《一株产杀白蚁化合物的树木内生细菌及其在白蚁防治中的应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一株产杀白蚁化合物的树木内生细菌及其在白蚁防治中的应用.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610168466.1 (22)申请日 2016.03.22 CCTCC No:M2015817 2015.12.31 C12N 1/20(2006.01) A01N 63/02(2006.01) A01P 7/04(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (71)申请人 黑龙江大学 地址 150080 黑龙江省哈尔滨市南岗区学府 路 74 号 (72)发明人 周东坡 刘军 赵凯 许忠允 平文祥 (74)专利代理机构 哈尔滨市文洋专利代理事务 所 ( 普通合伙 ) 23210 代理人 何强 (54) 发明名称 一株产。
2、杀白蚁化合物的树木内生细菌及其在 白蚁防治中的应用 (57) 摘要 一株产杀白蚁化合物的树木内生细菌及其在 白蚁防治中的应用， 它涉及一种树木内生菌及其 在白蚁防治中的应用。它提供一株产杀白蚁化 合物的树木内生细菌及其在白蚁防治中的应用， 通过对该菌株的培养繁殖与发酵生产杀白蚁的 次生代谢产物， 为开发生产绿色、 天然生物白蚁防 治剂开辟了一条新途径。罗森桧芽孢杆菌新种 (Bacillus lawsoniana Zhou,Liu,Zhao,Hse et Ping sp.nov)HUB-I-004， 保藏在中国典型培养物 保藏中心， 保藏号为 CCTCC No:M2015817。罗森桧 芽孢杆菌。
3、新种在白蚁防治中的应用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 105586301 A 2016.05.18 CN 105586301 A 1.一株产杀白蚁化合物的树木内生细菌， 其为罗森桧芽孢杆菌新种( Bacillus lawsonianaZhou,Liu,Zhao,HseetPingsp.nov)HUB-I-004， 保藏在中国典型培养物保 藏中心， 保藏号为CCTCCNo:M2015817。 2.如权利要求1所述的产杀白蚁化合物的树木内生细菌在白蚁防治中的应用， 其特征 在于。
4、罗森桧芽孢杆菌新种(BacilluslawsonianaZhou,Liu,Zhao,HseetPingsp.nov) HUB-I-004在白蚁防治中的应用。 3.根据权利要求2所述的产杀白蚁化合物的树木内生细菌在白蚁防治中的应用， 其特 征在于罗森桧芽孢杆菌新种(BacilluslawsonianaZhou,Liu,Zhao,HseetPing sp.nov)HUB-I-004发酵液作为杀白蚁制剂的应用。 4.根据权利要求2所述的产杀白蚁化合物的树木内生细菌在白蚁防治中的应用， 其特 征在于罗森桧芽孢杆菌新种(BacilluslawsonianaZhou,Liu,Zhao,HseetPing 。
5、sp.nov)HUB-I-004发酵液浓缩液作为杀白蚁制剂的应用。 5.根据权利要求3所述的产杀白蚁化合物的树木内生细菌在白蚁防治中的应用， 其特 征在于罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004发酵液的制备方法： 将罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004单菌落斜面取出活化， 扩大培养在牛肉膏蛋白胨培 养基中发酵28恒温， 摇振100120r/min培养发酵2048h； 即得到罗森桧芽孢杆菌新种 HUB-I-004发酵液。 6.根据权利要求5所述的产杀白蚁化合物的树木内生细菌在白蚁防治中的应用， 其特 征在于1000ml牛肉膏蛋白胨培养基1000ml由3g牛肉膏、 10g蛋白胨、 5gNaCl和余量的。
6、蒸馏 水制成， pH值为7.07.2。 7.根据权利要求4所述的产杀白蚁化合物的树木内生细菌在白蚁防治中的应用， 其特 征在于罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004发酵液浓缩液的制备方法： 一、 将罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004单菌落斜面取出活化， 扩大培养在牛肉膏蛋白胨 培养基中发酵28恒温， 摇振100120r/min培养发酵2048h； 即得到罗森桧芽孢杆菌新 种HUB-I-004发酵液； 二、 将步骤一发酵液30003500r/min离心10min， 取上清液40恒温水浴旋转蒸发， 150r/min摇振浓缩， 即得到罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004发酵液浓缩液。 权利要求书 1。
