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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610079557.8 (22)申请日 2016.02.05 C12Q 1/04(2006.01) (71)申请人 夏淑平 地址 261501 山东省潍坊市高密市柏城镇驻 地高密市柏城中心卫生院 (72)发明人 夏淑平 唐志勐 (54) 发明名称 一种产单核李斯特菌选择培养基 (57) 摘要 本发明公开了一种产单核李斯特菌选择培养 基。属于检验微生物培养领域， 其特征在于， 配制 1000ml 培养基的配方中含有 ： 酵母浸出粉、 牛肉 粉、 酪蛋白胨、 琼脂、 葡萄糖、 氯化钠、 葡萄糖酸锌、 磷酸二氢钠、 光谷甘肽、 多粘菌素、。
2、 杆菌肽、 - 羟 基精氨酸、 无菌马血蛋白， 蒸馏水加至 1000ml。本 发明与现有技术相比较， 具有检出可靠， 产单核李 斯特菌分离率高的特点。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 CN 105506054 A 2016.04.20 CN 105506054 A 1.一种产单核李斯特菌选择培养基， 其特征在于配制1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉58g； 牛肉粉610g； 酪蛋白胨610g； 琼脂1520g； 葡萄糖35g； 氯化钠55.5g； 葡萄糖酸锌0.010.05g； 磷酸二氢钠13g； 光谷甘。
3、肽0.10.5g； 多粘菌素0.0010.005g； 杆菌肽0.0010.003g； -羟基精氨酸0.10.3g； 无菌马血蛋白2050g； 蒸馏水加至1000ml。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105506054 A 2 一种产单核李斯特菌选择培养基 技术领域 0001 本发明涉及检验微生物培养领域， 具体涉及一种产单核李斯特菌的选择培养基。 背景技术 0002 微生物培养是一种用人工方法使微生物生长繁殖的技术， 而选择性培养基是用来 促进或抑制一定类型的生物体 （如细胞或细菌等） 而设计的培养基， 利用这种培养基可以将 所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。 产单核李斯特菌 （Li。
4、steriamonocytogenes） 是一种兼性厌氧细菌， 广泛分布在自然环境中， 如土壤、 污水、 饲料、 动物、 健康人及各种生 食和即食食品中， 包括生肉及熟肉制品、 速冻米面食品、 奶酪、 蔬菜、 沙拉和海产品等， 可引 起人类李斯特菌病， 通常是由于人们食用被该菌污染的食物而引起。 感染后主要临床表现 为发热、 上呼吸道感染、 肺炎、 腹泻、 血流感染、 脑膜炎， 或经由孕妇阴部感染腹中胎儿、 引发 脑膜炎， 甚至死亡。 临床症状上与流感相似， 容易误诊。 0003 近年来， 李斯特菌病已不罕见， 在新生儿、 妊娠妇女、 40岁以上及免疫功能受损的 人群中均可发生， 尤其是妊娠妇。
5、女感染李斯特菌的风险是普通人群的30100倍。 早期诊断 并早期治疗， 可100%治愈。 若诊断延误， 病死率可达2030%， 因此作为确诊唯一依据的临床 细菌检查的正确与快速鉴定极为重要。 目前， 该菌属的鉴定金标准为PCR鉴定， 但是PCR检测 设备要求和操作成本均较高， 因此临床培养多用胰酪胨大豆琼脂 （TSA-YE） 。 。 但是产单核李 斯特菌培养阳性率低， 主要是临床培养过程中该菌容易被认为是污染的杂菌 （类白喉杆菌） 而遭丢弃， 且粪便标本中的大肠杆菌、 类白喉杆菌等在目前的培养基上比产单核李斯特菌 生长更快， 很快覆盖了培养基， 产单核李斯特菌无法生长， 结果延误诊疗时间。 发。
