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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610003243.X (22)申请日 2016.01.04 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 中国科学院昆明动物研究所 地址 650223 云南省昆明市五华区教场东路 32 号 申请人 江西农业大学 (72)发明人 张亚平 黄路生 谢海兵 任军 艾华水 徐丹 (74)专利代理机构 昆明今威专利商标代理有限 公司 53115 代理人 杨宏珍 (54) 发明名称 猪 3 号染色体上与窝产仔数相关的 SNP 位点 及其引物 (57) 摘要 本发明涉及与猪产仔数性状相关的 SNP。
2、 位 点， 具体涉及猪 3 号染色体上一个与窝产仔数相 关的 SNP 位点及其引物， 属生物技术领域。该 SNP 位点为基因组版本 NCBI Build Sscrofa 10.2 的 Chr3:59537592 ； 该位点的等位基因为 T 和 C， 有 C/C、 T/C和T/T三种基因型， 扩增该位点的引物及 延伸引物为 ： Chr3-1-PCRU ： 5 -TTG GTC CTC AGT CAT GTG G-3 ； Chr3-1-PCRL ： 5 -AAC CTC TTC CCT TGA CCT GA-3 ； Chr3-1-SNPU ： 5 -TGA CTA GTA GGC AGG CAA 。
3、GAA CAT TCA GAG-3 。带有 T/ C 基因型的猪产仔数高于 C/C 基因型 ,T 为提高猪 产仔数的有益等位基因并且 T/C 杂合猪产仔数最 高。本发明的有益效果在于 ： 全基因组重测序方 法能够快速、 批量地筛选与性状相关的 SNP 位点 或基因， 基因组版本NCBI Build Sscrofa 10.2的 Chr3:59537592 这个 SNP 位点能够作为遗传标记 用于猪的遗传育种提高母猪的产仔数。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 105603065 A 2016.05.25。
4、 CN 105603065 A 1.猪3号染色体上一个与产仔数相关的SNP位点在白色杜洛克二花脸猪杂交资源群F2 代母猪产仔数分子标记辅助选择中的应用， 其特征在于： 所述SNP位点的等位基因为T和C， 有C/C、 T/C和T/T三种基因型， 带有C/C基因型的母猪产仔数最低， T为提高猪产仔数的有益 等位基因并且T/C杂合猪产仔数最高。 2.一种检测权利要求1中所述SNP位点的引物在白色杜洛克二花脸猪杂交资源群F2代 母猪产仔数分子标记辅助选择中的应用， 其特征在于： 所述引物的核苷酸序列如下所示： Chr3-1-PCRU： 5 -TTGGTCCTCAGTCATGTGG-3 ； Chr3-1。
5、-PCRL： 5 -AACCTCTTCCCTTGACCTGA-3 ； Chr3-1-SNPU： 5 -TGACTAGTAGGCAGGCAAGAACATTCAGAG-3 ， 所述SNP位点带有 C/C基因型的母猪产仔数最低， T为提高猪产仔数的有益等位基因并且T/C杂合猪产仔数最 高。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105603065 A 2 猪3号染色体上与窝产仔数相关的SNP位点及其引物 技术领域： 0001 本发明涉及与猪产仔数性状相关的SNP位点， 具体涉及猪3号染色体上一个与窝产 仔数相关的SNP位点及其引物， 属生物技术领域。 背景技术： 0002 猪的产仔数性状是猪繁殖性状的主。
6、要组成部分， 提高猪产仔数对提高养猪业的总 体经济效益意义重大。 我国的太湖猪以高产而闻名， 窝产仔数比大多数其它中国地方猪种 以及国外猪种的窝产仔数多4-5头( 中国猪品种志 张仲葛主编， 上海科技出版社， 1986)。 太湖猪中与高产仔数相关的多态位点， 能够作为遗传标记用于提高母猪的产仔数。 0003 全基因组重测序方法已广泛应用于各个物种的相关研究， 它能够快速全面地筛选 出与性状、 功能相关的基因或突变位点， 弥补了QTL定位以及候选基因方法费时费力、 单一 等不足。 0004 在国内外尚未见本发明中SNP位点与猪窝产仔数相关的公开文献报道。 发明内容： 0005 本发明的目的是提供。
