。
20、实施方案中, 所述的牙齿相关干细胞来自选自以下的哺乳动物 : 人、 猪 ( 例如五指山 小型猪、 贵州香猪 )、 牛、 马、 猴、 大鼠、 小鼠、 豚鼠、 羊、 绵羊、 山羊。 0032 根据本发明第三方面任一项的方法, 其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物, 并且选自 : 牙髓干细胞 (dental pulp stem cells, DPSCs)、 脱落乳牙牙髓干细胞 (stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)、 牙周膜干细胞 (periodontal ligament stem cells, PDLSCs)和根尖牙乳头干。
21、细胞(stem cells from apical papilla, SCAP)。 0033 根据本发明第三方面任一项的方法, 其中所述的与牙齿相关的疾病或病情或者牙 说 明 书 CN 103432007 A 5 4/19 页 6 齿相关组织形成或修复选自 : 牙周病、 牙周炎、 牙齿缺损、 牙齿组织缺损、 牙齿缺损修复、 牙 齿相关组织缺损和修复、 牙齿相关组织替代物再生、 等等。 0034 根据本发明第三方面任一项的方法, 其中所述的牙齿相关干细胞用于自体或者异 体的牙齿相关的疾病或病情, 或者用于自体或异体的牙齿相关组织形成或修复。 0035 根据本发明第三方面任一项的方法, 其中所述的。
22、牙齿相关组织包括但不限于牙 齿、 牙根、 牙髓、 牙龈等等, 以及其它与牙齿内部、 牙齿表层、 牙齿表面或者牙齿周围相关的 组织。 0036 根据本发明第三方面任一项的方法, 其中所述的宿主是哺乳动物。在一个实施方 案中, 所述的宿主是选自以下的哺乳动物 : 人、 猪 ( 例如五指山小型猪、 贵州香猪 )、 牛、 马、 猴、 大鼠、 小鼠、 豚鼠、 羊、 绵羊、 山羊。 0037 在本发明第三方面任一项方法的一个实施方案中, 其包括以下步骤 : 0038 (a) 采集人牙周膜 ; 0039 (b) 培养 hPDLSCs ; 0040 (c) 任选地冷冻保存 hPDLSCs ; 0041 (d)。
23、 任选地融化 hPDLSCs, 以及任选地对 hPDLSCs 检查支原体、 细菌、 集落形成效 率、 间质干细胞标记模式和核型分析 ; 0042 (e) 制备 hPDLSCs 片 ; 0043 (f) 将 HA/TCP 置于容纳有 hPDLSCs 片的器皿中 ; 0044 (j) 在任选的牙周初始治疗后, 将 hPDLSCs 片与 HA/TCP 植入到牙周损伤缺陷处 ; 0045 (k) 任选的进行临床和放射照相评价、 血液学和免疫学评价。 0046 本发明第三方面及其各子项的特征和优点同样适用于本发明其它任一方面及其 各子项。 0047 本发明第四方面提供了预防或治疗免疫性疾病或病情、 自身。
24、免疫性疾病或病情、 与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、 与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、 红斑 狼疮、 或者系统性红斑狼疮的方法, 该方法包括给有此需要的宿主施用有效量的牙齿相关 干细胞。 0048 根据本发明第四方面任一项的方法, 其中所述的牙齿相关干细胞选自 : 牙髓干细 胞、 脱落乳牙牙髓干细胞、 牙周膜干细胞、 和根尖牙乳头干细胞。 0049 根据本发明第四方面任一项的方法, 其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物。 在一个实施方案中, 所述的牙齿相关干细胞来自选自以下的哺乳动物 : 人、 猪 ( 例如五指山 小型猪、 贵州香猪 )、 牛、 马、 猴、 大鼠、 小鼠、 豚鼠、 。
25、羊、 绵羊、 山羊。 0050 根据本发明第四方面任一项的方法, 其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物, 并且选自 : 牙髓干细胞 (dental pulp stem cells, DPSCs)、 脱落乳牙牙髓干细胞 (stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)、 牙周膜干细胞 (periodontal ligament stem cells, PDLSCs)和根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla, SCAP)。 0051 根据本发明第四方面任一项的方法, 其中所述的牙齿相关干细胞用于。