6、明内容 0004 本发明的技术任务是针对以上现有技术的不足， 提供一种产单核李斯特菌选择培 养基。 0005 本发明解决其技术问题的技术方案是： 一种产单核李斯特菌选择培养基， 其特征 为， 配制1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉58g； 牛肉粉610g； 酪蛋白胨610g； 琼脂1520g； 葡萄糖35g； 氯化钠55.5g； 葡萄糖酸锌0.010.05g； 磷酸二氢钠13g； 光谷甘肽0.10.5g； 多粘菌素0.0010.005g； 说明书 1/5 页 3 CN 105506054 A 3 杆菌肽0.0010.003g； -羟基精氨酸0.10.3g； 无菌马血蛋白2050g； 。
7、蒸馏水加至1000ml。 0006 上述培养基的制备方法为： 称取酵母浸出粉、 牛肉粉、 酪蛋白胨、 琼脂、 葡萄糖、 氯 化钠、 磷酸二氢钠、 -羟基精氨酸， 混匀蒸馏水溶解， 210， 灭菌15min， 冷却到45， 加入 灭菌葡萄糖酸锌； 灭菌光谷甘肽； 灭菌多粘菌素； 灭菌杆菌肽； 无菌马血蛋白混匀， 灭菌蒸馏 水定容到1000ml后分装。 0007 其中： 所述的牛肉粉、 酪蛋白胨、 葡萄糖提供碳源、 氮源， 酵母浸出粉富含蛋白质、 氨基酸、 多肽、 核苷酸、 维生素、 生长因子、 微量元素等营养成分， 为产单核李斯特菌的繁殖 和生长提供均衡的营养元素； 氯化钠维持均衡的渗透压； 琼。
8、脂为培养基的凝固剂； 葡萄糖酸 锌为营养剂， 发明人发现， 在培养基中加入一定浓度的锌离子， 目标菌的生长状态好于对照 组， 因此推论锌离子有助于该菌的生长； 磷酸二氢钠为缓冲剂， 多粘菌素抑制革兰氏阴性菌 的生长； 杆菌肽 （Bacitracin） ， 实验室研究表明杆菌肽可以抑制革兰阳性细菌和阴性球菌、 肺炎双球菌、 葡萄球菌、 淋球菌、 脑膜炎双球菌等杂菌的生长， 但该浓度下由于对李斯特菌 属无抗菌抑菌作用， 因此提高了产单核李斯特菌的分离率。 通过实验将同一产单核李斯特 菌接种到2个TSA-YE培养基上， 其中一个TSA-YE培养基添加0.01%灭菌光谷甘肽于,37下 培养， 48小时。
9、后观察菌株， 发现添加光谷甘肽的TSA-YE培养基有小的产单核李斯特菌菌落， 没有添加光谷甘肽的TSA-YE培养基未发现产单核李斯特菌菌落， 光谷甘肽可以降低氧化还 原电势， 有利于细胞生长、 分化； 无菌马血蛋白提供能量环境； -羟基精氨酸为激活剂， 可 以促进产单核李斯特菌对矿物质的摄取； 洋芹素为抑菌剂； 山萸肉为山茱萸科植物山茱萸 的果实， 现代医学研究表明， 山萸肉含山茱萸鞣毛， 山茱萸裂甙， 铁、 铝、 铜、 锌、 硼、 磷等21种 元素， 苏氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸等14种氨基酸， 维生素A， 葡萄糖、 果糖、 蔗糖、 熊果酸、 没食子 酸、 苹果酸、 酒石酸等糖类和有机酸类， 。
10、山萸肉水提液是良好的营养强化剂， 并且对金黄色 葡萄球菌、 奈氏卡他球菌、 结核杆菌、 肺炎双球菌、 流感嗜血杆菌、 脊髓灰质炎病毒等均有不 同程度的抑菌作用。 0008 本发明与现有技术相比较， 具有检出可靠、 产单核李斯特菌分离率高的特点。 具体实施方式 0009 以下结合实际情况， 对本发明的具体实施方式作详细说明。 0010 实施例1， 配制1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉5g； 牛肉粉10g； 酪蛋白胨 6g； 琼脂15g； 葡萄糖4g； 氯化钠5g； 磷酸二氢钠1g； 光谷甘肽0.3g； 葡萄糖酸锌0.01g； 多粘菌 素0.001g； 杆菌肽0.003g； 无菌马血蛋。