7、猪3号染色体上一个与窝产仔数相关的SNP位点及其引物。 0006 本发明选择了二花脸猪(太湖猪的一种)， 藏猪， 巴马香猪， 莱芜猪， 及滇南小耳猪5 个中国地方猪种以及野猪进行了全基因组重测序。 6个猪种的重测序个体数分别为11个， 11 个， 9个， 10个， 10个和10个。 重测序数据跟参考基因组(NCBIBuildSscrofa10.2)进行比 对， 利用SAMTools软件进行SNPs位点的提取。 发明人比较了二花脸猪与其它5个猪种， 在3号 染色体上发现一个SNP位点(基因组版本NCBIBuildSscrofa10.2的Chr3:59537592)与猪 的产仔数相关。 该位点的等。
8、位基因为T和C， 有C/C、 T/C和T/T三种基因型。 0007 筛选到该位点后， 发明人在白色杜洛克二花脸猪杂交资源群F2代母猪个体中对 其进行验证和相关性分析， 结果发现该位点与猪产仔数有显著相关性。 0008 本发明的有益效果在于： 全基因组重测序方法能够快速、 批量地筛选与性状相关 的SNP位点或基因， 基因组版本NCBIBuildSscrofa10.2的Chr3:59537592这个SNP位点能 够作为遗传标记用于猪的遗传育种提高母猪的产仔数。 附图说明： 0009 图1为白色杜洛克二花脸猪F2代母猪资源群中Chr3:59537592位点3种基因型的 产仔数比较(图中两种基因型产仔。
9、数比较时， *表示0.01 P 0.05； *表示P0.01)。 具体实施方案： 0010 (1)SNP位点的群体分布特征 0011 本发明选择二花脸猪(太湖猪的一种)， 藏猪， 巴马香猪， 莱芜猪， 及滇南小耳猪5个 中国地方猪种以及野猪进行了全基因组重测序。 6个猪种的重测序个体数分别为11个， 11 说明书 1/3 页 3 CN 105603065 A 3 个， 9个， 10个， 10个和10个。 重测序数据跟参考基因组(NCBIBuildSscrofa10.2)进行比 对， 利用SAMTools软件进行SNPs位点的提取。 发明人比较了二花脸猪与其它5个猪种， 在3号 染色体上发现一个。
10、SNP位点(基因组版本NCBIBuildSscrofa10.2的Chr3:59537592)与猪 的产仔数相关。 从重测序的分析结果来看， 其它4个中国地方猪种和野猪中该位点等位基因 C的频率平均为84.2， 而在二花脸猪中等位基因T的频率为100。 0012 (2)SNP位点的鉴定 0013 在引物设计网站设计SNAPSHOT引物， 包括一对PCR扩增引物(Chr3-1-PCRU： 5 -TTG GTCCTCAGTCATGTGG-3 ； Chr3-1-PCRL： 5 -AACCTCTTCCCTTGACCTGA-3 )和延伸 引物(Chr3-1-SNPU： 5 -TGACTAGTAGGCAGG。
11、CAAGAACATTCAGAG-3 )。 该位点与其它 11个位点共24条(12对)引物各取1 l混合为新的多重PCR引物池。 首先进行12重PCR反应， 反 应体系所用试剂为： 多重PCR引物池(6.25 Meach)8 l、 dNTP(10mMeach)8 l、 10PCR BufferII116 l、 MgCl2(25mMStock)234 l、 FastStartTaq(5U/ l)24 l和ddH2O460 l， 将以上试剂混合液8.5 l和1.5 lDNA(50ng/ l)混合成10 l体系进行12重PCR扩增反应。 扩 增反应条件为： 944min； 9430s， 5530s， 。
12、721min， 共40个循环。 下一步进行PCR反 应纯化， 所需试剂为： ExoI(10U/ l)60 l、 SAP(1U/ l)130 l、 10SAPBuffer35 l和 ddH2O125 l， 在每个样品的PCR产物中加入3.5 l上述纯化混合液离心后按以下程序进行 反应： 3740min， 9610min。 然后进行单碱基延伸反应， 所需试剂为： SNAPSHOT MultiplexreadyreactionMix100 l、 延伸引物池(6.25 Meach， 12条延伸引物各取1 l 混合)8 l、 5SequencingBuffer200 l和ddH2O300 l， 将以上试。