26、自体或者异 体的免疫性疾病或病情、 自身免疫性疾病或病情、 与 T 淋巴细胞异常活化有关的疾病或病 情、 与 T 淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、 红斑狼疮、 或者系统性红斑狼疮。 说 明 书 CN 103432007 A 6 5/19 页 7 0052 根据本发明第四方面任一项的方法, 其中所述的宿主是哺乳动物。在一个实施方 案中, 所述的宿主是选自以下的哺乳动物 : 人、 猪 ( 例如五指山小型猪、 贵州香猪 )、 牛、 马、 猴、 大鼠、 小鼠、 豚鼠、 羊、 绵羊、 山羊。 0053 本发明第四方面及其各子项的特征和优点同样适用于本发明其它任一方面及其 各子项。 0054 本发明第五。
27、方面提供了一种组合物, 其包含有效量的牙齿相关干细胞和任选的药 学可接受的载体。 0055 根据本发明第五方面任一项的组合物, 其中所述的牙齿相关干细胞选自 : 牙髓干 细胞、 脱落乳牙牙髓干细胞、 牙周膜干细胞、 和根尖牙乳头干细胞。 0056 根据本发明第五方面任一项的组合物, 其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动 物。在一个实施方案中, 所述的牙齿相关干细胞来自选自以下的哺乳动物 : 人、 猪 ( 例如五 指山小型猪、 贵州香猪 )、 牛、 马、 猴、 大鼠、 小鼠、 豚鼠、 羊、 绵羊、 山羊。 0057 根据本发明第五方面任一项的组合物, 其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动 物, 并且。
28、选自 : 牙髓干细胞 (dental pulp stem cells, DPSCs)、 脱落乳牙牙髓干细胞 (stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)、 牙周膜干细胞 (periodontal ligament stem cells, PDLSCs)和根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla, SCAP)。 0058 根据本发明第五方面任一项的组合物, 其是用于预防或治疗与牙齿相关的疾病或 病情, 或者用于牙齿相关组织形成或修复, 或者用于预防或治疗免疫性疾病或病情、 自身免 疫性疾病或。
29、病情、 与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、 与T淋巴细胞异常升高有关的 疾病或病情、 红斑狼疮、 或者系统性红斑狼疮。 0059 根据本发明第五方面任一项的组合物, 其中所述的有效量是可以有效地用于预防 或治疗与牙齿相关的疾病或病情的剂量, 或者是要以有效地用于牙齿相关组织形成或修复 的剂量, 或者是要以有效地用于预防或治疗免疫性疾病或病情、 自身免疫性疾病或病情、 与 T 淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、 与 T 淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、 红斑狼 疮、 或者系统性红斑狼疮的剂量。 0060 本发明第五方面及其各子项的特征和优点同样适用于本发明其它任一方面及其 各子项。 006。
30、1 根据本发明上下文的详细记载, 本发明令人满意地实现上上述的各个方面及其各 子项。 0062 下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。 0063 本发明所引述的所有文献, 它们的全部内容通过引用并入本文, 并且如果这些文 献所表达的含义与本发明不一致时, 以本发明的表述为准。此 外, 本发明使用的各种术语 和短语具有本领域技术人员公知的一般含义, 即便如此, 本发明仍然希望在此对这些术语 和短语作更详尽的说明和解释, 提及的术语和短语如有与公知含义不一致的, 以本发明所 表述的含义为准。 0064 本发明人在研究中现出人意料地发现 PDLSCs 等牙齿相关的干细胞不但在自体的 牙齿中使缺。
