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筛选ε-聚赖氨酸产生菌的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵工程领域，具体地说，本发明涉及一种ε-聚赖氨酸产生菌的筛选方法。
背景技术
随着人们生活水平的日益提高以及对食品安全性的认识和要求的逐步提高，化学防腐剂受到严峻挑战，食品防霉防腐剂的天然化已成为今后的发展趋势。天然食品防腐剂可分为微生物源防腐剂、动物源和植物源防腐剂。微生物食品防腐剂是指通过微生物发酵的方法，从发酵液中提取分离得到的有抑菌作用的物质。目前，国际上批准使用的微生物食品防腐剂仅有乳酸链球菌素、纳他霉素和ε-聚赖氨酸。乳酸链球菌素能有效抑制引起食品腐败的许多革兰氏阳性细菌，而对革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌无效；而pH值、温度、光照、氧化物及重金属对纳他霉素的稳定性影响较大，因此在一定程度上限制了它们的应用。
ε-聚赖氨酸(ε-polylysine)是由微生物合成的L-赖氨酸同聚物，由ε-氨基与α-羧基通过肽键连接而成，其聚合度一般为25～35。它是日本酒井平一和岛昭二两位博士大量筛选有价值的放线菌时发现的一种新型聚合物，进一步研究发现其具有强烈的抑菌能力，可以作为防腐剂用于食品的保鲜。作为新型的天然防腐剂，ε-聚赖氨酸已于2003年10月被FDA批准为安全食品保鲜剂。除了作为食品防腐剂，ε-聚赖氨酸的应用已拓展至医学、化妆品及高吸水性材料等。日本窒素公司已将ε-聚赖氨酸的微生物发酵实现工业化，年产千吨ε-聚赖氨酸的现代化工业装置已建成投产，市场规模达数十亿日元。但国内还处于实验室研发阶段，ε-聚赖氨酸产生菌的筛选方法十分复杂，传统的方法是从土壤中筛选，通过平板分离，获得纯培养物，然后对每个纯培养物进行摇瓶发酵，从发酵液中检验是否成德拉根道夫(+)反应，再通过液相色谱的方法进一步验证。这样的筛选方法存在着筛选目标不确定、工作量大、周期长、筛选效率低等缺点。2002年，Nishikawa等人采用一种简便的方法筛选土壤中ε-聚赖氨酸产生菌，在SG培养基中加入0.002％碱性染料美蓝，ε-聚赖氨酸与染料通过静电作用而在平板上形成肉眼可见的特殊透明圈，从而简化了筛选过程。但这种方法仍存在很多不足，美兰对ε-聚赖氨酸产生菌有很大的抑制作用，而且周期长。
发明内容
针对上述现有技术的缺陷，本发明提供一种直观、简单、快速的ε-聚赖氨酸产生菌的筛选方法，该方法能克服传统筛选方法的不足，可高效直观地将ε-聚赖氨酸产生菌与其他微生物区分开来。本发明工艺简单、工作量小、周期短、筛选效率较高。
本发明的技术方案如下：
提供一种筛选ε-聚赖氨酸产生菌的方法，该方法包括在培养基中添加带电荷的指示剂的步骤，所述带电荷的指示剂不是美蓝。
发明方法的原理是：ε-聚赖氨酸带有很多正电荷，遇到带负电荷的指示剂时，由于静电作用异性相吸，因此形成色素聚集圈；而遇到带正电荷的指示剂时，由于静电作用同性排斥，因此形成色素透明圈，从而，通过在培养基中添加带电荷的指示剂，可以选择性地从不同样品材料中筛选ε-聚赖氨酸产生菌。
所述带电荷的指示剂可以选自带负电荷的苋菜红、诱惑红、亮蓝、柠檬黄、溴酚兰或带正电荷的中性红。
上述指示剂中，最优选的是中性红。
本发明方法中，所述带电荷的指示剂优选以配制成溶液的形式加入培养基中。指示剂的浓度要适宜。如果指示剂的浓度太低，形成的聚集圈或透明圈不清晰明显；但如果浓度太高，又会因为一定的毒性作用而抑制菌体生长。因此须确定合适的指示剂浓度，以此形成的聚集圈或透明圈既清晰明显又不会对菌体的生长造成很大的抑制。
培养基中通常还加入K₂Cr₂O₇溶液。由于土壤中除了放线菌外还有很多其他种类的菌，而ε-聚赖氨酸产生菌通常是放线菌，因此K₂Cr₂O₇溶液作为选择性分离放线菌的抑制剂。