7、/1 页 2 CN 105586301 A 2 一株产杀白蚁化合物的树木内生细菌及其在白蚁防治中的 应用 技术领域 0001 本发明涉及一种树木内生菌及其在白蚁防治中的应用。 背景技术 0002 白蚁Termite属于节肢动物门昆虫纲有翅亚纲等翅目的昆虫， 是世界上最为著名 的害虫之一， 据报道仅白蚁每年给林业、 木材、 农业、 建筑物、 庙宇文物、 江河湖海堤坝等造 成的全球损失高达400亿美元(Corneliusetal2015)， 其中我国每年的损失高达8亿美元 (Amiralianetal2014)。 人们以往采用物理方法、 化学药剂法、 人工与机械挖掘蚁巢法和 生物学方法防治白蚁， 。
8、其中物理方法(包括屏障法、 电冲击法、 微波法、 冷冻法、 热处理、 烟熏 法等等)及人工与机械挖掘蚁巢法防治白蚁均耗时费力， 成本过高， 且效果不理想； 化学药 剂法防治白蚁虽有一定效果， 但对人、 动植物及环境的毒副作用太大， 造成严重的污染并破 坏生态平衡， 不易再继续沿用； 虽然， 采用生物学方法防治白蚁目前已经在试验中实现， 例 如产白蚁毒素的根际细菌、 真菌、 线虫等， 但是均未商业化生产应用。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一株产杀白蚁化合物的树木内生细菌及其在白蚁防治中的 应用， 通过对该菌株的培养繁殖与发酵生产杀白蚁的次生代谢产物， 为开发生产绿色、 天然 生物白蚁防。
9、治剂开辟了一条新途径。 0004 本发明产杀白蚁化合物的树木内生细菌为罗森桧芽孢杆菌新种(Bacillus lawsonianaZhou,Liu,Zhao,HseetPingsp.nov)HUB-I-004， 保藏在中国典型培养物保 藏中心， 保藏号为CCTCCNo:M2015817。 0005 本发明利用上述产杀白蚁化合物的树木内生细菌罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004 在白蚁防治中的应用。 0006 罗森桧芽孢杆菌新种(BacilluslawsonianaZhou,Liu,Zhao,HseetPing sp.nov)HUB-I-004为革兰氏阳性菌， 杆状、 末端椭圆， 单个或成对排列，。
10、 菌体大小为(1.4 2.2) m(0.50.8) m如图1所示。 罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004无荚膜， 产中生或近中 生、 无明显膨胀的芽孢， 芽孢大小为(0.71.25) m(0.450.8) m， 周生鞭毛， 可运动； 在 牛肉膏蛋白胨培养基上可形成白色或淡乳黄色小菌落， 菌落直径为3.24.8mm， 近圆形， 不 透明， 表面干燥， 无光泽， 呈典型的蜂巢状(如图2所示)； 菌落形态明显不同于枯草芽孢杆菌 和其它芽孢杆菌。 0007 罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004可好氧生长， 也可厌氧生长， 具有运动性， 最适生 长温度为28， 最低的生长温度为12， 最高生长温度为50。
11、， 均低于枯草芽孢杆菌。 罗森 桧芽孢杆菌新种HUB-I-004可在NaCl浓度为27的培养基中生长， 在NaCl浓度为10 或胆酸盐浓度为40的培养基中不生长。 0008 罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004酪素水解为阴性， 苯甲酰甘氨酸水解为阴性， 接触 说明书 1/5 页 3 CN 105586301 A 3 酶与过氧化物酶试验呈阳性， 吲哚试验、 甲基红试验、 VP试验、 柠檬酸酸盐试验均为阳性， 淀 粉与明胶利用为阳性， 尿素利用为阳性， 石蕊牛奶还原为阳性， 硝酸盐还原为阳性， 精氨酸 双水解为阳性， 0.001的溶菌酶试验为阳性， 利用葡萄糖、 麦芽糖、 乳糖、 木糖、 甘露糖、。
12、 山 梨糖、 水扬酸产气， 不利用油脂， 不利用鼠李糖和山梨醇。 0009 罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004通过16SrDNA序列对比分析， 与芽孢杆菌属内各种 之间都有较高的同源性， 依据16SrDNA基因序列进化树分析， 罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I- 004与枯草芽孢杆菌的gi/151935463/gb/EF428251.2/和gi/151935459/gb/EF428247.2.菌 株关系最近， 同源性可高达99.9以上(如图3所示)。 但罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004的 菌体大小， 芽孢大小均明显小于枯草芽孢杆菌的标准菌株CCTCCAB92068(中国典型培养物 保藏中心，。