31、损的牙齿组织再生, 而且能在异体缺损的牙齿组织使牙齿组织再生。本发明基 于上述研究结果得以完成。因此, 本发明涉及牙齿相关干细胞例如 PDLSCs 在制备用于预防 说 明 书 CN 103432007 A 7 6/19 页 8 或治疗牙周病, 牙齿缺损修复的产品中用途 ( 例如图 8 所示 ) ; 还涉及一种预防或治疗牙周 病, 修复缺损牙齿组织的方法, 其包括给予需预防或治疗牙周病或需修复缺损牙齿组织的 宿主以有效预防或治疗量或修复缺损牙齿组织量的牙齿相关干细胞例如 PDLSCs。 0065 此外, 本发明提出生物牙根再生的新理念 ; 利用自体异体 SCAP/DPSCs 和 PDLSCs 再。
32、生出了具有生物学功能的生物牙根, 在新形成的功能性生物牙根上再进行冠的修复, 恢 复患者的咀嚼功能 ( 例如图 10 所示 ) ; 提供生物牙根再生的具体实施方法, 为进一步对生 物牙根再生的机理进行深入研究及生物牙根的商品化提供依据。因此, 本发明涉及生物牙 根再生的新理念, 并涉及 SCAP, DPSCs, PDLSCs 等牙齿相关的干细胞在生物牙根再生中的用 途。本发明还涉及生物牙根再生的具体实施办法, 其中包括牙周膜干细胞膜片的制备及其 所需最佳细胞数及最佳生长时间。 0066 再者, 本发明涉及牙齿相关干细胞例如PDLSCs在制备用于预防或治疗与T淋巴细 胞异常升高有关的疾病或症状的。
33、产品中用途。本发明还涉及一种预防或治疗与 T 淋巴细胞 异常升高有关的疾病或症状的方法, 其包括给予 T 淋巴细胞异常升高的宿主预防或治疗有 效量的牙齿相关干细胞例如 PDLSCs。本发明进一步涉及牙齿相关干细胞例如 SHED 在预防 或治疗系统性红斑狼疮病等自身免疫系统病中用途 ( 例如图 11 所示 )。 0067 根据本发明, 术语 “牙周病” 包括但不限于牙周炎。 0068 根据本发明, 术语 “缺损牙齿组织” 包括但不限于宿主牙齿的各种缺损情况, 如各 种原因引起的牙齿脱落。 0069 根据本发明, 术语 “宿主” 通常指哺乳动物, 包括但不限于人, 猪, 牛, 马等。在一个 实施方。
34、案中, 术语 “宿主” 是指人、 猪 ( 例如五指山小型 猪、 贵州香猪 )、 牛、 马、 猴、 大鼠、 小 鼠、 豚鼠、 羊、 绵羊、 山羊。 0070 根据本发明, 术语 “产品” 是指适于PDLSCs应用的各种形式。 根据本发明, 术语 “产 品” 还指适于牙齿相关干细胞应用的各种形式, 例如组合物、 药物组合物等。 0071 根据本发明, 术语 “与牙齿相关的疾病或病情” 是指本文所述宿主罹患或者表现的 疾病、 病情、 体症、 身体状态等, 这些疾病、 病情、 体症、 身体状态等与牙齿相关。 0072 根据本发明, 术语 “牙齿相关组织形成或修复” 或者术语 “牙齿相关组织的形成或 修。
35、复” 或者 “形成或修复牙齿相关组织” 等, 它们具有相同或近似的含义, 并且通常是指本文 所述宿主的牙齿相关组织进行形成、 修复、 生成、 再生、 培养等处理或操作, 或者对牙齿相关 组织异常 ( 例如缺损 ) 进行形成、 修复、 生成、 再生、 培养等处理或操作。 0073 根据本发明, 术语 “组合物” 是具有本领域技术人员通常理解的含义, 并且通常是 指可接或间接 ( 例如临用前稀释 ) 用于临床使用的形式, 例如剂型、 药物剂型、 给药形式、 等。在临床应用领域或者药物领域, 术语 “组合物” 还通常与 “药物组合物” 具有同等含义。 0074 可改变本发明组合物或药物组合物中牙齿相。
36、关干细胞的实际剂量水平, 以便所得 的干细胞量能有效针对具体宿主、 患者在特定组合物及其组成以及相应给药方式的情况下 得到所需的治疗或预防反应。 剂量水平须根据具体干细胞的活性、 给药途径、 所治疗病况的 严重程度、 疾病或病情的治疗进程、 形成和修复(以及生成、 再生、 培养等)处理或操作的进 程、 以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是, 本领域的做法是, 干细胞的剂量以及 施用时间从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始, 逐渐增加剂量, 直到得到所需的 效果。因此, 就本发明而言, 本领域技术人员在本发明详细公开的信息的教导下, 可以根据 说 明 书 CN 103432007 A 。
37、8 7/19 页 9 例如但不限于上述的具体情况来确定在具体情况下所适用的具体剂量, 而无需要作具体限 定。 特别是, 可以参考本发明实施例部分中所用的具体量来确定任一情况下的使用量, 例如 在本发明下文使用了具体剂量的五指山小型猪 PDLSCs, 本领域技术人员可根据上述剂量并 结合本领域公知技术教导将该剂量换算为人用条件下的剂量。 0075 本发明牙齿相关干细胞可以单独 ( 即以原样形式 ) 或以药物组合物的形式给药。 本发明药物组合物可根据给药途径配成各种适宜的剂型。使用 一种或多种生理学上可接 受的载体, 包含赋形剂和助剂, 它们有利于将牙齿相关干细胞加工成可以在药学上使用的 制剂。 。