11、白20g， 蒸馏水加至1000ml。 制备方法： 称取酵母浸出 粉、 牛肉粉、 酪蛋白胨、 琼脂、 葡萄糖、 氯化钠、 磷酸二氢钠， 混匀蒸馏水溶解， 210， 灭菌 15min， 冷却到45， 加入灭菌葡萄糖酸锌； 灭菌光谷甘肽； 灭菌多粘菌素； 灭菌杆菌肽； 无菌 马血蛋白混匀， 灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。 0011 实施例2， 配制1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉5g； 牛肉粉6g； 酪蛋白胨 8g； 琼脂15g； 葡萄糖3g； 氯化钠5g； 磷酸二氢钠3g； 光谷甘肽0.1g； 葡萄糖酸锌0.05g； 多粘 菌素0.003g； 杆菌肽0.001g； -羟基精氨酸0。
12、.1g； 无菌马血蛋白40g， 蒸馏水加至1000ml。 制 说明书 2/5 页 4 CN 105506054 A 4 备方法： 称取酵母浸出粉、 牛肉粉、 酪蛋白胨、 琼脂、 葡萄糖、 氯化钠、 -羟基精氨酸、 磷酸二 氢钠， 混匀蒸馏水溶解， 210， 灭菌15min， 冷却到45， 加入灭菌葡萄糖酸锌； 灭菌光谷甘 肽； 灭菌多粘菌素； 灭菌杆菌肽； 无菌马血蛋白混匀， 灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。 0012 实施例3， 配制1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉5g； 牛肉粉8g； 酪蛋白胨 6g； 琼脂18g； 葡萄糖5g； 氯化钠5.5g； 磷酸二氢钠2g； 光谷甘肽。
13、0.5g； 葡萄糖酸锌0.03g； 多粘 菌素0.005g； 杆菌肽0.001g； 洋芹素0.03g； 无菌马血蛋白50g， 蒸馏水加至1000ml。 制备方 法： 称取酵母浸出粉、 牛肉粉、 酪蛋白胨、 琼脂、 葡萄糖、 氯化钠、 磷酸二氢钠、 洋芹素， 混匀蒸 馏水溶解， 210， 灭菌15min， 冷却到45， 加入灭菌葡萄糖酸锌； 灭菌光谷甘肽； 灭菌多粘 菌素； 灭菌杆菌肽； 无菌马血蛋白混匀， 灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。 0013 实施例4， 配制1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉6g； 牛肉粉10g； 酪蛋白胨 8g； 琼脂18g； 葡萄糖4g； 氯化钠5g；。
14、 磷酸二氢钠2g； 光谷甘肽0.1g； 葡萄糖酸锌0.03g； 多粘 菌素0.005g； 杆菌肽0.002g； 无菌马血蛋白30g； 200g L山萸肉水提液200ml； 蒸馏水加至 1000ml。 制备方法：（1） 取40g山萸肉加水煮沸30min， 过滤， 取滤液， 根据滤液体积， 采取浓缩 或者加水调整体积到浓度为200g/L， 得山萸肉水提液200ml；（2） 称取酵母浸出粉、 牛肉粉、 酪蛋白胨、 琼脂、 葡萄糖、 氯化钠、 磷酸二氢钠， 溶于步骤 （1） 所得的山萸肉提取液中混匀， 210灭菌15min， 冷却到45， 加入灭菌葡萄糖酸锌； 灭菌光谷甘肽； 灭菌多粘菌素； 灭菌杆 。
