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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810855455.X (22)申请日 2018.07.31 (71)申请人 大连医科大学附属第一医院 地址 116011 辽宁省大连市西岗区中山路 222号 (72)发明人 刘晶沈丽明马静云 (74)专利代理机构 大连东方专利代理有限责任 公司 21212 代理人 刘慧娟李馨 (51)Int.Cl. C09K 11/06(2006.01) B82Y 20/00(2011.01) B82Y 30/00(2011.01) B82Y 40/00(2011.01) A61K 49。
2、/00(2006.01) (54)发明名称 量子点纳米复合物、 其制备方法及应用 (57)摘要 本发明提供一种量子点纳米复合物、 其制备 方法及应用， 具体所述量子点纳米复合物为在量 子点探针表面化学偶联外泌体膜的生物识别因 子CD63适配体。 所述应用为利用共聚焦显微镜成 像技术示踪干细胞来源的外泌体与代谢器官 (肝、 肺、 肾)的细胞相互作用的情况。 具体条件为 Apt/QDs的比例为2L:1g。 干细胞源外泌体与 代谢器官细胞共孵育时间为58h， 成像比例为 2040g外泌体与24*104/mL细胞。 本发明以 外泌体为技术平台， 对量子点-适配体纳米探针 标记的外泌体代谢路径进行体外研。
3、究， 为后续外 泌体载药等体内及临床研究提供技术支持。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 108865118 A 2018.11.23 CN 108865118 A 1.一种量子点纳米复合物， 其特征在于： 在量子点探针表面化学偶联外泌体膜的CD63 适配体。 2.根据权利要求1所述的量子点纳米复合物， 其特征在于： 所述量子点适配体荧光探针 制备方法， 具体步骤如下： 以磺基-SMCC为交联剂， 将带有氨基基团的水溶性量子点Q4605与 巯基修饰的序列CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA进行偶联。 3.如权利要求1所述的量子点纳米复合物的制备方法， 具体。
4、步骤如下： (1)避光条件下， 取浓度为810 M的氨基水溶性量子点， 再加入等体积的浓度为45 M的Sulfo-SMCC， 室温摇床反应12h； (2)取步骤(1)所得的反应液在1000012000rpm离心除去沉淀； 取上清加入到脱盐柱 NAP-5columns中， 用PBS洗脱， 收集有荧光的溶液加入至1OD CD63适配体中， 避光震荡24h 后， 加入半胱氨酸封闭； (3)将上述反应产物经50K超滤管Amicon Ultra-0.5 Device1400016000g离心5 10min， 弃去滤出液， 内管浓缩液重悬得到量子点适配体探针。 4.权利要求1所述的量子点纳米复合物的应用。。
5、 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于： 所述应用为量子点纳米复合物在干细胞源 外泌体标记与示踪方面的应用。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于： 所述应用为量子点纳米复合物在干细胞源 外泌体的代谢路径、 外泌体载药体内研究及临床研究中的应用。 7.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于： 所述示踪为量子点纳米复合物示踪干细胞 来源的外泌体与代谢器官肝、 肺、 肾的细胞相互作用的情况。 8.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于： 所述示踪外泌体采用的检测条件为Apt/ QDs纳米探针与外泌体的比例为2 L:1 g。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于： 所述示踪外泌体采。