38、适当的制剂形式取决于所选择的给药途径, 可以按照本领域熟知的常识进行制造。 在 本发明的一个实施方案中, 所述牙齿相关干细胞存在于细胞相容的介质 ( 例如, 生理盐水 如 0.9% 生理盐水, 等等 ) 中。在本发明的一个实施方案中, 所述牙齿相关干细胞存在于细 胞相容的介质中, 并且在低温下保存, 例如在冷藏、 冷冻等条件下保存, 并且可任选在在临 用前复溶成适用根据本发明精神而施用的形式。 附图说明 0076 图 1. 人 PDLSCs 免疫分子的表达 : 应用流式细胞术检测 fPDLSCs 和 cPDLSCs 相 关 免 疫 分 子 的 表 达。HLA-I,HLA-DR,CD80 和 C。
39、D86 的 表 达 情 况 如 图 所 示 : fPDLSCs(76.2%5.8%,n=5) 和 cPDLSCs(78.5%6.4%,n=5) 表 达 HLA-I,但 是 不 表 达 HLA-DR 和共刺激分子 CD80、 CD86。 0077 图 2.PDLSCs 抑制 T 淋巴细胞增殖 : (a)fPDLSCs/cPDLSC 不会引起同种异体 T 淋巴 细胞增殖。(b)fPDLSCs/cPDLSC 剂量依赖性地抑制丝裂原 PHA 引起的 T 淋巴细胞增殖。(c) 延迟加入 fPDLSCs/cPDLSC 也能够抑制 PHA 引起的 T 淋巴细胞增殖。(d)fPDLSCs/cPDLSC 能 够。
40、抑制双向混合淋巴细胞反应。 0078 图 3.PDLSCs 通过分泌 PGE2 抑制 T 淋巴细胞增殖 : (a) 在 Transwell 培养实验中, PDLSCs 也能抑制 T 淋巴细胞增殖, 提示 PDLSCs 分泌可溶性因子来发挥免疫抑制作用。(b) 在单纯PDLSCs培养上清和MLR上清中都存在TGF-1, 但是两者之间没有显著性差异。 (c) PGE2 的浓度在 MLR 中显著性升高。(d) 中和实验表明抗 TGF-1 抗体没有恢复 T 淋巴细胞 增殖, PGE2 抑制剂抵消了 PDLSCs 的免疫抑制作用 , 提示 PGE2 是介导 PDLSCs 免疫抑制作 用的主要因子。 (e。
41、,f)PDLSCs的免疫抑制作用并没有引起T淋巴细胞的凋亡(e),与单纯用 PHA 刺激 T 淋巴细胞后的凋亡率一致 (f)。(g)PDLSCs 引起的被抑制的 T 淋巴细胞用 PHA 或 者 IL-2 再刺激时可以重新恢复增殖。 0079 图 4.HGF 和 IL-10 的测定 : 在单纯 PDLSCs 培养上清和 MLR 上清中都没有测到 HGF 和 IL-10, 说明这两种因子没有参与 PDLSCs 介导 的免疫抑制作用。 0080 图 5.PDLSCs 介导的牙周组织再生 : (a) 在 -4w 和 0w, 四组的临床指标之间没有显 著性的差异。但是治疗后 12 周 , 自体或者同种异。
42、体 PDLSCs 移植组的 PD,GR 和 AL 与空白 对照组和 HA/TCP 相比显著恢复。(b,c,d,e)CT 扫描显示治疗前都有明显的牙周骨缺损, 而 且缺损程度相近。治疗后 12 周, 自体 PDLSCs 组 (h) 和同种异体 PDLSCs 组 (i) 完全获得了 牙周骨再生。空白对照组几乎没有骨组织再生 (f), 而 HA/TCP 组的骨缺损程度加重 (g). (j,k,l,m) 组织学研究发现自体或者同种异体 PDLSCs 组在骨缺损区有明显的新骨和牙周 组织再生。但是 , 典型的牙周炎表现如深牙周袋、 缺乏新生骨和牙周纤维在 HA/TCP 组和空 说 明 书 CN 1034。
43、32007 A 9 8/19 页 10 白对照组仍然清晰可见。PD: 探诊深度 ,GR: 牙龈退缩 ,AL: 附着丧失 ,D: 牙本质 ,C: 牙骨 质 ,PDL: 牙周膜 ,B: 骨。 0081 图 6. 同种异体 PDLSCs 移植不会引起免疫排斥反应 : (a) 在如图所示的各个时间 点, 同种异体 PDLSCs 移植组的 CD3+,CD4+,CD8+T 淋巴细胞没有显著性差异 ; (b) 在移植后 3 天, CD3+,CD4+,CD8+T 淋巴细胞数目以及活化 T 淋巴细胞的标志物CD40L 的表达情况在 四个治疗组之间没有明显差异。 0082 图 7. 移植后 12w 的免疫状况 :。