15、菌肽； 无菌马血蛋白混匀， 灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。 0014 实施例5， 配制1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉6g； 牛肉粉6g； 酪蛋白胨 8g； 琼脂20g； 葡萄糖3g； 氯化钠5.5g； 磷酸二氢钠3g； 光谷甘肽0.5g； 葡萄糖酸锌0.01g； 多 粘菌素0.001g； 杆菌肽0.003g； -羟基精氨酸0.2g； 洋芹素0.03g； 无菌马血蛋白40g， 蒸馏 水加至1000ml。 制备方法： 称取酵母浸出粉、 牛肉粉、 酪蛋白胨、 琼脂、 葡萄糖、 氯化钠、 磷酸 二氢钠、 -羟基精氨酸、 洋芹素， 混匀蒸馏水溶解， 210， 灭菌15min， 冷却到。
16、45， 加入灭 菌葡萄糖酸锌； 灭菌光谷甘肽； 灭菌多粘菌素； 灭菌杆菌肽； 无菌马血蛋白混匀， 灭菌蒸馏水 定容到1000ml后分装。 0015 实施例6， 配制1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉8g； 牛肉粉8g； 酪蛋白胨 10g； 琼脂20g； 葡萄糖3g； 氯化钠5.5g； 磷酸二氢钠3g； 光谷甘肽0.5g； 葡萄糖酸锌0.01g； 多 粘菌素0.001g； 杆菌肽0.003g； -羟基精氨酸0.3g； 无菌马血蛋白50g； 浓度200g L的山萸 肉水提液250ml； 蒸馏水加至1000ml。 制备方法：（1） 取50g山萸肉加水煮沸45min， 过滤， 取滤 液， 根。
17、据滤液体积， 采取浓缩或者加水调整体积到浓度为200g/L， 得山萸肉水提液250ml； （2） 称取酵母浸出粉、 牛肉粉、 酪蛋白胨、 琼脂、 葡萄糖、 氯化钠、 磷酸二氢钠、 -羟基精氨 酸， 溶于步骤 （1） 所得的山萸肉提取液中混匀， 210灭菌15min， 冷却到45， 加入灭菌葡萄 糖酸锌； 灭菌光谷甘肽； 灭菌多粘菌素； 灭菌杆菌肽； 无菌马血蛋白混匀， 灭菌蒸馏水定容到 1000ml后分装。 0016 实施例7， 配制1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉8g； 牛肉粉8g； 酪蛋白胨 10g； 琼脂15g； 葡萄糖4g； 氯化钠5g； 磷酸二氢钠3g； 光谷甘肽0.3g。
18、； 葡萄糖酸锌0.03g； 多粘 菌素0.003g； 杆菌肽0.001g； 洋芹素0.01g； 无菌马血蛋白20g； 浓度200g L的山萸肉水提液 300ml； 蒸馏水加至1000ml。 制备方法：（1） 取60g山萸肉加水煮沸60min， 过滤， 取滤液， 根据 滤液体积， 采取浓缩或者加水调整体积到浓度为200g/L， 得山萸肉水提液300ml；（2） 称取酵 母浸出粉、 牛肉粉、 酪蛋白胨、 琼脂、 葡萄糖、 氯化钠、 磷酸二氢钠、 洋芹素， 溶于步骤 （1） 所得 说明书 3/5 页 5 CN 105506054 A 5 的山萸肉提取液中混匀， 210灭菌15min， 冷却到45， 。
19、加入灭菌葡萄糖酸锌； 灭菌光谷甘 肽； 灭菌多粘菌素； 灭菌杆菌肽； 无菌马血蛋白混匀， 灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。 0017 实施例8， 配制1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉8g； 牛肉粉10g； 酪蛋白胨 6g； 琼脂18g； 葡萄糖3g； 氯化钠5.5g； 磷酸二氢钠2g； 光谷甘肽0.3g； 葡萄糖酸锌0.01g； 多 粘菌素0.005g； 杆菌肽0.001g； -羟基精氨酸0.3g； 洋芹素0.03g； 无菌马血蛋白30g； 浓度 200g L的山萸肉水提液250ml； 蒸馏水加至1000ml。 制备方法：（1） 取60g山萸肉加水煮沸 60min， 过滤， 取。
