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1、(10)申请公布号 CN 103450019 A (43)申请公布日 2013.12.18 CN 103450019 A *CN103450019A* (21)申请号 201310426157.6 (22)申请日 2013.09.18 C07C 69/732(2006.01) C07C 67/48(2006.01) C07C 67/58(2006.01) A61K 36/355(2006.01) A61P 1/04(2006.01) A61P 1/06(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 3/06(2006.01) A61P 9/00(2006.01) A61P。
2、 9/10(2006.01) A61P 9/12(2006.01) A61K 133/00(2006.01) A61K 127/00(2006.01) (71)申请人 重庆市中药研究院 地址 400065 重庆市南岸区黄桷垭南山路 34 号 (72)发明人 周兴 李隆云 秦剑 李卿 宋国红 (54) 发明名称 一种从灰毡毛忍冬花蕾和叶中提取纯化活性 成分的方法 (57) 摘要 一种从灰毡毛忍冬花蕾和叶中提取纯化活性 成分的方法， 属于灰毡毛忍冬提取纯化化学活性 成分的技术领域， 本发明先以灰毡毛忍冬叶粉为 原料， 经脱脂、 水提、 萃取及析出、 结晶制得灰毡毛 忍冬活性成分。本发明具有工艺简单。
3、， 节约能源， 无有害废物排放， 资源综合利用率高， 产品纯度高 等特点。采用本发明方法制备出的产品， 可广泛 应用于医药、 保健、 化妆品等行业中。在医药行业 中， 作为合成抗生素、 抗肿瘤、 降压药等的原料， 或 作为抗氧化、 抗菌等功能性添加剂等。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 103450019 A CN 103450019 A *CN103450019A* 1/1 页 2 1. 一种从灰毡毛忍冬花蕾和叶中提取纯化活性成分的方法， 其特征在于 。
4、： 采用降低绿 原酸在溶剂的溶解度的方式提取绿原酸。 2. 根据权利要求 1 所述的从灰毡毛忍冬花蕾和叶中提取纯化活性成分的方法， 其特征 在于 ： 所述方法包括以下步骤 ： 1) 用石油醚或汽油对灰毡毛忍冬花蕾和叶进行脱脂处理 ； 2) 采用乙醇提取灰毡毛忍冬花蕾和叶中的活性成分， 回收提取液乙醇无醇味， 得到提 取水溶液 ； 3) 静置过滤水溶液， 除去杂质， 用乙酸乙酯萃取水溶液， 分别收集乙酸乙酯溶液和母 液 ； 4) 挥去母液中残留的乙酸乙酯， 加热浓缩母液， 至母液温度高于 25无沉淀析出， 低 于 25有沉淀析出 ； 5) 在母液中混入三氯甲烷或四氯甲烷， 迅速搅拌， 形成絮状沉。
5、淀， 至母液中不再产生白 色絮状物质为止 ； 6) 过滤母液中的絮状物质， 纯化结晶絮状物质得到绿原酸晶体。 3. 根据权利要求 2 所述的从灰毡毛忍冬花蕾和叶中提取纯化活性成分的方法， 其特征 在于 ： 将步骤2)得到乙酸乙酯溶液50浓缩成饱和溶液 ； 将饱和溶液自然条件下冷却至低 于 25， 析出沉淀， 过滤沉淀， 沉淀为灰毡毛忍冬花蕾和叶的总黄酮。 4. 根据权利要求 2 所述的从灰毡毛忍冬花蕾和叶中提取纯化活性成分的方法， 其特征 在于 ： 所述在母液中混入三氯甲烷或四氯甲烷为， 添加母液总体及大于 4的氯仿， 并通过 不断的搅拌使氯仿在母液中呈混悬状态， 直至无絮状沉淀析出。 5. 。
6、根据权利要求 2 所述的从灰毡毛忍冬花蕾和叶中提取纯化活性成分的方法， 其特征 在于 ： 步骤 5) 中所述的纯化工艺为 ： 料液比 1 ： 7 在絮状物质中加入水 HCL 调 pH 值至 3， 再 加入等体积的乙酸乙酯， 萃取时间为 4min， 萃取次数为 4 次， 合并萃取液， 按分相剂萃取 液 =0.4， 加入正己烷分液， 取下层水溶液层， 0静置 24h， 过滤 ； 50， 0.09Mp 真空干燥晶 体， 时间 30min， 得白色晶体， 为绿原酸。 权 利 要 求 书 CN 103450019 A 2 1/4 页 3 一种从灰毡毛忍冬花蕾和叶中提取纯化活性成分的方法 技术领域 000。