6、用的检测条件还包括： 干细胞源外泌体与代谢器官细胞共孵育时间为58h， 成像比例为每2040 g外泌体对应 (24)104个/mL细胞。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108865118 A 2 量子点纳米复合物、 其制备方法及应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种量子点纳米复合物、 其制备方法及应用。 背景技术 0002 外泌体(Exosomes,Exo)是由细胞分泌的直径为30-150nm的囊泡， 承担细胞间通讯 和物质转运等职能。 由于外泌体携带蛋白质和RNA等， 并具有低免疫原性， 其用作疾病标志 物和靶向药物载体的研究成为热点。 研究表明， 干细胞来源的。
7、外泌体具有修复的功能， 特别 是在退行性疾病和神经炎性疾病中。 此外， 与外泌体相关的特异性标记物可用于监测癌症。 为进一步将干细胞源外泌体用于临床治疗， 研究者需全面掌握其代谢情况。 对于外泌体的 研究仍处于早期阶段， 受纳米尺寸的限制且不同细胞类型分泌的外泌体其体内代谢路径势 必不同。 标记外泌体探究其在体内的代谢情况， 成为重大挑战。 0003 量子点(Quantum Dots,QDs)是一种半导体荧光纳米晶体， 由IIB-VIA或IIIA-VA族 元素组成， 粒径小于10nm， 具有良好的光化学稳定性及生物相容性， 且激发光谱宽， 发射光 谱窄， 荧光寿命长， 不易猝灭等特点。 量子点。
8、作为荧光标记物， 具有较高的灵敏度， 在细胞示 踪和生物检测方面具有重要的应用价值， 目前广泛应用于生物标记、 生物传感和生物成像 的研究中。 因此， 设计出稳定， 通用且多样化的量子点纳米探针对于量子点在生物医学中的 应用有重要的价值。 0004 适配体(Aptamer,Apt)是人工合成的单链DNA或RNA序列， 通过分子内折叠， 能够以 高亲和力特异性地结合目标蛋白。 具有易合成， 易修饰， 易扩增， 分子量小， 稳定性强的特 点， 因而在分子生物学领域得到了广泛的应用。 适配体具有广泛的配体范围， 可以通过 SELEX系统筛选出来。 随着技术的发展， 越来越多外泌体表面特定蛋白相对应的。
9、适配体将被 发现， 适配体为标记外泌体的应用带来了新的方向。 0005 因此利用量子点的荧光信号搭载适配体特异性结合外泌体表面蛋白的特性， 针对 干细胞源外泌体进行代谢路径的研究， 实现外泌体的示踪， 对外泌体应用于临床疾病诊断 及治疗具有重大意义。 发明内容 0006 为了解决上述问题， 本发明采用的技术方法如下： 0007 首先， 本发明制备一种量子点纳米复合物， 即量子点-适配体纳米复合物(特异性 的量子点适配体荧光探针， Apt/QDs)， 在量子点探针表面化学偶联外泌体膜的生物识别因 子CD63适配体用于特异性标记。 0008 所述量子点适配体荧光探针制备方法， 具体步骤如下： 00。
10、09 将带有氨基基团的水溶性量子点通过交联剂磺基-SMCC(N-马来酰亚胺甲基)环 己 烷 - 1 - 羧 酸 琥 珀 酰 亚 胺 酯 ， 钠 盐 S u l f o - S M C C 与 巯 基 修 饰 的 序 列 CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA的CD63适配体进行偶联。 0010 本发明的另一方面在于， 公开上文所述量子点纳米复合物的制备方法， 具体步骤 说明书 1/4 页 3 CN 108865118 A 3 如下： 0011 (1)避光条件下， 取浓度为810 M的氨基水溶性量子点， 再加入等体积的浓度为4 5 M的Sulfo-SMCC， 室温摇床反。
11、应12h； 0012 (2)取步骤(1)所得的反应液在1000012000rpm离心除去沉淀； 取上清加入到脱 盐柱NAP-5columns中， 用PBS洗脱， 收集有荧光的溶液加入至1OD CD63适配体中， 避光震荡2 4h后， 加入半胱氨酸封闭； 0013 (3)将上述反应产物经50K超滤管Amicon Ultra-0.5Device(50K)1400016000g 离心510min， 收集沉淀； 重悬得到量子点适配体探针。 0014 本发明的再一方面为， 公开一种量子点纳米复合物的应用， 进一步的， 所述应用为 本发明的量子点纳米复合物在干细胞源外泌体标记与示踪方面的应用。 0015 。