44、 在治疗后 12w, CD3+,CD4+,CD8+T 淋巴细胞数目以及 活化 T 淋巴细胞的标志物CD40L 的表达情况在四个治疗组之间也没有明显差异。 0083 图 8. 描绘了本发明的一个实施例中 PDLSCs 介导的牙周组织再生。 0084 图 9. 描绘了在小型猪上成功再生生物牙根。 0085 图 10. 描绘了在小型猪上进行生物牙根再生获得成功。 0086 图 11. 描绘了脱落乳牙牙髓干细胞治疗系统性红斑狼疮鼠血清及肾脏组织学改 变。 0087 图12.说明同种异体人牙周膜干细胞(hPDLSCs)用于治疗牙周病的标准操作的一 个实例。 具体实施方式 0088 通过下面的实施例可以对。
45、本发明进行进一步的描述, 然而, 本发明的范围并不限 于下述实施例。本领域的专业人员能够理解 , 在不背离本发明的精神和范围的前提下 , 可 以对本发明进行各种变化和修饰。 0089 本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和 / 或具体的描述。虽 然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的, 但是本发明仍然在此 作尽可能详细描述。 0090 实施例 1 : PDLSCs 对 T 淋巴细胞增殖的抑制作用 0091 材料和方法 0092 1)、 人 PDLSCs 0093 选取首都医科大学附属北京口腔医院口腔颌面外科门诊拔除的 18-28 岁的健 康患者的正常第三磨牙,。
46、 按照以往文献报道的方法分离和培养 PDLSCs(3)。人体组织的 利用得到首都医科大学伦理委员会的批准。为了下一步实验中应用冻存牙周膜干细胞 (cryopreserved periodontal ligament stem cells, cPDLSCs), 将部分新鲜分离的牙周膜 干细胞 (freshly isolated periodontal ligament stem cells, fPDLSCs) 冻存在液氮中 3 个月。3 个月后, 冻存细胞在 37水浴中快速解冻、 接种、 常规培养。在本研究中, 应用的 细胞都在第 2-4 代。在同一实验中, 应用同一代的 fPDLSCs 和 c。
47、PDLSCs。 0094 2)、 外周血单个核细胞 0095 应用梯度密度离心法分离健康供者的外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)。 0096 3)、 抗体 0097 本 研 究 中 应 用 抗 人 白 细 胞 抗 原 (human leukocyte antigen, HLA)-I、 HLA-DR、 CD80、 CD86 抗体 (BD Biosciences), 抗 CD3、 CD4、 CD8、 CD40L、 转化生长因子 说 明 书 CN 103432007 A 10 9/19 页 11 (transforming gro。
48、wth factor, TGF-)、 肝 细 胞 生 长 因 子 (hepatocyte growth factor, HGF) 抗体 (Abcam), 抗 IL-10、 FITC 标记的抗小鼠 IgG 抗体 (AbD Serotec)。 0098 4)、 流式细胞术 0099 为了研究 PDLSCs 表面相关免疫分子的表达, 将 1.0106fPDLSCs 或者 cPDLSCs 分别与抗 HLA-I、 HLA-DR、 CD80 或者 CD86 抗体室温下孵育 1 小时。经过磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline, PBS) 冲洗后, 细胞再与 FITC 标记的抗小。
49、鼠 IgG 二抗室温下 孵育30分钟。 孵育结束后上流式细胞仪(BD Inmmunocytometry Systems)检测表达情况。 0100 5)、 混合淋巴细胞反应 0101 作为刺激细胞, 5.0104fPDLSCs 或者 cPDLSCs 先在直线加速器下照射 20Gy, 然后 加入等细胞量的同种异体 PBMCs, 在 96 孔板、 0.2mlRPMI-1640 中共同孵育 5 天。在结束反 应前 18 个小时, 每孔加入 1Ci 的 3H-thymidine(3H-TdR)。18 个小时后, 在玻璃纤维滤纸 上收集细胞, 应用液体闪烁仪 (PerkinElmer) 计算 3H-TdR 掺入率。3H-TdR 掺入率的结果以 每分钟计数 标准差 (CPMSD) 来表示。 0102 为了研究 PDLSCs 对增殖 T 。