从目测效果和抑制程度方面考虑，发明人根据试验结果，确定带负电荷的指示剂中，苋菜红的浓度可以是0.002％～0.012％；诱惑红的浓度可以是0.002％～0.010％；亮蓝的浓度可以是0.002％～0.010％；柠檬黄的浓度可以是0.002％～0.010％；溴酚兰的浓度可以是0.002％～0.010％。
而带正电荷的中性红的浓度可以是0.0005％～0.0025％，优选0.0015％。
本发明方法所得的ε-聚赖氨酸粗品对细菌、放线菌和酵母菌都有明显的抑菌作用，其中对枯草芽孢杆菌的抑制最强。
发明人对溴酚兰、百里酚蓝、溴百里酚蓝、中性红、甲基红、酚红、甲酚红、酚酞、百里酚酞、亮蓝、柠檬黄、诱惑红和苋菜红等带电荷的指示剂做了研究。本发明方法的指示剂浓度的确定过程如下：
SG固体培养基的组成是(g/L)：甘油10，琼脂20，酵母膏0.10，NaH₂PO₄·2H₂O 0.884，MgSO₄·7H₂O 0.25，(NH₄)₂SO₄ 0.66，痕量矿物溶液140ml，水860ml，其中pH为7.0。
所述痕量矿物溶液的组成是(g/L)：NaCl 1，FeSO₄·7H₂O 0.1，CaCl₂·2H₂O 0.1，明矾0.01，CuSO₄·5H₂O 0.01，CoCl₂·6H₂O 0.1，H₃BO₃ 0.01，ZnSO₄·7H₂O 0.1，NH₄Mo₇O₂₄·4H₂O 0.01)。
指示剂溶液的配制：
0.1％溴酚兰：准确称取0.1克溴酚兰溶于100ml 20％乙醇；
0.1％百里酚蓝：准确称取0.1克百里酚蓝溶于100ml 20％乙醇；
0.05％溴百里酚蓝：准确称取0.05克溴百里酚蓝溶于100ml 20％乙醇；
0.1％中性红：准确称取0.1克中性红溶于100ml 60％乙醇；
0.2％甲基红：准确称取0.2克甲基红溶于100ml 60％乙醇；
0.1％酚红：准确称取0.1克酚红溶于100ml 20％乙醇；
0.1％甲酚红：准确称取0.1克甲酚红溶于100ml 50％乙醇；
0.1％酚酞：准确称取0.1克酚酞溶于100ml 60％乙醇；
0.1％百里酚酞：准确称取0.1克百里酚酞溶于100ml 90％乙醇；
0.8％亮蓝：准确称取0.8克溴酚兰溶于100ml无菌蒸馏水；
0.8％柠檬黄：准确称取0.8克溴酚兰溶100ml于无菌蒸馏水；
0.8％诱惑红：准确称取0.8克溴酚兰溶于100ml无菌蒸馏水；
0.8％苋菜红：准确称取0.8克溴酚兰溶于100ml无菌蒸馏水。
将SG固体培养基121℃灭菌20min，灭菌后，待温度降至60℃左右时加入上述各指示剂溶液，使其终浓度均达0.002％，混匀后倒入90mm平板，制成各指示剂平板。
将ε-聚赖氨酸标准品配制成浓度为1g/L，并用无菌过滤膜过滤。灭菌后的牛津杯放置各指示剂平板中，牛津杯中加入200ul浓度为1g/L的ε-聚赖氨酸标准品溶液及对照无菌水。室温下放置，1天后观察平板。由于ε-聚赖氨酸是聚阳离子化合物，带有很多正电荷，可以与带电荷的指示剂发生静电作用，在平板上显现特殊现象，如表1所列。
表1

  指示剂  苋菜红  诱惑红  柠檬黄  亮蓝  溴酚兰  中性红  特殊现象  色素聚  集圈  色素聚  集圈  色素聚  集圈  色素聚  集圈  色素聚  集圈  色素透明圈  清晰度  ++++  ++++  ++++  ++++  ++++  +++++
实验结果表明：在苋菜红、诱惑红、亮蓝、柠檬黄、溴酚兰平板上，装有ε-聚赖氨酸标准品的牛津杯周围形成一个清晰明显的色素聚集圈，因为ε-聚赖氨酸带有很多正电荷，而苋菜红、诱惑红、亮蓝、柠檬黄、溴酚兰带负电荷，由于静电作用异性相吸，故形成色素聚集圈；而在中性红平板上，装有ε-聚赖氨酸标准品的牛津杯周围形成一个清晰明显的色素透明圈，因为ε-聚赖氨酸带有很多正电荷，而中性红带正电荷，由于静电作用同性排斥，故形成色素透明圈。在所有指示剂平板中装有无菌水的牛津杯周围没有聚集圈及透明圈的形成。
