牛肝金属硫蛋白的提取方法.pdf

一种牛肝金属硫蛋白的提取方法，包括用健康的犊牛，用颈部肌肉注射ZnSO4溶液进行5-7次剂量逐级递增的诱导合成金属硫蛋白；定量检测，要求每1g牛肝中金属硫蛋白的含量≥7mg；将检测合格的牛肝脏捣碎，进行预处理和粗提；最后进行分离与纯化，得冻干粉即为金属硫蛋白纯品，含量为96％以上；从而，经锌诱导牛肝合成金属硫蛋白可达到成本低、效果好、产量高、诱导剂来源广、无副作用等特点；且为扩大金属硫蛋白这一重要的生物活性物质的来源、促进金属硫蛋白的研究和应用开辟了新的途径。

1、  一种牛肝金属硫蛋白的提取方法，其特征在于：包括下列步骤：
①诱导合成
选用健康的犊牛，用颈部肌肉注射ZnSO₄溶液进行5-7次剂量逐级递增的诱导合成金属硫蛋白，每次剂量为5-150mg/kg体重，每隔1d诱导1次；
②定量检测
诱导完后的第1-3d将犊牛屠宰，取肝脏，将所取新鲜样品用去离子水冲洗两次，洗净残血，直接用巯基显色法或间接竞争型ELISA法对金属硫蛋白的含量进行检测，或用定量滤纸吸干后于-20℃下冷冻保存待测；要求每1g牛肝中金属硫蛋白的含量≥7mg；
③预处理与粗提
将检测合格的上述牛肝脏捣碎，用pH为8.6的Tris-HCl溶液搅拌匀浆，再加入500mLTris-HCl溶液和250mL体积比为1∶0.08的乙醇-氯仿的混合溶液，搅拌10min，冷冻离心，取上清液放入80℃的水浴锅内水浴5min，取出后迅速冷却至室温，再冷冻离心，离心后的上清液即为金属硫蛋白粗提液，放置于4℃备用；其中，离心温度为4℃，转速为10000r/min，时间为20min；
④分离与纯化
按体积比为1∶3于金属硫蛋白粗提液中加入无水乙醇，4℃放置过夜后离心，去上清液取沉淀物，再用0.1mol/L的NH₄HCO₃溶液完全溶解，之后滤纸过滤；用Sephedex G-100层析柱对滤液进行层析，再用0.1mol/L NH₄HCO₃进行洗脱，流速为20mL/min，每5min收集1管；收集完成后，分别从各试管中取5μl样品，各样品加入10μl 1.2mol/L的盐酸后，再加入395μl的巯基试剂，进行显色定位；取显色最深的样品，在-80℃下冷冻20～30h，得冻干粉即为金属硫蛋白纯品；其中，离心温度为4℃，转速为10000r/min，时间为20min；
⑤分装
将冻干粉分装待用。

2、  按权利要求1所述的牛肝金属硫蛋白的提取方法，其特征在于：选用健康初生奶牛公犊，用配制好的ZnSO₄·7H₂O溶液采用颈部肌肉注射法进行诱导，每隔1d诱导一次，共诱导5次，每次剂量分别为5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg，累计185mg/kg。

牛肝金属硫蛋白的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种金属硫蛋白的制取方法，尤指一种牛肝金属硫蛋白的提取方法。
背景技术：
金属硫蛋白是一种重要的生物活性物质，具有广泛的生理学和生物学功能，尤以清除体内自由基、重金属解毒、抗氧化和抗应激的作用甚大，因而作为食品以及美容化妆品的添加剂和某些疾病的治疗药物在医学、食品加工、营养学等各个领域业已广泛应用，并且可望在促进动物健康、提高畜产品产量、营养价值和质量安全等方面发挥重要作用。
含有锌的金属硫蛋白(Zn-MT)是一种正四面体金属巯基螯合族，结晶构相相当稳定，但它仍可通过提供Zn而激活许多以Zn为辅基的酶。因此开展锌诱导金属硫蛋白合成的研究有着重要的理论价值和广阔的应用前景。
市场上已有的产品多是从菌、蜗牛及兔肝内提取含有锌的的金属硫蛋白，由于供体有限，且成本也高，不能满足国民经济发展的需要。