13、 武汉)和参考菌株B.subtilisKi-2-132、 B.subtilisAS1.1098； 罗森桧芽孢杆菌 新种HUB-I-004的菌落也明显小于三者， 具有典型的蜂巢状特征； 罗森桧芽孢杆菌新种HUB- I-004的最适、 最低、 最高生长温度也明显低于三者。 罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004培养过 程中不产生色素， 而枯草芽孢杆菌的标准菌株CCTCCAB92068和参考菌株B.subtilisKi-2- 132、 B.subtilisAS1.1098在培养后期均产生色素。 罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004的生理 生化特征和菌株排列方式也有别于枯草芽孢杆菌的标准菌株CCTCCA。
14、B92068和参考菌株 B.subtilisKi-2-132、 B.subtilisAS1.1098。 0010 罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004与亲缘关系最为接近的枯草芽孢杆菌的标准菌株 CCTCCAB92068996进行基因组分子杂交， 平均同源性仅为58.75， 远低于国际系统细菌 学命名规则中有关同种的同源性应高于70的要求。 综合分析确定本发明罗森桧芽孢杆菌 新种HUB-I-004为芽孢杆菌属一个独立的新菌种菌株。 0011 本发明罗森桧芽孢杆菌新种(BacilluslawsonianaZhou,Liu,Zhao,Hseet Pingsp.nov)HUB-I-004的发酵液可有效。
15、的杀死白蚁， 含有杜松醇(T-cadinol)、 松油醇( - terpineol)和依兰油醇(T-muurolol)， 用其发酵原液、 发酵浓缩液侵泡的滤纸饲喂白蚁， 培 养至第14天白蚁死亡率均达到99.5以上。 罗森桧芽孢杆菌新种(Bacilluslawsoniana Zhou,Liu,Zhao,HseetPingsp.nov)HUB-I-004可用于白蚁的防治。 0012 罗森桧芽孢杆菌新种(BacilluslawsonianaZhou,Liu,Zhao,HseetPing sp.nov)HUB-I-004为罗森桧芽孢杆菌， 属于芽孢杆菌属(Bacillussp.)； 保藏在中国典型 。
16、培养物保藏中心(CCTCC)， 保藏地址是武汉， 武汉大学， 保藏编号为CCTCCNo:M2015817， 保 藏日期为2015年12月31日。 附图说明 0013 图1是罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004的20000倍透射电镜照片。 0014 图2是罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004的菌落形态图。 0015 图3是罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004与GenBank中相近菌株的16SrDNA序列进行 同源性比对构建的系统发育树图。 具体实施方式 0016 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式， 还包括各具体实施方式间的 任意组合。 说明书 2/5 页 4 CN 105586301。
17、 A 4 0017 具体实施方式一： 本实施方式产杀白蚁化合物的树木内生细菌为罗森桧芽孢杆菌 新种(BacilluslawsonianaZhou,Liu,Zhao,HseetPingsp.nov)HUB-I-004， 保藏在中 国典型培养物保藏中心， 保藏号为CCTCCNo:M2015817。 0018 本实施方式罗森桧芽孢杆菌新种(BacilluslawsonianaZhou,Liu,Zhao,Hseet Pingsp .nov)HUB-I-004是从美国俄勒冈州(OregonState)山区森林中的扁柏 (Chamaecyparislawsoniana)树皮中分离获得的内生细菌菌株。 00。
18、19 树木内生细菌的分离方法如下： 0020 一、 在美国俄勒冈州的山区森林中选取超过20年生的扁柏老树， 用斧锯取下不同 部位的大树皮块， 装至无菌包装袋密封带回实验室； 0021 二、 取出扁柏大树皮块， 先用无菌水冲洗表面的灰尘与杂质等， 晾干后用无菌剪刀 剪成1.5cm1.0cm1.0cm的扁柏树皮小块， 分别用75的酒精浸泡23min， 再用无菌重 蒸水洗涤2次； 0022 或者将扁柏树皮小块分别用0.01的升汞浸泡12min， 再用无菌重蒸水洗涤2 次； 0023 三、 将上述处理好的扁柏树皮小块栽种于含有灰黄霉素、 制霉菌素或放线菌酮的 水琼脂培养皿中28培养23天， 长出细菌菌。