7、1 本发明涉及植物化学领域中化学成分的提取， 更具体的说涉及一种从灰毡毛忍冬 花蕾和叶中提取纯化活性成分的方法。 技术背景 0002 灰毡毛忍冬是忍冬科忍冬属植物， 具有清热解毒， 凉散风热的功效， 常用于痈肿疔 疮， 喉痹， 丹毒， 热毒血痢， 风热感冒， 温病发热等。 灰毡毛忍冬不仅是常用中药， 而且是一种 “药食同源” 的绿色天然产物， 其含有大量黄酮类化合物、 绿原酸以及皂苷等活性物质。黄 酮类化合物有明显的抗溃疡、 解痉、 抗炎及降血脂等系列的生物活性， 其制备的制剂， 对心 脑血管、 动脉硬化、 高血压等疾病有治疗有价值且长期服用无毒副作用。 绿原酸有对透明质 酸酶及葡萄糖 -6-。
8、 磷酸酶的抑制作用， 对自由基的清除及抗脂质过氧化作用， 抗诱变作用， 保肝利胆作用， 抗菌、 抗病毒、 预防心脑血管疾病及解痉等作用。总皂苷有双向调节免疫作 用 ； 0003 抗缺氧和抗疲劳作用 ； 抗低温应激作用 ； 抗脂质氧化作用 ； 对中枢神经系统的作 用 ； 抗致突变作用等生理活性。同时它们在卫生保健品及化妆品行业方面也有广阔的应用 前景。 在医药和食品上应用广泛， 为合理开发利用这一废弃资源， 所以从灰毡毛忍冬中提取 总黄酮、 绿原酸和总皂苷有很重要的意义。 0004 现有提取纯化灰毡毛忍冬中总黄酮、 绿原酸和总皂苷的方法， 如 吉首大学学报 2011 年 9 月第 32 卷第 5。
9、 期的 “金银花叶茎藤中黄酮与绿原酸同时提取分离工艺” 一文， 公 开的方法是 ： 超声辅助乙醇提取金银花叶茎藤中的绿原酸与黄酮， 乙酸乙酯萃取分离黄酮 与绿原酸， D101 大孔树脂梯度洗脱绿原酸与黄酮， 乙醇及正己烷分相法纯化黄酮与绿原酸。 该方法的主要缺点是 ： 使用大量有机试剂， 没有回收利用， 引起严重的环境污染问题 ； 产品的质量不容易得到保障， 有机试剂容易有残留 ； 产品的纯度不高， 杂质较多， 色泽不 好等 ； 生产仪器的要求较高， 提高了生产成本， 浪费能源不环保 ； 只得到两种产品， 物 料利用不够充分。 0005 吕盼等， 在 成都中医药大学学报 公开了 “同时分离富集。
10、细毡毛忍冬中总黄酮和 绿原酸的工艺研究” 其提供了一种采用聚酰胺树脂吸附柱提取绿原酸和总黄酮的方法 ； 依 次用水、 10乙醇、 30乙醇、 50乙醇、 70乙醇梯度洗脱， 最后确认用 10-30浓度乙醇 洗脱的是绿原酸， 用 50-70洗脱的是总黄酮。 发明内容 0006 采用吸附柱提取绿原酸和总黄酮是目前工业化生产中的常用工艺， 但是不论是大 孔树脂或者聚酰胺树脂提取， 在工业化生产中都涉及到一个不可回避的问题， 就是柱子的 活化， 这需要用大量的酸液和碱液， 这些废水无害化处理难度很大， 及其容易对环境造成损 害。本发明提供的方法避免了吸附柱的使用 ； 解决了植化提取对环境污染的问题。本。
11、发明 的具体发明内容是 ： 说 明 书 CN 103450019 A 3 2/4 页 4 0007 一种从灰毡毛忍冬花蕾和叶中提取纯化活性成分的方法， 采用降低绿原酸在溶剂 的溶解度的方式提取绿原酸。 0008 所述方法包括以下步骤 ： 0009 1) 用石油醚或汽油对灰毡毛忍冬花蕾和叶进行脱脂处理 ； 0010 2) 采用乙醇提取灰毡毛忍冬花蕾和叶中的活性成分， 回收提取液乙醇无醇味， 得 到提取水溶液 ； 0011 3) 静置过滤水溶液， 除去杂质， 用乙酸乙酯萃取水溶液， 分别收集乙酸乙酯溶液和 母液 ； 0012 4) 挥去母液中残留的乙酸乙酯， 加热浓缩母液， 至母液温度高于 25无。