由此可见，选择其它供体诱导合成金属硫蛋白，提高金属硫蛋白产量，并降低其成本，显得十分必要和紧迫。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种牛肝金属硫蛋白的提取方法，一种新金属硫蛋白的提取途径，来提高金属硫蛋白的产量，降低成本。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种牛肝金属硫蛋白的提取方法，包括下列步骤：
①诱导合成
选用健康的犊牛，用颈部肌肉注射ZnSO₄溶液进行5-7次剂量逐级递增的诱导合成金属硫蛋白，每次剂量为5-150mg/kg体重，每隔1d诱导1次；
采用锌剂量逐渐递增的溶液对牛进行颈部肌肉注射诱导，开始用低剂量的锌诱导只增强牛对锌的耐受性和适应性，当锌浓度大幅度增加时，牛不会发生瘁死现象，从而激发了牛对金属硫蛋白诱导合成的潜能，又保证了有充足的时间诱导金属硫蛋白的大量合成。
②定量检测
诱导完后的第1-3d将犊牛屠宰，取肝脏，将所取新鲜样品用去离子水冲洗两次，洗净残血，直接用巯基显色法或间接竞争型ELISA法对金属硫蛋白的含量进行检测，或用定量滤纸吸干后于-20℃下冷冻保存待测；要求每1g牛肝中金属硫蛋白的含量≥7mg。
③预处理与粗提
将检测合格的上述牛肝脏捣碎，用pH为8.6的Tris-HCl溶液搅拌匀浆，再加入500mLTris-HCl溶液和250mL体积比为1∶0.08的乙醇-氯仿混合溶液，搅拌10min，冷冻离心，取上清液放入80℃的水浴锅内水浴5min，取出后迅速冷却至室温，再冷冻离心，离心后的上清液即为金属硫蛋白粗提液，放置于4℃备用；离心温度为4℃，转速为10000r/min，时间为20min。
④分离与纯化
按体积比为1∶3于金属硫蛋白粗提液中加入无水乙醇，4℃放置过夜后离心，去上清液取沉淀物，再用0.1mol/L的NH₄HCO₃溶液完全溶解，之后滤纸过滤；用Sephedex G-100层析柱对滤液进行层析，再用0.1mol/L NH₄HCO₃进行洗脱，流速为20mL/min，每5min收集1管；收集完成后，分别于各试管中取5μl样品，各样品加入10μl 1.2mol/L的盐酸后，再加入395μl的巯基试剂，进行显色定位；取显色最深的样品，在-80℃下冷冻20～30h，得冻干粉即为金属硫蛋白纯品；离心温度为4℃，转速为10000r/min，时间为20min。
⑤分装
将冻干粉分装待用。
本发明采用初生奶牛公犊作为供体，经微量元素锌颈部肌肉注射诱导，5次诱导后宰杀，从牛的肝脏中分离提取一种具有稳定性好，纯度高的金属硫蛋白。经锌诱导牛肝合成金属硫蛋白可达到成本低、效果好、产量高、诱导剂来源广、无副作用等特点。且牛是一种饲养非常普遍的动物，来源广，经诱导提取金属硫蛋白后，牛肉可照常供食用，皮及其他副产品的价值也不受影响。特别是奶牛公犊长大后不能产奶，且在育犊阶段要消耗大量牛奶，所以一般奶牛场对奶牛公犊不进行饲喂，出生后即淘汰或以低价处理。所以用刚出生的奶牛公犊诱导、合成和提取金属硫蛋白，既充分利用了奶牛公犊资源，提高了奶牛业的经济效益，又为扩大金属硫蛋白这一重要的生物活性物质的来源、促进金属硫蛋白的研究和应用开辟了新的途径。用此法提取的金属硫蛋白可广泛用于畜禽饲料抗氧化及畜禽抗应激中。
因此，本发明具有以下优点和积极效果：
1、现有技术中没有从牛肝中提取金属硫蛋白的报道，市场上已有的产品是从兔肝和猪肝内提取的金属硫蛋白，而从牛肝中提取金属硫蛋白的产量分别是从兔肝和猪肝提取金属硫蛋白产量的2-3倍和1.5-2倍。而且牛的饲养量大，特别是奶牛公犊弃之不用，成本很低，用刚出生的奶牛公犊诱导、合成和提取金属硫蛋白，既充分利用了奶牛公犊资源，提高了奶牛业的经济效益，又为扩大金属硫蛋白这一重要的生物活性物质的来源、促进金属硫蛋白的研究和应用开辟了新的途径。
