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有毒甲藻规模化生产的采收方法.pdf

上传人：t**** 文档编号：859201 上传时间：2018-03-15 格式：PDF 页数：12 大小：534.52KB
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摘要
申请专利号：

CN200910040408.0

 申请日：

2009.06.19
公开号：

CN101586079A

 公开日：

2009.11.25
当前法律状态：

撤回

 有效性：

无权
法律详情：

发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12N 1/12公开日:20091125|||实质审查的生效|||公开
IPC分类号：

C12N1/12; C12R1/89(2006.01)N

 主分类号：

C12N1/12
申请人：

中国科学院南海海洋研究所
发明人：

龙丽娟; 梁计林; 张 偲; 吴 军; 何伟宏; 李庆欣
地址：

510301广东省广州市新港西路164号
优先权：

专利代理机构：

广州粤高专利商标代理有限公司

 代理人：

陈 卫
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内容摘要

本发明公开一种有毒甲藻规模化生产的采收方法，该方法采用絮凝剂KAl(SO4)2·12H2O沉淀有毒甲藻细胞，通过离心收集得到有毒甲藻藻体。本发明对不同种类有毒甲藻提供恰当合适的絮凝剂用量，并结合离心方法，可避免絮凝剂用量过大，细胞破裂内容物毒素外泄，也可避免絮凝剂用量过少细胞沉淀不下来，还可以避免单独使用离心法收集的高投资高能耗问题。本发明采用絮凝剂沉淀甲藻细胞后，选择离心的方法来进一步纯化得到藻泥，离心能提高大规模生产时候的纯化速度，而且能实现大规模生产时对大量沉淀液的纯化。本发明方法可实现安全、高效、大量且细胞完整无破损地采收有毒甲藻，从而达到提取活性次生代谢产物甲藻毒素的目的。

权利要求书

1、  一种有毒甲藻规模化生产的采收方法，其特征在于该方法采用絮凝剂KA1(SO4)2·12H2O沉淀有毒甲藻细胞，对沉淀液进行离心，收集离心沉淀物即得到有毒甲藻藻体。

2、  根据权利要求1所述方法，其特征在于所述絮凝剂KA1(SO4)2·12H2O的用量为每1000ml水体中含0.2～0.35g的KA1(SO4)2·12H2O。

3、  根据权利要求2所述方法，其特征在于，当有毒甲藻为单库里亚藻时，絮凝剂KA1(SO4)2·12H2O的用量为每1000ml水体中含0.3～0.35g的KA1(SO4)2·12H2O。

4、  根据权利要求2所述方法，其特征在于，当有毒甲藻为利玛原甲藻时，其絮凝剂KA1(SO4)2·12H2O的用量为每1000ml水体中含0.2～0.25g的KA1(SO4)2·12H2O。

5、  根据权利要求2所述方法，其特征在于，当有毒甲藻为慢原甲藻时，其絮凝剂KA1(SO4)2·12H2O的用量为每1000ml水体中含0.2～0.25g的KA1(SO4)2·12H2O。

6、  根据权利要求2所述方法，其特征在于，当有毒甲藻为卡氏前沟藻时，其絮凝剂KA1(SO4)2·12H2O的用量为每1000ml水体中含0.25～0.3g的KA1(SO4)2·12H2O。

7、  根据权利要求2所述方法，其特征在于，当有毒甲藻为克氏前沟藻时，其絮凝剂KA1(SO4)2·12H2O的用量为每1000ml水体中含0.2～0.25g的KA1(SO4)2·12H2O。

8、  根据权利要求1所述方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)向有毒甲藻藻液中加入絮凝剂KA1(SO4)2·12H2O；
(2)静置1～2小时后，除去上清水体，收集沉淀液；
(3)将上述沉淀液离心后，弃去上清液，收集底部沉淀物。

9、  根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述步骤(3)中离心的转速为2000～3000r/min，时间为10～15分钟。