发明人还发现，采用例如百里酚蓝、溴百里酚蓝、甲基红、酚红、甲酚红、酚酞或百里酚酞等指示剂，也能在平板上形成色素聚集圈，但不够清晰，因为百里酚蓝、溴百里酚蓝、甲基红、酚红、甲酚红、酚酞、百里酚酞的解离程度很小，带负电荷少，因此形成的色素聚集圈不够清晰。
因此，本发明选择苋菜红、诱惑红、亮蓝、柠檬黄、溴酚兰或中性红作为筛选模型的指示剂。指示剂的浓度太低，形成的聚集圈或透明圈不清晰明显，但浓度太高，又会因为一定的毒性作用而抑制菌体生长。因此须确定合适的指示剂浓度，以此形成的聚集圈或透明圈既清晰明显又不会对菌体的生长造成很大的抑制。
将SG固体培养基121℃灭菌20min，灭菌后，待温度降至60℃左右时分别加入苋菜红、诱惑红、亮蓝、柠檬黄、溴酚兰指示剂溶液，使其终浓度为0.001～0.015％，加入中性红指示剂溶液，使其终浓度为0.0002～0.0040％，混匀后倒入90mm平板，制成各浓度各指示剂的平板。
将菌株S.albulus KCTC 9669斜面孢子用无菌水洗涤，制成孢子悬浮液，经一系列稀释后涂布上述各浓度各指示剂平板。根据平板上的菌株生长情况以及菌落数确定添加指示剂的浓度。试验结果如下表2、3、4、5、6所示。其中作为对照的0.002％美蓝对菌的抑制率为91.8％，菌第九天生长。
表2中性红浓度的确定
  中性红浓  度(％)  0.0002  0.0005  0.0010  0.0015  0.0020  0.0025  0.0030  0.0035  0.0040  透明圈清  晰程度  +-  ++  ++  +++  +++  +++  +++  +++  +++  菌体生长  情况  第三天  生长  第四天  生长  第四天  生长  第四天  生长  第四天  生长  第四天  生长  第五天  生长  第五  天生  长  第六天  生长  抑制率  (％)  1.58  3.76  5.54  13.28  26.59  37.52  56.81  67.41  73.41
结果表明：当中性红的浓度为0.0005％～0.0025％时，透明圈清晰明显，而且对菌体的毒性作用小。
表3苋菜红浓度的确定
  苋菜红  浓度(％)  0.001  0.002  0.003  0.004  0.005  0.007  0.010  0.012  0.015  透明圈  清晰程  度  +-  ++  +++  +++  +++  +++  +++  +++  +++  菌体生  长情况  第三  天生  长  第三  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第五  天生  长  抑制率  (％)  2.78  5.61  8.43  10.75  15.94  21.03  28.42  32.89  58.47
结果表明：当苋菜红的浓度为0.002％～0.012％时，透明圈清晰明显，而且对菌体的毒性作用小。
表4诱惑红浓度的确定
  诱惑红  浓度(％)  0.001  0.002  0.003  0.004  0.005  0.007  0.010  0.012  0.015  透明圈  清晰程  度  +-  ++  +++  +++  +++  +++  +++  +++  +++  菌体生  长情况  第三  天生  长  第三  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第五  天生  长  抑制率  (％)  3.94  8.67  14.66  18.61  20.49  24.30  30.72  43.26  57.11
结果表明：当诱惑红的浓度为0.002％～0.010％时，透明圈清晰明显而且对菌体的毒性作用小。
表5柠檬黄浓度的确定