19、落； 0024 或者将处理好的扁柏树皮小块栽种于含有灰黄霉素、 制霉菌素或放线菌酮的牛肉 膏蛋白胨培养皿中2837培养23天， 长出细菌菌落； 0025 四、 将培养皿中长出的菌落用接种环接出， 按三区划线法转接于含有灰黄霉素、 制 霉菌素或放线菌酮的牛肉膏蛋白胨培养皿上28恒温培养12天， 在第三区长出单菌落； 0026 五、 将第三区中单菌落接出， 再重复做几次三区划线， 最后分离得纯化的单菌落， 接种于斜面上恒温培养后， 置于4冰箱保存备用。 0027 树木内生细菌浓缩发酵液的制备方法： 0028 A、 将上述纯化培养得到的树木内生细菌单菌落斜面分别取出活化， 扩大培养， 并 在含有灰黄。
20、霉素、 制霉菌素或放线菌酮的牛肉膏蛋白胨培养基中发酵28恒温， 摇振100 120r/min培养发酵2048h； 0029 B、 将步骤A发酵液30003500r/min离心10min， 取部分上清液备用(为原液)， 剩余 的上清液倾注于无菌三角瓶中， 用旋转蒸发仪无菌操作， 40恒温水浴， 150r/min摇振浓缩 至原体积的1/10， 取出置于4冰箱中保存， 即为10倍浓缩发酵液。 0030 同理， 可制出树木内生细菌2倍浓缩的发酵液。 0031 指 示 菌 ：从 武 汉 市 武 汉 大 学 的 珞 珈 山 挖 取 活 泼 、健 壮 的 白 蚁 (Odontotermesformosanu。
21、s)， 在实验室按无菌操作程序用浓度为75的酒精对白蚁体表消 毒， 再用无菌剪刀剖腹， 用无菌接种环挑取白蚁肠道内容物， 分别接种于以羧甲基纤维素 (CMC)为唯一碳源的培养基平皿、 或者以木质素为唯一碳源的培养基平皿、 或者无氮的培养 基平皿中， 2837恒温培养12天， 待长出菌落后再按三区划线法分离、 纯化培养出单 菌落。 对于真菌则使用10倍系列稀释法分离、 纯化获得单孢子。 将白蚁肠道内可产纤维素 酶， 木质素酶或固氮酶的内生细菌及真菌保藏于冰箱中， 作为指示菌。 0032 筛选获得罗森桧芽孢杆菌新种(BacilluslawsonianaZhou,Liu,Zhao,Hseet Pin。
22、gsp.nov)HUB-I-004： 说明书 3/5 页 5 CN 105586301 A 5 0033 选择指示菌(细菌和真菌)的最适培养基倾注平皿并加入牛津杯， 然后分别用刮棒 涂上指示菌使之长出菌苔， 牛津杯孔中分别注入树木内生细菌浓缩发酵液， 恒温培养， 选择 抑菌圈的直径最大的树木内生细菌， 即获得罗森桧芽孢杆菌新种(Bacilluslawsoniana Zhou,Liu,Zhao,HseetPingsp.nov)HUB-I-004。 0034 再对罗森桧芽孢杆菌新种(BacilluslawsonianaZhou,Liu,Zhao,HseetPing sp.nov)HUB-I-004。
23、进行检测、 鉴定， 确定其为芽孢杆菌属新种， 命名为罗森桧芽孢杆菌 (BacilluslawsonianaZhou,Liu,Zhao,HseetPingsp.nov)。 0035 本实施方式罗森桧芽孢杆菌新种(BacilluslawsonianaZhou,Liu,Zhao,Hseet Pingsp.nov)HUB-I-004可在牛肉膏蛋白胨培养基上生长。 牛肉膏蛋白胨培养基1000ml： 由 3g牛肉膏、 10g蛋白胨、 5gNaCl和余量的蒸馏水制成， pH值为7.07.2， 于121， 灭菌 30min。 0036 具体实施方式二： 本实施方式产杀白蚁化合物的树木内生细菌罗森桧芽孢杆菌新 。
24、种(BacilluslawsonianaZhou,Liu,Zhao,HseetPingsp.nov)HUB-I-004在白蚁防治中 的应用。 0037 具体实施方式三： 本实施方式罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004发酵液作为杀白蚁 制剂的应用。 0038 罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004发酵液的制备方法： 0039 将罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004单菌落斜面取出活化， 扩大培养在牛肉膏蛋白 胨培养基中发酵28恒温， 摇振100120r/min培养发酵2048h； 即得到罗森桧芽孢杆菌 新种HUB-I-004发酵液。 0040 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基1000ml由3g牛肉膏、。
