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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510960660.9 (22)申请日 2015.12.19 C12N 15/82(2006.01) (71)申请人 西北农林科技大学 地址 712100 陕西省西安市杨凌示范区邰城 路 3 号 (72)发明人 孙风丽 奚亚军 张舒梦 刘曙东 张超 (74)专利代理机构 西安智大知识产权代理事务 所 61215 代理人 刘国智 (54) 发明名称 一种荧光标记载体瞬时转化柳枝稷原生质体 的方法 (57) 摘要 本发明公开一种含 GFP 荧光标记质粒转化柳 枝稷原生质体的方法， 柳枝稷种子播种后生长 20 天取植株地上部分， 切成细丝。
2、放入到酶解液中， 28消化细胞壁 5 小时 ； 用细胞筛过滤得到含有 原生质体细胞的溶液 ； 经过 W5 溶液洗涤获得健康 原生质体细胞。 加入荧光标记质粒和转化缓冲液， 28转化 20 分钟 ； 除去转化缓冲液， 在 W5 溶液中 28暗培养 16-18 小时后， 荧光显微镜下进行检 测。 本发明所述方法具有简单高效的特点， 可为柳 枝稷基因功能研究提供技术支持。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 CN 105505980 A 2016.04.20 CN 105505980 A 1.一种荧光载体瞬时转化柳。
3、枝稷原生质体的方法， 其特征在于， 包括以下操作： 1)将柳枝稷种植在营养钵中， 于30下、 16h/8h光照/黑暗的光周期生长， 生长至5 8cm； 2)取培养的柳枝稷幼苗地上部分810g， 切成细丝后放入甘露醇中预培养815min， 过滤取出后将柳枝稷组织放入酶解液中裂解， 28暗培养箱中轻摇45小时； 3)裂解后用细胞筛过滤， 得到含有原生质体的溶液， 离心沉淀后用W5溶液洗涤， 调节原 生质体细胞浓度达到106个/ml； 冰上放置2030min； 4)取100ul原生质体加入10ug纯化去内毒素的带有荧光标记的质粒， 轻柔混匀； 再加入 等体积转化缓冲液， 轻柔混匀； 置入28暗培养箱。
4、中静置培养20分钟； 所述的转化缓冲液包括： 0.6M甘露醇、 100mMCacl2和40体积的PEG4000； 5)转化过的原生质体用W5溶液洗涤， 去除转化缓冲液， 加入W5溶液置入细胞板中， 避光 静置培养16-18小时； 6)将转化体后原生质体吸入离心管中离心去除多余上清， 荧光显微镜下观察GFP表达 情况。 2.如权利要求1所述的荧光载体瞬时转化柳枝稷原生质体的方法， 其特征在于， 所述W5 溶液为： 154mMNaCl、 125mMCaCl2、 5mMKCl、 5mMglucose、 质量百分比0.03的MES用KOH 调pH值至5.8， 高温高压灭菌20分钟。 3.如权利要求1所。
5、述的荧光载体瞬时转化柳枝稷原生质体的方法， 其特征在于， 所述的 酶解液的配制为： 0.6M甘露醇、 10mMpH5.7的MES， 质量百分比1.5的纤维素酶RS、 质量百 分比0.75的离析酶R10混合后， 55水浴15分钟冷却至室温， 再加入质量百分比0.1的 BSA， 3.4mMCacl2，5mM -巯基乙醇和100 g/ml氨苄。 4.如权利要求1所述的荧光载体瞬时转化柳枝稷原生质体的方法， 其特征在于， 所述的 高度纯化去内毒素的带有荧光标记的质粒为Puc35SGFP， 其主要元件排列顺序为LACZ蓝白 斑筛选报告基因(397-185)、 NOS终止子(663-397)、 EGFP(。