  柠檬黄  浓度(％)  0.001  0.002  0.003  0.004  0.005  0.007  0.010  0.012  0.015  透明圈  清晰程  度  +-  ++  +++  +++  +++  +++  +++  +++  +++  菌体生  长情况  第三  天生  长  第三  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第五  天生  长  抑制率  (％)  5.14  8.23  15.31  18.77  22.18  26.84  34.18  46.26  60.51
结果表明：当柠檬黄的浓度为0.002％～0.010％时，透明圈清晰明显，而且对菌体的毒性作用小。
表6亮蓝浓度的确定
  亮蓝浓  度(％)  0.001  0.002  0.003  0.004  0.005  0.007  0.010  0.012  0.015  透明圈  清晰程  度  +-  ++  +++  +++  +++  +++  +++  +++  +++  菌体生  长情况  第三  天生  长  第三  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第四  天生  长  第五  天生  长  抑制率  (％)  3.84  9.10  13.14  18.64  23.49  29.67  37.11  41.97  65.32
结果表明：当亮蓝的浓度为0.002％～0.010％时，透明圈清晰明显，而且对菌体的毒性作用小。
表7溴酚兰浓度的确定
  溴酚兰浓  度(％)  0.001  0.002  0.003  0.004  0.005  0.007  0.010  0.012  0.015  透明圈清  晰程度  +-  ++  +++  +++  +++  +++  +++  +++  +++  菌体生长  情况  第四  天生  长  第四  天生  长  第五  天生  长  第五  天生  第五  天生  长  第五  天生  长  第五  天生  长  第六  天生  长  第六  天生  长  抑制率  (％)  5.77  8.76  13.58  17.16  22.84  26.91  35.37  49.37  68.17
结果表明：当溴酚兰的浓度为0.002％～0.010％时，透明圈清晰明显，而且对菌体的毒性作用小。
本发明方法的具体操作过程如下：
(1)产正电物质菌株的筛选
土壤样品中加入灭菌蒸馏水，过滤后进行一系列稀释。将SG固体培养基121℃灭菌20min，待温度降至60℃左右时分别加入配制好的指示剂溶液和K₂Cr₂O₇溶液，混匀后制成平板。
将稀释后的土壤样品涂至上述平板，30℃培养。培养4天后，由于指示剂可以和微生物分泌出来的正电聚合物在平板上形成独特的聚集圈或透明圈，因此可以产正电物质的菌株周围形成了一个聚集圈或透明圈，不产正电物质的菌株则没有该现象，因此可以很灵敏地把产正电物质的菌株筛选出来。
(2)产生物碱菌株的确定
分离得到的产正电物质的菌株接于斜面中，培养5天。取一环孢子接种到装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30℃培养3天。用Dragendorff试剂对发酵液进行检测，有两株菌对Dragendorff反应呈阳性。
(3)产物组成成分的鉴定
将2株生物碱呈阳性的菌株的发酵液进行提取，得到粗品，将粗品和ε-聚赖氨酸标准品装入安瓿管中，加入6mol/L HCl密封，于121℃水解24小时，用薄层层析法分析组成成分。薄层层析条件为：硅胶60铺板，展开剂为正丁醇∶冰醋酸∶吡啶∶水＝4∶1∶1∶2(体积比)；显色剂为茚三酮。菌株发酵液的粗品和ε-聚赖氨酸标准品在此展开剂中停留在薄层原位点，但与茚三酮反应呈阳性，而菌株发酵液的粗品和ε-聚赖氨酸标品的盐酸水解液，展开后只有一个斑点，其斑点位置与L-赖氨酸标品溶液的斑点一致，说明菌株发酵液的粗品为单一L-赖氨酸的聚合物。
