聚乙二醇化重组人干扰素Ω偶合物.pdf

本发明公开了聚乙二醇化重组人干扰素ω偶合物及其制备工艺，相比未修饰的人干扰素ω，在人体内具有更长的半衰期，能够明显减少用药次数，降低毒副作用，特别适合于治疗对干扰素ω敏感的慢性病毒感染，临床上具有广泛的应用前景。

1、  一种聚乙二醇化人干扰素ω偶合物，相比于未结合的人干扰素ω，具有更长的生物体内半衰期，保留至少10％的抗病毒生物学活性，其中每个人干扰素ω(hIFN-ω)以共价键连接一分子的聚乙二醇，聚乙二醇分子量在5000～40000之间。

2、  根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化人干扰素ω偶合物，其中人干扰素ω是重组的；

3、  根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化人干扰素ω偶合物，其中人干扰素ω是通过N末端氨基共价键与聚乙二醇连接。

4、  根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化人干扰素ω偶合物，其中人干扰素ω是通过赖氨酸的氨基与聚乙二醇连接。

5、  根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化人干扰素ω偶合物，其中人干扰素ω是通过半胱氨酸的巯基与聚乙二醇连接。

6、  根据权利要求1所述的聚乙二醇化人干扰素ω偶合物，其特征在于：每个聚乙二醇分子连接一个重组人干扰素ω(hIFN-ω)分子。

7、  根据权利要求1所述的聚乙二醇化人干扰素ω偶合物，其中PEG是线形的；

8、  根据权利要求1所述的聚乙二醇化人干扰素ω偶合物，其中PEG是分支的；

9、  根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组人干扰素ω偶合物，其特征在于：所述的聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇(monomethoxy polyetnylene glycol，mPEG)活化分子，包括单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)、单甲氧基聚乙二醇丁醛、Y型聚乙二醇乙醛、单甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯、单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺，其分子量在5000～40000之间；最优选的是单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)，分子量为20000。

10、  根据权利要求1所述的聚乙二醇化人干扰素ω偶合物，其特征在于：聚乙二醇与重组人干扰素ω(rhIFN-ω)发生共价结合反应的比例(摩尔比为0.25～20，优选比例在2.5～10之间。

11、  根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组人干扰素ω药物的生产工艺，包括以下过程：
(1)提供pH4.0～9.0、10～100mmol/L的盐浓度的缓冲体系；
(2)重组人干扰素ω与聚乙二醇醛在(1)步骤提供的体系中反应12～72小时，温度控制在4～37℃；
(3)经步骤(2)反应得到的产物经过阳离子交换层析分离纯化，收集一个聚乙二醇分子连接一个重组人干扰素ω分子的聚乙二醇化重组人干扰素ω(PEG-rhIFN-ω)，经过过滤除菌，冷冻干燥后即得。

12、  根据权利要求6所述的聚乙二醇化重组人干扰素ω药物的生产工艺，其特征在于：聚乙二醇与重组人干扰素ω((hIFN-ω)发生共价结合反应的缓冲体系优选的pH值在4.5～5.5之间，优选的温度在20～25℃，优选的时间为24～48小时。