25、 10g蛋白胨、 5gNaCl和余量的蒸 馏水制成， pH值为7.07.2。 0041 具体实施方式四： 本实施方式罗森桧芽孢杆菌新种(BacilluslawsonianaZhou, Liu,Zhao,HseetPingsp.nov)HUB-I-004发酵液浓缩液作为杀白蚁制剂的应用。 0042 罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004发酵液浓缩液的制备方法： 0043 一、 将罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004单菌落斜面取出活化， 扩大培养在牛肉膏蛋 白胨培养基中发酵28恒温， 摇振100120r/min培养发酵2048h； 即得到罗森桧芽孢杆 菌新种HUB-I-004发酵液； 0044 二、。
26、 将步骤一发酵液30003500r/min离心10min， 取上清液40恒温水浴旋转蒸 发， 150r/min摇振浓缩， 即得到罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004发酵液浓缩液。 0045 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基1000ml由3g牛肉膏、 10g蛋白胨、 5gNaCl和余量的蒸 馏水制成， pH值为7.07.2。 0046 实施例1 0047 罗森桧芽孢杆菌新种(BacilluslawsonianaZhou,Liu,Zhao,HseetPing sp.nov)HUB-I-004白蚁的防治实验： 0048 一、 将罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004的发酵液原液及其2倍浓缩液、 10倍浓。
27、缩液， 分别浸泡D9.0cm、 W0.5g左右的中性新华滤纸(Whatman-xinhua)， 同时用无菌蒸馏水处 理的滤纸做为对照； 0049 二、 将处理好的滤纸片分别平铺于直径为9cm的培养瓶底的细砂(预先经100目筛 说明书 4/5 页 6 CN 105586301 A 6 选， 经浓硫酸、 强碱处理， 再用无菌蒸馏水清洗， 晒干后装瓶)上面； 每个培养瓶中放300只活 泼健壮的白蚁， 盖上瓶盖后再回松一下瓶口(使之通气)； 0050 三、 置入26.5， 相对湿度80的培养箱中， 定期向每个培养瓶中滴水， 并计算白 蚁的死亡率， 观察14天。 0051 饲喂实验结果如表1所示， 实验。
28、证明罗森桧芽孢杆菌新种(Bacilluslawsoniana Zhou,Liu,Zhao,HseetPingsp.nov)HUB-I-004的发酵液可有效的杀死白蚁， 其发酵原 液、 2倍、 10倍的浓缩液组的白蚁死亡率均明显高于对照组(p0.05)。 实 验结果表明罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004发酵液含有可杀死白蚁的物质， 能用于白蚁的 防治。 0052 表1 0053 0054 实施例2 0055 罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004发酵液白蚁排斥试验： 0056 实验仪器材质为无毒透明硬塑料， 长方形， 被透明硬塑料隔板分成均等的三室， 每 个隔板底部设置有多个可供白蚁自由通行的孔。
29、道。 三个室的底部铺满细砂(预先经100目筛 选， 经浓硫酸、 强碱处理， 再用无菌蒸馏水清洗， 晒干后装瓶)， 然后在三室细砂之上分别放 入用无菌水(中间室A)、 510的蔗糖液(右室C)、 罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004发酵液 (左室B)浸泡处理过的滤纸或木棒。 0057 排斥试验方法： 将300只活泼、 健壮的白蚁放入中间室A中， 再注意观察白蚁的活动 趋势， 记录24h后各室的白蚁数量。 0058 实验结果显示三室中白蚁数量差异不明显(p0.05)， 表明罗森桧芽孢杆菌新种 HUB-I-004发酵液对白蚁无排斥作用。 0059 实施例3 0060 将罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-。
30、004发酵液30003500r/min离心10min， 取发酵上 清液， 再用大孔树脂层析处理发酵上清液， 得到粗提物； 然后用己烷、 丙酮和水混合的萃取 液萃取48h， 得到罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004发酵提取物。 其中， 萃取液中己烷、 丙酮和 水的体积比为54:44:2。 0061 罗森桧芽孢杆菌新种HUB-I-004发酵提取物GC-MS测验结果显示发酵提取物中包 含杜松醇(T-cadinol)、 松油醇( -terpineol)、 依兰油醇(T-muurolol)等新的生物活性物 质。 说明书 5/5 页 7 CN 105586301 A 7 图1 说明书附图 1/3 页 8 CN 105586301 A 8 图2 说明书附图 2/3 页 9 CN 105586301 A 9 图3 说明书附图 3/3 页 10 CN 105586301 A 10 。