相对于用0.002％美蓝作为指示剂筛选ε-聚赖氨酸产生菌，本发明的筛选方法可高效直观地将ε-聚赖氨酸产生菌与其他微生物区分开来，本发明工艺简单、工作量小、周期短、筛选效率较高。
附图说明
图1是以中性红为指示剂的平板上形成的透明圈；
图2是以苋菜红为指示剂的平板上形成的聚集圈；
图3是以诱惑红为指示剂的平板上形成的聚集圈；
图4是以亮蓝为指示剂的平板上形成的聚集圈；
图5是以柠檬黄为指示剂的平板上形成的聚集圈；
图6是以溴酚兰为指示剂的平板上形成的聚集圈。
具体实施方式
实施例1
(1)产正电物质菌株的筛选
1g土壤样品中加入10ml灭菌蒸馏水，过滤后进行一系列稀释。将SG固体培养基121℃灭菌20min，待温度降至60℃左右时加入中性红溶液(终浓度0.0015％)+K₂Cr₂O₇(终浓度50mg/ml)，混匀后制成平板。
将稀释后的土壤样品涂至上述平板，30℃培养。培养4天后，由于中性红可以和微生物分泌出来的正电聚合物在平板上形成独特的透明圈，因此可以产正电物质的菌株周围形成了一个透明圈，不产正电物质的菌株则没有该现象，因此可以很灵敏地把产正电物质的菌株筛选出来。
(2)产生物碱菌株的确定
分离得到的产正电物质的菌株接于斜面中，培养5天。取一环孢子接种到装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30℃培养3天。用Dragendorff试剂对发酵液进行检测，有两株菌对Dragendorff反应呈阳性。
(3)产物组成成分的鉴定
将2株生物碱呈阳性的菌株的发酵液进行提取，得到粗品，将粗品和ε-聚赖氨酸标准品装入安瓿管中，加入6mol/L HCl密封，于121℃水解24小时，用薄层层析法分析组成成分。薄层层析条件为：硅胶60铺板，展开剂为正丁醇∶冰醋酸∶吡啶∶水＝4∶1∶1∶2(体积比)；显色剂为茚三酮。菌株发酵液的粗品和ε-聚赖氨酸标准品在此展开剂中停留在薄层原位点，但与茚三酮反应呈阳性，而菌株发酵液的粗品和ε-聚赖氨酸标品的盐酸水解液，展开后只有一个斑点，其斑点位置与L-赖氨酸标品溶液的斑点一致，说明菌株发酵液的粗品为单一L-赖氨酸的聚合物。
将菌株发酵所得的发酵液，利用圆滤纸片法对枯草芽孢杆菌、滕黄八叠球菌和毕赤酵母菌进行抑菌效果的研究。所得的ε-聚赖氨酸粗品对此三种菌都有明显的抑菌作用，其中对枯草芽孢杆菌的抑制最强。
实施例2
(1)产正电物质菌株的筛选
1g土壤样品中加入10ml灭菌蒸馏水，过滤后进行一系列稀释。将SG固体培养基121℃灭菌20min，待温度降至60℃左右时加入苋菜红溶液(终浓度0.005％)+K₂Cr₂O₇(终浓度50mg/ml)，混匀后制成平板。
将稀释后的土壤样品涂至上述平板，30℃培养。培养4天后，由于苋菜红可以和微生物分泌出来的正电聚合物在平板上形成独特的聚集圈，因此可以产正电物质的菌株周围形成了一个聚集圈，不产正电物质的菌株则没有该现象，因此可以很灵敏地把产正电物质的菌株筛选出来。
(2)产生物碱菌株的确定
分离得到的产正电物质的菌株接于斜面中，培养5天。取一环孢子接种到装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30℃培养3天。用Dragendorff试剂对发酵液进行检测，有两株菌对Dragendorff反应呈阳性。
(3)产物组成成分的鉴定