12、进一步的， 所述应用为量子点纳米复合物在干细胞源外泌体的代谢路径、 外泌体 载药体内研究及临床研究中的应用。 该量子点纳米复合物能标记脐带间充质干细胞源外泌 体， 利用先进的共聚焦显微镜成像技术示踪干细胞来源的外泌体与代谢器官(肝、 肺、 肾)的 细胞相互作用的情况， 验证了脐带间充质干细胞源外泌体进入三种代谢器官细胞的效率， 结果表明， Exo-Apt/QDs与细胞共同孵育5h后， 进入三种细胞系的效率依次为QSG-7701(人 正常肝细胞)BEAS-2B(人正常肺上皮细胞)HKC(人胚肾上皮细胞)。 为进一步研究外泌体 代谢路径、 外泌体载药等体内及临床研究提供技术支持。 0016 上文所。
13、述利用共聚焦显微镜成像技术示踪外泌体， 所采用的检测条件为： 选择10 L体积的Apt/QDs纳米探针与5 g外泌体(即2 L:1 g)为成像最优比例。 干细胞源外泌体与代 谢器官细胞共孵育时间为5h， 成像比例为每2040 g外泌体对应(24)*104个/mL细胞。 0017 进一步的， 对于上文所述利用共聚焦显微镜成像技术示踪外泌体的方法中， 所采 用的干细胞源外泌体与代谢器官细胞成像比例为每20 g外泌体对应2*104个/mL细胞。 0018 本发明的有益效果 0019 本发明中， 为实现外泌体的特异性示踪， 在量子点表面偶联能够识别外泌体膜 CD63的适配体， 使之具备不受组织深度限制。
14、的高分辨率、 高对比度和高灵敏度的快速成像 能力。 0020 本发明中， 用纳米探针标记外泌体， 分别示踪其与代谢器官(肝、 肺、 肾)的细胞相 互作用的情况， 借助量子点的荧光信号， 实现外泌体的示踪， 便于研究外泌体在机体内的路 径。 0021 本发明中， 以外泌体为技术平台， 对Apt/QDs纳米探针标记的外泌体代谢路径进行 体外研究， 为后续外泌体载药等体内及临床研究打下基础。 附图说明 0022 图1A为Apt/QDs葡聚糖凝胶电泳， 条带1和条带2均为QDs， 条带3为Apt/QDs， 条带4 和条带5为DNA marker。 B为405nm激发时Apt/FITC/QDs的发射光谱。
15、图； 0023 图2A为干细胞源外泌体原子力显微镜表征结果图； B为干细胞源外泌体透射电镜 表征结果图； C为干细胞源外泌体Western Blot表征结果图； D为干细胞源外泌体Nanosight 表征结果图； E为干细胞源外泌体Western Blot表征结果图。 0024 图3不同孵育剂量量子点纳米复合物示踪外泌体与肝细胞共孵育4小时共聚焦显 说明书 2/4 页 4 CN 108865118 A 4 微镜图； 0025 图4量子点纳米复合物示踪外泌体与代谢器官细胞作用共聚焦显微镜图。 具体实施方式 0026 下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明， 但不以 任何方。
16、式限制本发明。 0027 实施例1 0028 量子点适配体荧光探针制备： 0029 将带有氨基基团的水溶性量子点通过交联剂磺基-SMCC(N-马来酰亚胺甲基)环 己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯， 钠盐Sulfo-SMCC与巯基修饰的序列如下的CD63适配体进行偶 联： CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA。 0030 具体偶联步骤如下： 0031 (1)实验进行前将Sulfo-SMCC与CD63适配体解冻。 0032 (2)将氨基水溶性量子点避光条件下取88 L(8 M)加入到反应器中， 加入等体积4 M Sulfo-SMCC， 避光条件下室温快速摇床反应1h。 003。
17、3 (3)将上述反应液10000rpm离心5min， 除去沉淀。 0034 (4)取上清加入到脱盐柱NAP-5columns中， 用10mL PBS洗脱， 收集有荧光的部分， 约800 L。 0035 (5)将上述收集的溶液加入至1OD CD63适配体中， 避光摇床2h。 0036 (6)摇床结束后加入8 L半胱氨酸封闭。 0037 (7)将反应物经50K超滤管Amicon Ultra-0.5Device(50K)14000g离心5min， 收集 内管浓缩液。 0038 (8)100 L PBS重悬内管浓缩液得到量子点适配体探针， 4保存。 0039 对制备的量子点适配体荧光探针进行表征鉴定。。