说明书

有毒甲藻规模化生产的采收方法
技术领域
本发明涉及藻类采收领域，具体涉及一种有毒甲藻规模化生产的采收方法。
背景技术
海洋甲藻(dinoflagellate)，又称海洋双鞭藻，是主要的海洋赤潮生物之一，甲藻产生的有毒次生代谢产物，又称甲藻毒素。研究表明，甲藻毒素在开发抗癌、镇痛、麻醉、抗病毒、抗菌等各种治疗药以及作为癌症等药理研究工具药方面有着非常广阔的应用前景。
由于自然环境中有毒甲藻的细胞密度非常低，因而毒素原材料的来源困难制约了毒素的进一步深入研究和应用，目前国际市场上毒素种类较少，价格昂贵。甲藻毒素的分子量往往较大，很难进行仿生有机合成，因此从天然环境中分离有毒甲藻获得纯系进行高密度高毒性的规模化培养，收集有毒甲藻藻泥用于分离提取各种毒素成为目前最为常用的途径。
在有毒甲藻的规模化生产过程中，安全高效完整地采收甲藻细胞，防止细胞破裂造成内容物外泄，是分离提取各种毒素的前提和保证。
有毒甲藻为单细胞，个体大小通常在几十微米，最小的只有几微米，绝大多数种类具有由许多小甲片组成的细胞壁，其生活方式为游动的单细胞或由单细胞连成各种形状的群体。海洋中能产生毒素的甲藻约有45-60种，但迄今能够实现人工规模化培养的只有寥寥数种。甲藻的种类不同，生活方式不同，采收方法也不同。
中国专利200510034502提供了一种单细胞藻类的采收方法，该方法是收集单细胞藻类的培养原液并进行粗滤，利用超滤浓缩设备循环过滤，得到所需浓度的单细胞藻类浓缩剂，浓缩后液再进行常规处理，该方法虽然可以实现单细胞藻类的采收，但是过滤步骤复杂，对多个工艺条件需要控制，而且采收过程中需要过滤器等仪器，还需要清洗过滤器。
本发明人之前申请的中国专利03146858给出单细胞有毒甲藻的一个种类-Amphidinium klebsii的纯种分离途径，其中提到用对Amphidinium klebsii的采集方法是先向藻液中加入浓度为0.2～0.35质量‰的絮凝剂[KA1(SO4)2·12H2O]，甲藻细胞沉淀后通过逐级浓缩再用滤膜过滤多余水分收集藻泥。
本发明通过继续研究发现，虽然上述利用絮凝剂沉淀单细胞生活的有毒甲藻，用滤膜过滤收集得到藻泥用于提取各种毒素，不失为一种有效的方法，但由于有毒甲藻不同的种类细胞大小不同，活动能力不同，所需的絮凝剂用量也不同，若絮凝剂用量过小则甲藻细胞不能沉淀或不能完全沉淀，而用量过大则容易造成细胞破裂内容物外泄，既污染环境又达不到提取毒素的目的；而且，逐级浓缩后滤膜过滤收集藻泥只适用于水体较小的室内养殖，当养殖规模较大时滤膜容易堵塞，需要经常收集清理就显得既费时费力又麻烦。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种适合于大规模产业化生产的，可用于采收多种单细胞甲藻种类，且规模化生产过程中能保证安全、高效、无细胞破损的有毒甲藻的采收方法。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
本发明人通过对有毒甲藻规模化生产的采收方法进行试验摸索，结果发现将絮凝剂的使用和离心方法结合起来，可实现发明目的，絮凝剂的加入能够沉淀单细胞生活的有毒甲藻细胞，然后再采用离心方法则可以获得藻泥。絮凝剂和离心方法的结合既可以避免单独使用絮凝剂易导致用量过大，细胞破裂造成内容物甲藻毒素外泄的问题，又解决了规模化生产中单独使用离心法收集的高投资高能耗问题，而且离心方法的运用实现了规模化生产时大批量的采收。
本发明的有毒甲藻规模化生产的采收方法，其包括如下步骤：
(1)向有毒甲藻藻液中加入絮凝剂KA1(SO4)2·12H2O至KA1(SO4)2·12H2O的终浓度为0.2～0.35‰；
(2)静置1～2小时后，除去上清水体，收集沉淀液；