13、剂混合液6 l和4 l的纯 化产物混合成10 l体系进行延伸反应。 延伸反应条件为： 9610s， 505s， 6030s， 共 25个循环。 接着进行延伸反应产物的纯化， 所需试剂为： SAP(1U/ l)120 l、 10SAPBuffer 70 l和ddH2O140 l， 在每个样品的延伸反应产物中加入上述3.3 l纯化混合液离心后按以 下程序进行反应： 3740min， 7520min， 4保存备用。 每个样品取5-4 l上述纯化后的 SNAPSHOT反应产物和5-6 l的高纯甲酰胺(Hi-DiFormamide)混合成10 l体系离心后上样 于ABI3730XL测序仪进行基因分型， 。
14、使用GeneMarker软件分析分型结果。 0014 (注： 以上4个步骤的反应试剂混合液用量均为100个样品所需试剂量， 从单碱基延 伸反应开始， 需要避光进行。 ) 0015 (3)白色杜洛克二花脸猪繁殖性能杂交资源群构建 0016 后续的验证实验所用资源群个体样品及其性状数据由江西农业大学动物生物技 术国家重点实验室培育基地提供。 0017 1998年12月， 在江西农业大学科研猪场将从江苏省3个二花脸猪保种场购买的二 花脸母猪进行场间血缘的交叉配种。 2001年1月根据亲本产仔性能， 从3头公猪和11头母猪 的纯繁后代中选择了17头二花脸母猪作为资源群体的祖代母本。 把SygenPIC。
15、公司惠赠的2 头优质白色杜洛克公猪作为资源家系的祖代父本。 将这2头白色杜洛克和17头二花脸猪杂 交产生的F1代个体进行配种， 避免全同胞交配， 且每头公猪通常与同一头母猪配种， 以获得 大样本的F2半同胞家系。 2003年1月、 3月和6月， 项目组分别将第1批和第2批F2母猪送往江西 省宜春市畜牧良种场(59头)、 江西省国营红星种猪场(52头)和江西上犹县四元杂交猪场 (118头)用于母猪繁殖性状的测定。 0018 (4)SNP位点在杂交资源群F2代母猪群体的基因分型 说明书 2/3 页 4 CN 105603065 A 4 0019 按照上述步骤(2)所述的方法， 以192个白色杜洛克。
16、二花脸猪杂交资源群F2代母 猪个体DNA为模板检测该SNP位点的基因型。 192个F2代资源群个体中有176个个体成功分 型， 3种基因型C/C， T/C和T/T的个体数分别是60， 84和32。 0020 (5)SNP位点对产仔数性状的调控效应 0021 在F2代资源群个体中， 带有C/C基因型个体的平均产仔数为10.5507， 标准差为 0.7672； 带有T/C基因型个体的平均产仔数为11.595， 标准差为0.7568； 带有T/T基因型个体 的平均产仔数为10.9155， 标准差为0.8394。 0022 本发明采用一般线性模型(GLM)分析了SNP位点对猪总产仔数、 产活仔数的影响。
17、。 全部统计分析采用SAS软件进行。 模型如下： 0023 Yijklmu+Ai+Gj+Bk+Pl+eijklm 0024 其中Yijklm为猪总产仔数或产活仔数， u为群体均值， Ai为第i个个体的加性效应， Gj 为第j个SNP位点基因型的固定效应， Bk为批次效应(k1,2,3,4)， Pl为随机效应(l1,2, 3)。 0025 分析结果发现Chr3:59537592这个SNP位点跟产仔数有显著相关性。 带有T/C基因 型的F2代母猪的产仔数比带有C/C基因型的母猪平均多1.04(P0.0181)， 从图1看出， 带有 C/C基因型的母猪产仔数最低。 T为提高猪产仔数的有益等位基因并且T/C杂合猪产仔数最 高。 0026 从SNP位点与产仔数相关性分析看出， Chr3:59537592这个SNP位点能够作为分子 标记应用于分子标记辅助选择(MAS)来提高母猪的产仔数。 说明书 3/3 页 5 CN 105603065 A 5 图1 说明书附图 1/1 页 6 CN 105603065 A 6 。