聚乙二醇化重组人干扰素ω偶合物
技术领域
涉及一种治疗对干扰素ω敏感的病毒感染的药物制剂，尤其是一种能够明显减少用药次数，具有长效作用的聚乙二醇化重组人干扰素偶合物以及其制备工艺。
背景技术
干扰素是一类天然存在的小分子蛋白质和糖蛋白，它们通过大多数有核细胞对病毒感染以及其他抗原刺激的反应而产生和分泌。干扰素使细胞能抵抗病毒感染并对细胞表现出广泛的作用。它们通过与细胞表面的特异性膜受体结合而发挥其细胞活性。
慢性肝炎主要指慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎，两种肝炎在我国都很常见，尤其是慢性乙型肝炎。如果不进行有效地抗病毒治疗，部分慢性肝炎的病人最终将发展为肝硬化和肝癌。药物经济学分析表明，治疗慢性肝炎引起的肝硬化或肝癌的成本，远远高于早期阶段的抗病毒治疗所需要的成本。
干扰素a是治疗慢性乙型肝炎或慢性丙型肝炎的首选药物，可以有效地抑制或清除病毒，疗效持久，阻止肝硬化或肝癌的发生。但普通干扰素治疗具有自身不可克服的缺点，半衰期短，只有4个小时。所以，干扰素不得不每隔一天就注射一次，使用很不方便。另外，注射干扰素的宿主可产生针对干扰素的抗体。该反应可引起类似于流感的症状，这种症状被作为干扰素的副作用进行报道；同时该反应还可引起对干扰素的破坏，从而需要更大剂量干扰素以达到治疗效果。
为了解决普通干扰素在临床治疗上的不足，多家生物制药公司致力于开发长效的干扰素。其手段是通过对普通干扰素进行聚乙二醇修饰。
聚乙二醇(Poly ethlene glycol，pEG)是一种无毒、无免疫原性的水溶性高分子物质，可以通过共价件键结合方式修饰蛋白质。聚乙二醇修饰蛋白质药物不仅可以降低免疫原性和毒性、而且能明显延长血浆半衰期，提高蛋白质药物的稳定性。
临床上，广泛应用的聚乙二醇化干扰素包括先灵葆雅公司的开发的聚乙二醇化干扰素α-2b(商品名，佩乐能，PegIntron)；罗氏公司开发的聚乙二醇化干扰素α-2a(商品名，派罗欣，PegasyS)，通过与利巴韦林联合广泛用于慢性乙型和丙型肝炎的治疗。
本发明提供了一种聚乙二醇分子与重组人干扰素ω的N末端结合，且一个重组人干扰素ω分子结合一个聚乙二醇分子的聚乙二醇化重组人干扰素ω药物的制备方法。
发明内容
本发明所要解决的首要技术课题是提供一种有利于工业化生产、且能明显减少用药次数、用于慢性肝炎临床治疗的聚乙二醇化重组人干扰素药物。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种聚乙二醇化重组人干扰素ω药物，其特征在于：聚乙二醇化重组人干扰素药物是由聚乙二醇和重组人干扰素ω以共价键连接。
所述的聚乙二醇化重组人干扰素药物是由聚乙二醇和重组人干扰素ω的N末端通过共价键连接。
每个聚乙二醇分子连接一个重组人干扰素ω分子。
所述的聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇(Monomethoxy polyethyleneglycol，mPEG)活化分子，包括单甲氧基聚乙二醇丁醛、单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)和Y型聚乙二醇乙醛，其分子量在5000-40000之间；最优选的是单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)。
聚乙二醇与重组人干扰素发生共价结合反应的比例(摩尔比)约0.25～20，优选比例在2.5～10之间。
本发明所要解决的再一个技术课题是提供一种上述聚乙二醇化重组人干扰素药物的生产工艺。
包括以下过程：
1)提供pH 4.0～9.0、100mmol/L的盐浓度的缓冲体系；