12、沉淀析 出， 低于 25有沉淀析出 ； 0013 5) 在母液中混入三氯甲烷或四氯甲烷， 迅速搅拌， 形成絮状沉淀， 至母液中不再产 生白色絮状物质为止 ； 0014 6) 过滤母液中的絮状物质， 纯化结晶絮状物质得到绿原酸晶体。 0015 将步骤 2) 得到乙酸乙酯溶液 50浓缩成饱和溶液 ； 将饱和溶液自然条件下冷却 至低于 25， 析出沉淀， 过滤沉淀， 沉淀为灰毡毛忍冬花蕾和叶的总黄酮。 0016 所述在母液中混入三氯甲烷或四氯甲烷为， 添加母液总体及大于 4的氯仿， 并通 过不断的搅拌使氯仿在母液中呈混悬状态， 直至无絮状沉淀析出。 0017 步骤 5) 中所述的纯化工艺为 ： 料液。
13、比 1 ： 7 在絮状物质中加入水 HCL 调 pH 值至 3， 再加入等体积的乙酸乙酯， 萃取时间为 4min， 萃取次数为 4 次， 合并萃取液， 按分相剂萃 取液 =0.4， 加入正己烷分液， 取下层水溶液层， 0静置 24h， 过滤 ； 50， 0.09Mp 真空干燥晶 体， 时间 30min， 得白色晶体， 为绿原酸。 0018 本发明的有益技术效果是 ： 本发明提供的方法的工艺成本较低， 绿原酸和总黄酮 提取的转移率高， 更重要的是不采用吸附柱进行分离， 工艺对环境的危害小， 有利于大规模 的工业化生产。 具体实施方式 0019 实施例 1 不同纯化方法对活性成分转移率的影响 00。
14、20 称取灰毡毛忍冬花蕾和叶的混合物1000g， 用60-90石油醚2000、 1500和1500mL 回流 3 次， 每次 30min， 得到预处理药材， 将预处理药材用 3000、 2000 和 2000mL60的乙醇 回流提取， 每次 30min。得到灰毡毛忍冬花蕾和叶提取液， 回收至无醇味， 静置过滤， 将上述 溶液均分为 2 份， 一份为实验组， 另一份为对照组。 0021 对照组的处理 0022 将 500g 聚酰胺以工业乙醇浸泡过夜， 先洗去悬浮的细小粉末， 装柱用 95乙醇洗 脱， 至流出液滴加于水中不产生浑浊， 改用 20 倍 5 NaOH 洗脱， 之后用蒸馏水冲洗至中性， 。
15、再用 20 倍 5盐酸溶液洗， 最后用蒸馏水冲至中性， 备用 ； 0023 参考现有技术的方法， 将对照组提取液以 0.2、 0.4、 0.6、 0.8 和 1.0mL min 的流 速通过色谱柱， 收集过柱液， 测定总黄酮、 绿原酸含量， 计算吸附率。 发现在0.4mLmin， 总 黄酮和绿原酸吸附率分别为 67、 58。 0024 由现有技术的数据得知， 洗脱速率对结果有一定影响， 是 1.5mL min 比较适宜 说 明 书 CN 103450019 A 4 3/4 页 5 的洗脱速度。吸附静置的聚酰胺树脂， 依次用水、 10乙醇、 30乙醇、 50乙醇、 70乙醇 梯度洗脱， 收集各个。
16、洗脱部 400mL( 共 8BV)50ml 每瓶， 不同浓度乙醇洗脱液浓缩到相同体 积， 高效液相法测得 10、 30乙醇洗脱液中绿原酸含量最高， 紫外分光光度法测得 50、 70乙醇洗脱部分总黄酮含量最高， 综合上述结果表明， 总黄酮在 50乙醇洗脱部位， 绿原 酸富集在10乙醇洗脱部位。 两者可以同时富集且分离。 其中在10-30乙醇浓度洗脱时， 绿原酸的洗脱率为 89， 总黄酮的洗脱率为 7， 收集洗脱液回收至干， 粗提物绿原酸的浓 度为 88， 作为对照组绿原酸粗提物 ； 在 50-70乙醇浓度洗脱时， 绿原酸的洗脱率为 2， 总黄酮的洗脱率为 77。 0025 实验组处理 0026 。
17、用800、 400和400mL乙酸乙酯萃取实验组提取液， 得到乙酸乙酯溶液和母液， 经过 检测， 乙酸乙酯溶液中总黄酮的转移率达到 89， 绿原酸的转移率为 3 ； 将乙酸乙酯溶液 回收至干， 50浓缩成饱和溶液 ； 将饱和溶液自然条件下冷却至低于 25， 析出沉淀， 过滤 沉淀， 沉淀为灰毡毛忍冬花蕾和叶的总黄酮 ； 总黄酮的转移率为 57。 0027 将实验组母液分为两份， 分别为实验组母液I和实验组母液II ； 将按实验组母液I 总体积 1、 2、 4、 6的比例向各组母液中添加氯仿， 观察产生沉淀情况， 观察到在氯仿 添加量达到母液总体积的 4时， 不再继续产生沉淀， 过滤沉淀， 将沉。