2、一般诱导方法为皮下注射或腹腔注射，本方法为颈部肌肉注射，颈部肌肉注射安全，不会产生皮下注射时诱导液扩散不畅、堆滞的现象和腹腔注射时引起的腹腔感染问题。采用锌剂量逐渐递增的溶液进行颈部肌肉注射诱导，开始用低剂量的锌诱导增强牛只对锌的耐受性和适应性，当锌浓度大幅度增加时牛不会发生瘁死现象，从而激发了对金属硫蛋白诱导合成的潜能，又保证了有充足的时间诱导金属硫蛋白的大量合成。并且本方法诱导剂用量小，诱导合成时间短，操作简便，成本低。
3、得率高，每克牛肝含8.60-9.49mg金属硫蛋白。
4、稳定性好，在低温条件下储藏时间较长。
5、本发明所提取的产品广泛适用于畜禽饲料抗氧化及畜禽抗应激效应中。具体实施方式：
下面结合具体实施例进一步详细说明：
实施例1：
①诱导合成
选用健康的初生奶牛公犊，用配制好的ZnSO₄·7H₂O溶液采用颈部肌肉注射法进行诱导，每隔1d诱导1次，共诱导5次。每次剂量分别为5，10，20，50，100mg/kg，累计185mg/kg。
用牛为供体，通过5次诱导后牛肝内产生的金属硫蛋白量为8.60mg/g，显著高于平常的通过3次诱导产生的金属硫蛋白量(2.62mg/g)和通过4次诱导产生的金属硫蛋白量(4.77mg/g)；而与经7次诱导产生的金属硫蛋白的量(9.49mg/g))和经9次诱导产生的金属硫蛋白的量(9.61mg/g)差异不显著，并且节省诱导时间和成本。
②定量检测
根据条件，任选下述一种方法：
A.巯基显色法
取30μl金属硫蛋白粗提液，加入1.2mo l/L的盐酸10μL和0.1mol/L的EDTA 200μl，反应10min，再加入200μL巯基试剂，用PH 7.2的0.1mol/L的磷酸缓冲溶液定容至4mL，反应3min，在波长420nm处测定吸光度。空白管加入30μl蒸馏水，同样处理。用金属硫蛋白纯品制作标准曲线，根据A值可在标准曲线上读出金属硫蛋白的浓度。
B.间接竞争型ELISA法
采用TECANA-5082型酶联免疫分析仪测定金属硫蛋白含量。反应条件为：抗原包被浓度为6.25μg/ml；一抗(鼠抗牛)适宜浓度为50μg/ml；酶标抗体(山羊抗小鼠)的使用浓度为1/8000倍；反应时间为3hr。
③预处理与粗提
取250g牛肝样用pH为8.6的0.01mol/L的Tris-HCl100mL捣碎搅拌匀浆，倒入烧杯，再加入500mLTris-HCl和250mL乙醇-氯仿(按1∶0.08的比例配制)混合溶液，搅拌10min，冷冻离心(10000r/min，4℃，20min)。取上清液于另一离心管，放入80℃的水浴锅内水浴5min，取出后迅速冷却至室温，冷冻离心(10000r/min，4℃，20min)，离心后的上清液即为金属硫蛋白粗提液，放置于4℃备用。
④分离与纯化
金属硫蛋白粗提液经3倍体积的无水乙醇沉淀，4℃放置过夜后离心(10000r/min，4℃，20min)，去上清液取沉淀物，用0.1mol/L的NH₄HCO₃溶液完全溶解，之后滤纸过滤。对滤液用Sephedex G-100层析柱进行层析，用0.1mol/L NH₄HCO₃进行洗脱，流速控制20mL/min，每5min收集1管。收集完成后，分别从各试管中取5μl样品，于各样品中先后加入10μl1.2mol/L的盐酸和395μl的巯基试剂，进行显色定位。取显色最深的样品，在-80℃下冷冻25h，所得冻干样即为金属硫蛋白纯品，含量为96％以上。每1g牛肝中可提取7mg-9mg的金属硫蛋白。
⑤分装
按每支安瓿20mg分装。
实施例2：
基本步骤与实施例1相同，不同的是共诱导7次，每次剂量分别为5，10，20，50，100，150，200mg/kg，累计535mg/kg；而分离纯化步骤中在-80℃下冷冻25～30h，所得冻干样即为金属硫蛋白纯品，含量为96％以上。每1g牛肝中可提取8mg-10mg的金属硫蛋白。