2)在提供的缓冲体系中依次加入适量重组人干扰素ω，聚乙二醇和NaBH3CN；
3)上述混合物在4～37℃，反应12～72小时；
4)步骤3)反应得到的产物进行SDS-PAGE分析，确定修饰的程度；
5)用20mM pH5.0的醋酸缓冲液透析或者稀释反应混合物，上CM阳离子交换柱，用含有0-1M NaCl的20mM pH5.0的醋酸缓冲液梯度洗脱，280nm监测洗脱峰；
6)SDS-PAGE分析洗脱峰，收集主要含一个聚乙二醇分子连接一个重组人干扰素分子的单点修饰洗脱峰；
7)将单点修饰洗脱峰用超滤离心管进行浓缩处理后，冷冻干燥。
与现有技术相比，本发明所具备的突出的实质性特点和显著的技术进步。
主要表现在以下3个方面：
本发明所提供的聚乙二醇化重组人干扰素-ω药物的优点是提供在体内更长时间的血液水平，具有明显的长效性，减少注射次数而使患者容易接受；
本发明所述的重组人干扰素-ω是采用基因工程的方法，使用本研究室的专利载体，用毕赤酵母表达，经发酵、纯化后获得，纯度大于98％，且保持较高的生物活性；
本发明采用对重组人干扰素-ω的N末端选择性高的修饰方法，即聚乙二醇活性醛和重组人干扰素ω的N末端通过共价键方式连接，使产物的均一性得到大大提高，容易纯化，纯化产物的活性能够较好地保留。
附图概述
图1是重组人干扰素-ω与聚乙二醇(PEG)在25℃，pH5.0的条件下反应12小时的SDS-PAGE图，图中M表示低分子量蛋白标准，1，2，3分别表示重组人干扰素-ω与单甲氧基聚乙二醇丙醛-20K的摩尔比例为1∶2.5，1∶5，1∶10，5表示1分子聚乙二醇修饰后的重组人干扰素-ω。
图2是重组人干扰素-ω与聚乙二醇(PEG)在25℃，pH5.0的条件下反应24小时的SDS-PAGE图，图中M表示低分子量蛋白标准，1，2，3分别表示重组人干扰素-ω与单甲氧基聚乙二醇丙醛-20K的摩尔比例为1∶2.5，1∶5，1∶10，4表示未修饰的重组人干扰素-ω，5表示1分子聚乙二醇修饰后的重组人干扰素-ω。
图3是重组人干扰素-ω与聚乙二醇(PEG)在25℃，pH5.0的条件下反应48小时的SDS-PAGE图，图中M表示低分子量标准，1，2，3分别表示重组人干扰素-ω与单甲氧基聚乙二醇丙醛-20K的摩尔比例为1∶2.5，1∶5，1∶10，4表示未修饰的重组人干扰素-ω，5表示1分子聚乙二醇修饰后的重组人干扰素-ω。
图4是重组人干扰素-ω与聚乙二醇(PEG)在25℃，pH5.0的条件下反应60小时的SDS-PAGE图，图中M表示低分子量标准，1表示未修饰的重组人干扰素-ω，2，3，4分别表示重组人干扰素-ω与单甲氧基聚乙二醇丙醛-20K的摩尔比例为1∶2.5，1∶5，1∶10，5表示1分子聚乙二醇修饰后的重组人干扰素-ω。
图5是皮下注射PEG-rhIFN-ω和rhIFN-ω在家兔体内的浓度时间曲线；
实施例1
在本实施例中使用的重组人干扰素ω的纯度大于98％，且保持有较高的生物活性；
将重组人干扰素溶于100mM的醋酸盐缓冲液(pH5.0)中，按重组人干扰素ω与聚乙二醇(PEG)1∶2.5(摩尔比)的比例加入；
加入单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-propionaldehyde，mPEG-ALD)搅拌溶解，再加入NaBH4CN(与干扰素的摩尔比为20∶1)，室温反应12-60小时。
实施例2
在本实施例中使用的重组人干扰素ω的纯度大于98％，且保持有较高的生物活性；
将重组人干扰素溶于100mM的醋酸盐缓冲液(pH5.0)中，按重组人干扰素ω与聚乙二醇(PEG)1∶5(摩尔比)的比例加入；
加入单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-propionaldehyde，mPEG-ALD)搅拌溶解，再加入NaBH4CN(与干扰素的摩尔比为20∶1)，室温反应12-60小时。