18、淀烘干， 绿原酸的转移 率为 96， 纯度为 71 ； 作为实验组 I 绿原酸粗提物。 0028 将按实验组母液 II 总体积 1、 2、 4、 6、 8的比例向各组母液中添加四氯 甲烷， 并不断搅拌， 观察产生沉淀情况， 观察到在四氯甲烷添加量达到母液总体积的 6时， 不再继续产生沉淀， 过滤沉淀， 将沉淀烘干， 绿原酸的转移率为91， 纯度为72； 作为实验 组 II 绿原酸粗提物。 0029 分别将实验组 I、 II 绿原酸粗提物和对照组绿原酸粗提物将沉淀按料液比 1 ： 7 在 绿原酸粗品中加入水 HCL 调 pH 值至 3， 再加入等体积的乙酸乙酯， 萃取时间为 4min， 萃取次 。
19、数为 4 次， 合并萃取液， 按分相剂萃取液 =0.4， 加入正己烷分液， 取下层水溶液层， 0静 置 24h， 过滤 ； 50， 0.09Mp 真空干燥晶体， 时间 30min， 得白色晶体， 为绿原酸。称量绿原酸 晶体重量。实验组 I 制备得到纯度大于 98 ( 内标法 ) 的绿原酸 18.25g， 实验组 II 制备 得到纯度大于 98 ( 内标法 ) 的绿原酸 16.14g， 对照组得到纯度大于 98 ( 内标法 ) 的绿 原酸 10.57g。 0030 实施例 2 不同脱脂工艺对活性成分转移率的影响 0031 分别称取灰毡毛忍冬花蕾和叶 4 组， 各 300g， 分别作为石油醚前处理。
20、组 ( 第一 组)， 石油醚后处理组(第二组)、 对照组(第三组)， 用均质机破碎， 各组取10g作绿原酸含 量测定， 余备用 ； 第一组用 1000ml 石油醚在 30 2动态提取 6 小时， 滤出石油醚溶液， 再以800ml石油醚重复提取一次， 滤出石油醚溶液 ； 滤液合并回收石油醚得金银花浸膏。 被 石油醚提取后的金银花 ； 加热回收石油醚后。取出 5g， 在通风柜中挥去残留溶剂作绿原酸 含量测定， 其余部分转入下道工序。 另外， 需要说明的是， 石油醚和汽油的物理性质相近， 都 可以在植化提取中作为脱脂处理的溶剂， 由于在实验室获得汽油受到一定的限制， 所以在 实验中一般采用是石油醚，。
21、 但根据现有技术可知， 对于脱脂是完全可以采用汽油代替石油 醚的。 0032 第一步处理 ： 说 明 书 CN 103450019 A 5 4/4 页 6 0033 本别称取已经处理过的第一组， 第二组和第三组药材各 200g， 分别用 70的乙醇 1000mL、 800mL、 800mL65温浸提取 30min， 分别按组收集提取溶液， 回收乙醇至无醇味， 并 用石油醚 1000mL 和 800mL 萃取， 得到石油醚后处理组的提取溶液， 检测各组中绿原酸和总 黄酮的含量， 并计算个成分相对于原药材中含量的转移率。 0034 第二步处理 ： 0035 在完成时上述处理后， 分别用 800、 。
22、600、 600mL 乙酸乙酯萃取各组的提取溶液， 分 别得到第一组乙酸乙酯萃取液、 母液， 第二组乙酸乙酯萃取液、 母液， 第三组乙酸乙酯萃取 液、 母液 ； 检测各组中绿原酸和总黄酮的含量， 并计算各组相对原药材转移率。 0036 第三步处理 ： 0037 分别在第一、 二、 三组中按实施例 1 所述的方法添加氯仿， 观察形成絮状物质的过 程。 发现， 第一、 二组能够形成絮状沉淀， 第三组无法形成絮状沉淀， 检测絮状物质中绿原酸 含量， 并计算各组相对原药材转移率。具体内容如表 1 所示。 0038 表 1 石油醚处理对灰毡毛忍冬花蕾和叶中绿原酸的提取的影响 0039 0040 0041 在灰毡毛忍冬绿原酸萃取中 . 以石油醚或汽油对其挥发油及其他脂溶性成分进 行先期提取， 对灰毡毛忍冬中绿原酸不产生任何分解作用 ； 不但有助于对灰毡毛忍冬绿原 酸及总黄酮的转移， 更有助于绿原酸的后期纯化。 说 明 书 CN 103450019 A 6 。