(3)将上述沉淀液离心后，弃去上清液，底部沉淀即为所需藻泥，收集该藻泥保存即可。
上述步骤(1)中，有毒甲藻的收集一般选择在甲藻生长至收获期时进行。
上述步骤(1)中，向藻液中加入絮凝剂的时候，可以边加边搅拌，使藻细胞充分絮凝沉淀。
上述步骤(2)中，将加有絮凝剂的有毒甲藻藻液静置，在静置过程中可用显微镜镜检上层水体，当上层水体中基本无甲藻细胞检出时，排去上清水体，收集沉淀液；如有必要还可以重复步骤(2)。
上述步骤(3)中，离心的作用是对沉淀液的纯化，实际操作时可采用2000～3000r/min的转速，离心10～15分钟，离心后收集底部的沉淀物，即有毒甲藻的细胞，将沉淀物放入冰箱冻存备用。
本发明中对絮凝剂终浓度采用‰单位表示，该单位是“质量体积千分比浓度”，即每1000ml水体中含KA1(SO4)2·12H2O的质量数，如0.2‰的KA1(SO4)2·12H2O，就表示1000ml水体中含0.2g的KA1(SO4)2·12H2O。
本发明人针对不同的有毒甲藻种类的细胞大小不同，活动能力不同，对絮凝剂的要求用量也不同的问题，还进一步地针对有毒甲藻常见的几个种类进行了絮凝剂用量的研究，在上述絮凝剂KA1(SO4)2·12H2O的0.2～0.35‰的用量范围内，提供更有针对性的用量，从而使得有毒甲藻取得更好的采收效果。
当有毒甲藻为单库里亚藻(Coolia monotis)时，KA1(SO4)2·12H2O的用量为0.3～0.35‰；
当有毒甲藻为利玛原甲藻(Prorocentrum lima)时，KA1(SO4)2·12H2O的用量为0.2～0.25‰；
当有毒甲藻为慢原甲藻(Prorocentrum rhathymum)时，KA1(SO4)2·12H2O的用量为0.2～0.25‰；
当有毒甲藻为卡氏前沟藻(也可以称为强壮前沟藻，Am phidiniumcarterae)时，KA1(SO4)2·12H2O的用量为0.25～0.3‰；
当有毒甲藻为克氏前沟藻(Amphidinium klebsii)时，KA1(SO4)2·12H2O的用量为0.2～0.25‰。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明采用絮凝剂和离心两种方法的结合，不但解决了现有技术无法规模化生产的问题，而且能够实现安全、高效、无细胞破碎；
2.有毒甲藻种类不同，其细胞大小不同，活动能力不同，本发明针对不同种类有毒甲藻，提供恰当合适的絮凝剂用量沉淀甲藻细胞，从而避免了絮凝剂用量过多细胞会破裂，其内容物甲藻毒素外泄，污染环境的问题，而且也不会出现絮凝剂用量过少，甲藻细胞沉淀不下来的问题；
3.本发明采用絮凝剂和离心相结合的方法，既可以避免单独使用絮凝剂易导致用量过大，细胞破裂造成内容物甲藻毒素外泄的问题，又解决了规模化生产中单独使用离心法收集的高投资高能耗问题，节约成本；
4.采用本发明的方法可获得充足的藻泥作为原材料制取甲藻毒素；
5.本发明只需要通过简单加入絮凝剂就可以实现藻类细胞的沉淀，无需大型仪器和繁复的工艺控制，成本低廉，操作简单；
6.本发明在絮凝剂沉淀藻类细胞后，选择离心的方法来进一步纯化得到藻泥，离心能提高大规模生产时的纯化速度，而且能实现大规模生产时对大量沉淀液的纯化，而这两点是过滤方法无法实现的，絮凝剂和离心两种方法的结合最终得到大量且细胞完整无破损的藻泥，从而达到提取活性次生代谢产物(甲藻毒素)的目的。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例1  有毒甲藻Coolia monotis的采收
本实施例有毒甲藻Coolia monotis的采收，其具体步骤如下：