18、 取Apt/QDs纳米探针溶液3 L， QDs 3 L作为对照， 上样。 琼脂糖凝胶电泳20min， 电压100V。 荧光光谱仪(HITACHI F-7000)记录 带有荧光FITC标记的Apt与QDs制备的纳米探针。 样本量为200 L， 荧光测量的条件如下： 激 发波长为405nm， 发射波长扫描范围是200-800nm， 450V电压和1200nm min-1扫描速率。 获得 荧光光谱扫描图像。 0040 提取脐带间充质干细胞源外泌体 0041 人脐带间充质干细胞UC-MSCs在无血清培养基中培养48h， 收集培养基上清液 240mL， 4条件下分别以2000g(30min)和20000。
19、g(60min)连续离心去除细胞和碎片， 上清液 通过0.22 m过滤器过滤， 通过两次连续100000g(60min)超速离心机收集外泌体絮状沉淀并 重悬于磷酸盐缓冲液(PBS)中， -80低温冰箱保存。 使用Bradford测定法定量评估蛋白质 浓度并用PBS调整至1mg/mL。 0042 对外泌体进行表征鉴定。 用原子力显微镜AFM对外泌体的形态进行观察， 将外泌体 水溶液超声30min后， 取一滴样品置于载玻片上， 并在氩气流下干燥， 获取原子力显微镜测 量图像。 使用NanoScope Analysis软件对获得的图像进行分析处理。 将外泌体悬液10 L超 声20min， 用等体积4。
20、多聚甲醛室温固定30min， 滴于铜网上， 磷钨酸染色5min后多余的液 体被吸走并干燥， 透射电子显微镜采集并观察外泌体的大小形态以。 外泌体的大小和囊泡 说明书 3/4 页 5 CN 108865118 A 5 数目分别使用纳米颗粒分析仪qNano(IZON)对其追踪分析进行评估。 外泌体稀释至200 L， 超声30min后测量外泌体的浓度及尺寸。 使用BCA蛋白定量试剂盒对提纯的外泌体进行蛋白 定量。 将样本转移到PVDF膜上。 PVDF膜在含有0.1TWEEN20的Tris缓冲盐水(TBS)中5脱 脂奶粉室温封闭1.5-2min。 用Anti-CD9antibody以及Anti-CD6。
21、3antibody一抗1:1000稀释4 过夜(缓慢摇床)， TBST中清洗3次， 室温下用二抗进行标记， 免疫化学检测使用全自动发 光图像仪采集图像。 0043 探索Apt/QDs与Exo最优比例 0044 1104/mL个QSG7701肝细胞接种到48孔细胞培养板上并孵育24h。 不同剂量0.5、 2.5、 10、 20 L量子点适配体荧光探针标记5 g外泌体， 37， 避光4h。 超速离心100000g 1h提 纯后PBS重悬沉淀， 将其与接种后的肝细胞QSG7701 37避光条件下共孵育5h,结束后PBS 冲洗3次， 每次5min。 4多聚甲醛固定30min， PBS冲洗3次。 DAP。
22、I染色细胞核， 染色20min， PBS 洗涤3次后用激光共聚焦显微镜观察采集图像， 激光为405nm。 探索荧光探针标记外泌体的 最优比例。 结果显示10 L体积的Apt/QDs与5 g外泌体为成像最优比例 0045 Exo-Apt/QDs与代谢细胞作用 0046 选取10 L量子点适配体荧光探针标记5 g外泌体， 4h共孵育后超速离心100000g 1h进行提纯， PBS重悬沉淀与三种代谢细胞肝细胞QSG7701、 肾细胞HKC、 肺细胞BEAS-2B共孵 育5h， 激光共聚焦显微镜观察， 激发波长405nm， 探索三种细胞代谢外泌体的程度。 Exo-Apt/ QDs与细胞共同孵育5h后，。
23、 进入三种代谢细胞系的效率依次为： QSG-7701BEAS-2BHKC。 0047 对于任何熟悉本领域的技术人员而言， 在不脱离本发明技术方案范围情况下， 都 可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰， 或修改为等同 变化的等效实施例。 因此， 凡是未脱离本发明技术方案的内容， 依据本发明的技术实质对以 上实施例所做的任何简单修改、 等同变化及修饰， 均应仍属于本发明技术方案保护的范围 内。 说明书 4/4 页 6 CN 108865118 A 6 图1 图2 说明书附图 1/2 页 7 CN 108865118 A 7 图3 图4 说明书附图 2/2 页 8 CN 108865118 A 8 。