将2株生物碱呈阳性的菌株的发酵液进行提取，得到粗品，将粗品和ε-聚赖氨酸标准品装入安瓿管中，加入6mol/L HCl密封，于121℃水解24小时，用薄层层析法分析组成成分。薄层层析条件为：硅胶60铺板，展开剂为正丁醇∶冰醋酸∶吡啶∶水＝4∶1∶1∶2(体积比)；显色剂为茚三酮。菌株发酵液的粗品和ε-聚赖氨酸标准品在此展开剂中停留在薄层原位点，但与茚三酮反应呈阳性，而菌株发酵液的粗品和ε-聚赖氨酸标品的盐酸水解液，展开后只有一个斑点，其斑点位置与L-赖氨酸标品溶液的斑点一致，说明菌株发酵液的粗品为单一L-赖氨酸的聚合物。
将菌株发酵所得的发酵液，利用圆滤纸片法对枯草芽孢杆菌、滕黄八叠球菌和毕赤酵母菌进行抑菌效果的研究。所得的ε-聚赖氨酸粗品对此三种菌都有明显的抑菌作用，其中对枯草芽孢杆菌的抑制最强。
实施例3
(1)产正电物质菌株的筛选
1g土壤样品中加入10ml灭菌蒸馏水，过滤后进行一系列稀释。将SG固体培养基121℃灭菌20min，待温度降至60℃左右时加入诱惑红溶液(终浓度0.005％)+K₂Cr₂O₇(终浓度50mg/ml)，混匀后制成平板。
将稀释后的土壤样品涂至上述平板，30℃培养。培养4天后，由于诱惑红可以和微生物分泌出来的正电聚合物在平板上形成独特的聚集圈，因此可以产正电物质的菌株周围形成了一个聚集圈，不产正电物质的菌株则没有该现象，因此可以很灵敏地把产正电物质的菌株筛选出来。
(2)产生物碱菌株的确定
分离得到的产正电物质的菌株接于斜面中，培养5天。取一环孢子接种到装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30℃培养3天。用Dragendorff试剂对发酵液进行检测，有两株菌对Dragendorff反应呈阳性。
(3)产物组成成分的鉴定
将2株生物碱呈阳性的菌株的发酵液进行提取，得到粗品，将粗品和ε-聚赖氨酸标准品装入安瓿管中，加入6mol/L HCl密封，于121℃水解24小时，用薄层层析法分析组成成分。薄层层析条件为：硅胶60铺板，展开剂为正丁醇∶冰醋酸∶吡啶∶水＝4∶1∶1∶2(体积比)；显色剂为茚三酮。菌株发酵液的粗品和ε-聚赖氨酸标准品在此展开剂中停留在薄层原位点，但与茚三酮反应呈阳性，而菌株发酵液的粗品和ε-聚赖氨酸标品的盐酸水解液，展开后只有一个斑点，其斑点位置与L-赖氨酸标品溶液的斑点一致，说明菌株发酵液的粗品为单一L-赖氨酸的聚合物。
将菌株发酵所得的发酵液，利用圆滤纸片法对枯草芽孢杆菌、滕黄八叠球菌和毕赤酵母菌进行抑菌效果的研究。所得的ε-聚赖氨酸粗品对此三种菌都有明显的抑菌作用，其中对枯草芽孢杆菌的抑制最强。
实施例4
(1)产正电物质菌株的筛选
1g土壤样品中加入10ml灭菌蒸馏水，过滤后进行一系列稀释。将SG固体培养基121℃灭菌20min，待温度降至60℃左右时加入柠檬黄溶液(终浓度0.005％)+K₂Cr₂O₇(终浓度50mg/ml)，混匀后制成平板。
将稀释后的土壤样品涂至上述平板，30℃培养。培养4天后，由于柠檬黄可以和微生物分泌出来的正电聚合物在平板上形成独特的聚集圈，因此可以产正电物质的菌株周围形成了一个聚集圈，不产正电物质的菌株则没有该现象，因此可以很灵敏地把产正电物质的菌株筛选出来。
(2)产生物碱菌株的确定
分离得到的产正电物质的菌株接于斜面中，培养5天。取一环孢子接种到装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30℃培养3天。用Dragendorff试剂对发酵液进行检测，有两株菌对Dragendorff反应呈阳性。
(3)产物组成成分的鉴定
将2株生物碱呈阳性的菌株的发酵液进行提取，得到粗品，将粗品和ε-聚赖氨酸标准品装入安瓿管中，加入6mol/L HCl密封，于121℃水解24小时，用薄层层析法分析组成成分。薄层层析条件为：硅胶60铺板，展开剂为正丁醇∶冰醋酸∶吡啶∶水＝4∶1∶1∶2(体积比)；显色剂为茚三酮。菌株发酵液的粗品和ε-聚赖氨酸标准品在此展开剂中停留在薄层原位点，但与茚三酮反应呈阳性，而菌株发酵液的粗品和ε-聚赖氨酸标品的盐酸水解液，展开后只有一个斑点，其斑点位置与L-赖氨酸标品溶液的斑点一致，说明菌株发酵液的粗品为单一L-赖氨酸的聚合物。