(1)待培养水体中有毒甲藻Coolia monotis生长至收获期，在藻液中加入絮凝剂KA1(SO4)2·12H2O至KA1(SO4)2·12H2O的终浓度为0.3质量‰，边加边搅拌，使藻细胞大量沉淀；
(2)静置2小时，显微镜镜检，上层水体基本无甲藻细胞检出，排去上清水体，收集沉淀液；
(3)将上述沉淀液以转速2000r/min的离心速度，离心15分钟，弃去上清液，底部沉淀即为本实施例所需藻泥，收集藻泥置冰箱冷冻备用。
(4)对比试验：KA1(SO4)2·12H2O的终浓度低于0.3‰时，显微镜下可在上层水体中检出零星细胞，终浓度为0.3～0.35‰时基本无细胞检出，KA1(SO4)2·12H2O的终浓度为1.0‰时有变形细胞，终浓度至2.5‰时发现有细胞破碎，基于成本节约、絮凝剂水体残留最低以及细胞完整度等综合因素考虑，选择0.3～0.35‰为KA1(SO4)2·12H2O的终浓度。
甲藻细胞具有细胞壁，为定形细胞，细胞变形意味着内容物有外泄，细胞是否变形、破裂在显微镜下可直接观察到，由此可判断收集的藻泥其细胞是否完整无破裂。
实施例2  有毒甲藻Prorocentrium lima的采收
本实施例有毒甲藻Prorocentrium lima的采收，其具体步骤如下：
(1)待培养水体中有毒甲藻Prorocentrium lima生长至收获期，在藻液中加入絮凝剂KA1(SO4)2·12H2O至KA1(SO4)2·12H2O的终浓度为0.2‰，边加边搅拌，使藻细胞大量沉淀；
(2)静置1小时，显微镜镜检，上层水体基本无甲藻细胞检出，排去上清水体，收集沉淀液；
(3)将上述沉淀液以转速2000r/min的离心速度，离心10分钟，弃去上清液，底部沉淀即为本实施例所需藻泥，收集藻泥置冰箱冷冻备用。
(4)对比试验：KA1(SO4)2·12H2O的终浓度低于0.2‰时，显微镜下可在上层水体中检出零星细胞，终浓度为0.2～0.25‰时基本无细胞检出，KA1(SO4)2·12H2O的终浓度为0.8‰时有变形细胞，终浓度为1.5‰时发现有细胞破碎，基于成本节约、絮凝剂水体残留最低以及细胞完整度等综合因素考虑，选择0.2～0.25‰为KA1(SO4)2·12H2O的终浓度。
实施例3  有毒甲藻Prorocentrum rhathymum的采收
本实施例有毒甲藻Prorocentrum rhathymum的采收，其具体步骤如下：
(1)待培养水体中有毒甲藻Prorocentrum rhathymum生长至收获期，在藻液中加入絮凝剂KA1(SO4)2·12H2O至KA1(SO4)2·12H2O的终浓度为0.25‰，边加边搅拌，使藻细胞大量沉淀；
(2)静置2小时，显微镜镜检，上层水体基本无甲藻细胞检出，排去上清水体，收集沉淀液；
(3)将上述沉淀液以转速2000r/min的离心速度，离心15分钟，弃去上清液，底部沉淀即为本实施例所需藻泥，收集藻泥置冰箱冷冻备用。
(4)对比试验：KA1(SO4)2·12H2O的终浓度低于0.20‰时，显微镜下可在上层水体中检出零星细胞，终浓度为0.20～0.25‰时基本无细胞检出，KA1(SO4)2·12H2O的终浓度为0.8‰时有变形细胞，终浓度为1.5‰时发现有细胞破碎，基于成本节约、絮凝剂水体残留最低以及细胞完整度等综合因素考虑，选择0.2～0.25‰为KA1(SO4)2·12H2O的终浓度。
实施例4  有毒甲藻Amphidinium carterae的采收
本实施例有毒甲藻Amphidinium carterae的采收，其具体步骤如下：
(1)待培养水体中有毒甲藻Amphidinium carterae生长至收获期，在藻液中加入絮凝剂KA1(SO4)2·12H2O至KA1(SO4)2·12H2O的终浓度为0.3质量‰，边加边搅拌，使藻细胞大量沉淀；