20、滤液， 根据滤液体积， 采取浓缩或者加水调整体积到浓度为200g/L， 得山萸 肉水提液300ml；（2） 称取酵母浸出粉、 牛肉粉、 酪蛋白胨、 琼脂、 葡萄糖、 氯化钠、 -羟基精 氨酸、 磷酸二氢钠、 洋芹素， 溶于步骤 （1） 所得的山萸肉提取液中混匀， 210灭菌15min， 冷 却到45， 加入灭菌葡萄糖酸锌； 灭菌光谷甘肽； 灭菌多粘菌素； 灭菌杆菌肽； 无菌马血蛋白 混匀， 灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。 0018 所述山萸肉水提液浓度200g/L指的是每升含有生药200g。 0019 本发明所得产单核李斯特菌选择培养基用于粪便标本， 具有检出可靠、 产单核李 斯特菌分离。
21、率高的特点， 为临床资料充分证明， 有关资料如下。 0020 1对象与方法。 0021 1.1培养基制备： 实验组共设4组， 分别为实施例1方案组； 实施例2方案组、 实施例6 方案组、 实施例8方案组， 对照组为酪胨大豆琼脂 （TSA-YE） 培养基， 其配方为： 每升中含有蛋 白胨17.0g； 多价胨3.0g； 氯化钠5.0g； 磷酸氢二钾2.5g； 葡萄糖2.5g； 琼脂15.0。 0022 1.2粪便样本处理、 培养方法： 门诊或住院156例腹泻且伴有类似流感症状患者新 鲜粪便， 悬浮于5ml0.9%生理盐水， 用接种环分区划线接种于实施例1方案组； 实施例2方案 组； 实施例6方案组。
22、； 实施例8方案组和对照组培养基。 接种好的培养基置于35大气条件下 保温培养48h， 挑取细小菌落进行菌属鉴定。 各样本编号送检PCR做分子生物学鉴定。 0023 1.3检出阳性标准： 取出培养皿， 依据 临床微生物学诊断与图解 进行目标菌选择 及鉴定： 观察菌落生长情况， 挑选目标菌涂片， 革兰氏染色， 显微镜镜检。 判断最终结果金标 准为荧光定量PCR结果。 0024 2结果： 156份腹泻患者粪便标本检出菌落经PCR最后鉴定为产单核李斯特菌阳性 的为19例。 48h各组检出阳性、 假阳性、 阴性、 假阴性菌株例数见下表， 分组总数PCR阳性阳性假阳性阴性假阴性 实施例115619163。
23、1406 实施例2156191711393 实施例6156191711393 实施例8156191801381 对照组 （TSA-YE）156196115014 上述结果可以看出， 培养48小时后， 各实施例组与对照组阳性检出率比较均具有明显 差异 （P0.05） ， 且各实施例组的假阴性率均低于对照组， 具有极明显差异 （P0.001） 。 对照 组阳性检出结果与PCR检测结果比较， 阳性检出率差异巨大 （ 2=7.35， P0.05） 。 0025 以上结果表明， 粪便标本经过本发明实施例培养基培养后， 产单核李斯特菌阳性 率与PCR检测差异无统计学差异， 且分离率明显高于现有的培养基， 普通TSA-YE培养基选择 说明书 4/5 页 6 CN 105506054 A 6 性不足， 粪便中杂菌迅速生长覆盖培养基影响产单核李斯特菌的阳性生长， 本发明培养基 可以尽量准确的菌株阳性率， 产单核李斯特菌检出可靠， 阳性分离率高， 从而缩短确诊时 间。 说明书 5/5 页 7 CN 105506054 A 7 。