实施例3
在本实施例中使用的重组人干扰素ω的纯度大于98％，且保持有较高的生物活性；
将重组人干扰素溶于100mM的醋酸盐缓冲液(pH5.0)中，按重组人干扰素ω与聚乙二醇(PEG)1∶10(摩尔比)的比例加入；
加入单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-propionaldehyde，mPEG-ALD)搅拌溶解，再加入NaBH4CN(与干扰素的摩尔比为20∶1)，室温反应12-60小时。
实施例4
在本实施例中使用的重组人干扰素ω的纯度大于98％，且保持有较高的生物活性。
将重组人干扰素ω溶于20mM的磷酸盐缓冲液(pH7.2)中，按重组人干扰素ω与聚乙二醇(PEG)1∶2.5(摩尔比)的比例依次加入重组人干扰素ω和单甲氧基聚乙二醇缩丙醛(mPEG-propionaldehyde，mPEG-ALD)，搅拌溶解，再加入NaBH4CN(与干扰素的摩尔比为20∶1)，室温反应24-72小时。
实施例5
在本实施例中使用的重组人干扰素ω的纯度大于98％，且保持有较高的生物活性。
将重组人干扰素ω溶于20mM的磷酸盐缓冲液(pH7.2)中，按重组人干扰素ω与聚乙二醇(PEG)1∶5(摩尔比)的比例依次加入重组人干扰素ω和单甲氧基聚乙二醇缩丙醛(mPEG-propionaldehyde，mPEG-ALD)，搅拌溶解，再加入NaBH4CN(与干扰素的摩尔比为20∶1)，室温反应24-72小时。
实施例6
在本实施例中使用的重组人干扰素ω的纯度大于98％，且保持有较高的生物活性。
将重组人干扰素ω溶于20mM的磷酸盐缓冲液(pH7.2)中，按重组人干扰素ω与聚乙二醇(PEG)1∶10(摩尔比)的比例依次加入重组人干扰素ω和单甲氧基聚乙二醇缩丙醛(mPEG-propionaldehyde，mPEG-ALD)，搅拌溶解，再加入NaBH4CN(与干扰素的摩尔比为20∶1)，室温反应24-72小时。
实施例7聚乙二醇化重组人干扰素ω的分离纯化工艺
将重组人干扰素与聚乙二醇反应得到的产物对20mM pH5.0的醋酸缓冲液透析后，上CM阳离子交换柱，吸附后用含有0-1M NaCl的20mM PH5.0的醋酸缓冲液梯度洗脱，280nm监测洗脱峰，收集主要含一个聚乙二醇分子连接一个重组人干扰素分子的聚乙二醇化重组人干扰素，经过浓缩处理后，所得到的聚乙二醇化重组人干扰素药物的纯度可大于98％，在经过滤除菌、冷冻干燥后即为产品。
实施例8聚乙二醇化重组人干扰素药物在家兔血液中的存留时间实验。
本研究在家兔(新西兰大耳白)中进行，采用皮下注射聚乙二醇化重组人干扰素，并以重组人干扰素(rIFN-ω)作为对照，评价其在家兔血液中的存留时间。
分别在5min，10min，15min，30min，45min，1h，1.5h，2h，4h，8h，12h，24h取血，加肝素钠抗凝，离心取出血浆，冷冻保存待测。
采用双抗夹心法测定血浆中聚乙二醇化重组人干扰素和重组人干扰素的含量，测定波长490nm，以时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制mPEG-rhIFN-ω和rhIFN-ω在家兔血清中的存留时间曲线.
该项试验结果表明，rhIFN-ω经皮下注射后，10min-30min在小鼠血液中达到高峰，随后迅速下降，4h在血液中基本被清除；而聚乙二醇化重组人干扰素经皮下注射，45min在家兔血液中达到高峰后，能持续维持24小时以上，24小时体内仍然具有较高浓度的PEG-rhIFN-ω。这说明与IFN-ω对照品相比较，聚乙二醇化重组人干扰素经皮下注射途径给药，能显著的延长在血液中的存留时间，延迟被清除的时间，具有长效的作用。