将菌株发酵所得的发酵液，利用圆滤纸片法对枯草芽孢杆菌、滕黄八叠球菌和毕赤酵母菌进行抑菌效果的研究。所得的ε-聚赖氨酸粗品对此三种菌都有明显的抑菌作用，其中对枯草芽孢杆菌的抑制最强。
实施例5
(1)产正电物质菌株的筛选
1g土壤样品中加入10ml灭菌蒸馏水，过滤后进行一系列稀释。将SG固体培养基121℃灭菌20min，待温度降至60℃左右时加入亮蓝溶液(终浓度0.005％)+K₂Cr₂O₇(终浓度50mg/ml)，混匀后制成平板。
将稀释后的土壤样品涂至上述平板，30℃培养。培养4天后，由于亮蓝可以和微生物分泌出来的正电聚合物在平板上形成独特的聚集圈，因此可以产正电物质的菌株周围形成了一个聚集圈，不产正电物质的菌株则没有该现象，因此可以很灵敏地把产正电物质的菌株筛选出来。
(2)产生物碱菌株的确定
分离得到的产正电物质的菌株接于斜面中，培养5天。取一环孢子接种到装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30℃培养3天。用Dragendorff试剂对发酵液进行检测，有两株菌对Dragendorff反应呈阳性。
(3)产物组成成分的鉴定
将2株生物碱呈阳性的菌株的发酵液进行提取，得到粗品，将粗品和ε-聚赖氨酸标准品装入安瓿管中，加入6mol/L HCl密封，于121℃水解24小时，用薄层层析法分析组成成分。薄层层析条件为：硅胶60铺板，展开剂为正丁醇∶冰醋酸∶吡啶∶水＝4∶1∶1∶2(体积比)；显色剂为茚三酮。菌株发酵液的粗品和ε-聚赖氨酸标准品在此展开剂中停留在薄层原位点，但与茚三酮反应呈阳性，而菌株发酵液的粗品和ε-聚赖氨酸标品的盐酸水解液，展开后只有一个斑点，其斑点位置与L-赖氨酸标品溶液的斑点一致，说明菌株发酵液的粗品为单一L-赖氨酸的聚合物。
将菌株发酵所得的发酵液，利用圆滤纸片法对枯草芽孢杆菌、滕黄八叠球菌和毕赤酵母菌进行抑菌效果的研究。所得的ε-聚赖氨酸粗品对此三种菌都有明显的抑菌作用，其中对枯草芽孢杆菌的抑制最强。
实施例6
(1)产正电物质菌株的筛选
1g土壤样品中加入10ml灭菌蒸馏水，过滤后进行一系列稀释。将SG固体培养基121℃灭菌20min，待温度降至60℃左右时加入溴酚兰溶液(终浓度0.005％)+K₂Cr₂O₇(终浓度50mg/ml)，混匀后制成平板。
将稀释后的土壤样品涂至上述平板，30℃培养。培养4天后，由于溴酚兰可以和微生物分泌出来的正电聚合物在平板上形成独特的聚集圈，因此可以产正电物质的菌株周围形成了一个聚集圈，不产正电物质的菌株则没有该现象，因此可以很灵敏地把产正电物质的菌株筛选出来。
(2)产生物碱菌株的确定
分离得到的产正电物质的菌株接于斜面中，培养5天。取一环孢子接种到装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30℃培养3天。用Dragendorff试剂对发酵液进行检测，有两株菌对Dragendorff反应呈阳性。
(3)产物组成成分的鉴定
将2株生物碱呈阳性的菌株的发酵液进行提取，得到粗品，将粗品和ε-聚赖氨酸标准品装入安瓿管中，加入6mol/L HCl密封，于121℃水解24小时，用薄层层析法分析组成成分。薄层层析条件为：硅胶60铺板，展开剂为正丁醇∶冰醋酸∶吡啶∶水＝4∶1∶1∶2(体积比)；显色剂为茚三酮。菌株发酵液的粗品和ε-聚赖氨酸标准品在此展开剂中停留在薄层原位点，但与茚三酮反应呈阳性，而菌株发酵液的粗品和ε-聚赖氨酸标品的盐酸水解液，展开后只有一个斑点，其斑点位置与L-赖氨酸标品溶液的斑点一致，说明菌株发酵液的粗品为单一L-赖氨酸的聚合物。
将菌株发酵所得的发酵液，利用圆滤纸片法对枯草芽孢杆菌、滕黄八叠球菌和毕赤酵母菌进行抑菌效果的研究。所得的ε-聚赖氨酸粗品对此三种菌都有明显的抑菌作用，其中对枯草芽孢杆菌的抑制最强。