(2)静置1小时，显微镜镜检，上层水体基本无甲藻细胞检出，排去上清水体，收集沉淀液；
(3)将上述沉淀液以转速3000r/min的离心速度，离心15分钟，弃去上清液，底部沉淀即为本实施例所需藻泥，收集藻泥置冰箱冷冻备用。
(4)对比试验：KA1(SO4)2·12H2O的终浓度低于0.3‰时，显微镜下可在上层水体中检出零星细胞，终浓度为0.3～0.35‰时基本无细胞检出，KA1(SO4)2·12H2O的终浓度为1.2‰时有变形细胞，终浓度为2.5‰时发现有细胞破碎，基于成本节约、絮凝剂水体残留最低以及细胞完整度等综合因素考虑，选择0.3～0.35‰为KA1(SO4)2·12H2O的终浓度。
实施例5  有毒甲藻Amphidinium klebsii的采收
本实施例有毒甲藻Amphidinium klebsii的采收，其具体步骤如下：
(1)待培养水体中有毒甲藻Amphidinium klebsii生长至收获期，在藻液中加入絮凝剂KA1(SO4)2·12H2O至KA1(SO4)2·12H2O的终浓度为0.2质量‰，边加边搅拌，使藻细胞大量沉淀；
(2)静置2小时，显微镜镜检，上层水体基本无甲藻细胞检出，排去上清水体，收集沉淀液；
(3)将上述沉淀液以转速3000r/min的离心速度，离心10分钟，弃去上清液，底部沉淀即为本实施例所需藻泥，收集藻泥置冰箱冷冻备用。
(4)对比试验：KA1(SO4)2·12H2O的终浓度低于0.2‰时，显微镜下可在上层水体中检出零星细胞，终浓度为0.2～0.25‰时基本无细胞检出，KA1(SO4)2·12H2O的终浓度为1.0‰时有变形细胞，终浓度为2.0‰时发现有细胞破碎，基于成本节约、絮凝剂水体残留最低以及细胞完整度等综合因素考虑，选择0.2～0.25‰为KA1(SO4)2·12H2O的终浓度。
实施例6  收集方法对比试验
本实施例针对两种收集方法进行比较，一种是絮凝剂+过滤，另一种是絮凝剂+离心，其具体步骤如下：
(1)絮凝剂+过滤
a.在藻液中加入KA1(SO4)2·12H2O至终浓度为0.2‰，边加边搅拌；
b.用胶管抽去上清水体，收集沉淀于器皿中并逐级浓缩；
c.把沉淀的部份倒入分液漏斗中静置；
d.放出分液漏斗中的下层沉淀至孔径为400目的筛绢滤网上，滤去多余的水分；
e.用药勺刮取筛绢上的藻泥至收集瓶中放置冰箱中冻存。
(2)絮凝剂+离心
a.在藻液中加入KA1(SO4)2·12H2O至终浓度为0.2‰，边加边搅拌；
b.静置2小时，显微镜镜检，上层水体基本无甲藻细胞检出，排去上清水体，收集沉淀液；
c.将上述沉淀液以转速2000r/min的离心速度，离心10分钟，弃去上清液，收集底部沉淀藻泥置冰箱冷冻备用。
从上述两个方法的步骤可以看出，“絮凝剂+过滤”方法与“絮凝剂+离心”方法相比，操作繁琐，费时费力，一是使用筛绢过滤速度慢，二是筛绢网孔容易堵塞，难以滤清大量水分，三是筛绢上藻泥不易刮取干净，四是过滤过程中筛绢需经常清洗，因此不适合用于大规模生产。

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本发明公开一种有毒甲藻规模化生产的采收方法，该方法采用絮凝剂KAl(SO4)212H2O沉淀有毒甲藻细胞，通过离心收集得到有毒甲藻藻体。本发明对不同种类有毒甲藻提供恰当合适的絮凝剂用量，并结合离心方法，可避免絮凝剂用量过大，细胞破裂内容物毒素外泄，也可避免絮凝剂用量过少细胞沉淀不下来，还可以避免单独使用离心法收集的高投资高能耗问题。本发明采用絮凝剂沉淀甲藻细胞后，选择离心的方法来进一步纯化得到藻泥。

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