6、1383-664)、 多克隆位点(1453- 1389)、 35S启动子(1997-1453)、 氨苄抗性基因启动子及氨苄抗性基因(4223-3169)和细菌 复制子起始位点(3042-2365)。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105505980 A 2 一种荧光标记载体瞬时转化柳枝稷原生质体的方法 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 涉及一种荧光标记载体瞬时转化柳枝稷原生质体的方 法。 背景技术 0002 原生质体是去除了植物细胞壁的有活力的细胞， 不仅是植物生理学、 细胞生物学、 体细胞遗传学等理论研究的理想材料， 而且在生理生化研究、 基因表达调控研究、 基因定位 研究、。
7、 细胞器制备、 细胞融合、 新品种培育等方面也有重要用途。 0003 利用叶肉原生质体瞬时表达系统可以研究基因的功能和调控。 分离的叶肉原生质 体通常是活性较高的均一的细胞群体， 适用于药理学和生化方面的研究、 早期和瞬时应答 研究及DNA转化。 因此， 建立原生质体的分离、 转化及蛋白质瞬时表达系统， 对目的基因的功 能和调控研究具有重要意义。 0004 柳枝稷(英文名Switchgrass， 拉丁名Panicumvirgatum)为禾本科多年生草本C4 类植物， 原生于北美地区， 具有栽培简单、 抗逆性强、 适应性广、 生物量大等特点， 最初主要 被用来作为饲料作物以及园林作物， 20世纪。
8、80年代， 美国能源部门(USDepartmentOf Energy,DOE)将其选为模式能源植物。 此后， 各国均加大了对柳枝稷的研究。 目前国内外对 柳枝稷的研究主要集中在农业科学、 环境科学以及生物能源转化等领域， 对柳枝稷功能基 因组的研究处于初级阶段。 柳枝稷具有很多的优良性状， 如耐旱、 耐贫瘠、 抗病虫害、 植株高 大、 分蘖多等， 具有大量优良基因资源， 因此在柳枝稷中开展功能基因研究具有重要意义。 作为常规的功能研究手段的原生质体转化研究在柳枝稷中较少进行。 发明内容 0005 本发明解决的问题在于提供一种荧光标记载体瞬时转化柳枝稷原生质体方法， 为 在柳枝稷本身细胞中研究目。
9、的基因功能。 为柳枝稷功能基因研究提供技术支持。 0006 本发明是通过以下技术方案来实现： 0007 一种荧光载体瞬时转化柳枝稷原生质体的方法， 包括以下操作： 0008 1)将柳枝稷种植在营养钵中， 于30下、 16h/8h光照/黑暗的光周期生长， 生长至5 8cm； 0009 2)取培养的柳枝稷幼苗地上部分810g， 切成细丝后放入甘露醇中预培养8 15min， 过滤取出后将柳枝稷组织放入酶解液中裂解， 28暗培养箱中轻摇45小时； 0010 3)裂解后用细胞筛过滤， 得到含有原生质体的溶液， 离心沉淀后用W5溶液洗涤， 调 节原生质体细胞浓度达到106个/ml； 冰上放置2030min。
10、； 0011 4)取100ul原生质体加入10ug纯化去内毒素的带有荧光标记的质粒， 轻柔混匀； 再 加入等体积转化缓冲液， 轻柔混匀； 置入28暗培养箱中静置培养20分钟； 0012 所述的转化缓冲液包括： 0.6M甘露醇、 100mMCacl2和40体积的PEG4000； 0013 5)转化过的原生质体用W5溶液洗涤， 去除转化缓冲液， 加入W5溶液置入细胞板中， 说明书 1/3 页 3 CN 105505980 A 3 避光静置培养16-18小时； 0014 6)将转化体后原生质体吸入离心管中离心去除多余上清， 荧光显微镜下观察GFP 表达情况。 0015 所述W5溶液为： 154mMN。
11、aCl、 125mMCaCl2、 5mMKCl、 5mMglucose、 质量百分比 0.03的MES用KOH调pH值至5.8， 高温高压灭菌20分钟。 0016 所述的酶解液的配制为： 0.6M甘露醇、 10mMpH5.7的MES， 质量百分比1.5的纤维 素酶RS、 质量百分比0.75的离析酶R10混合后， 55水浴15分钟冷却至室温， 再加入质量 百分比0.1的BSA， 3.4mMCacl2， 5mM -巯基乙醇和100 g/ml氨苄。 0017 所述的高度纯化去内毒素的带有荧光标记的质粒为Puc35SGFP， 其主要元件排列 顺序为LACZ蓝白斑筛选报告基因(397-185)、 NOS。
12、终止子(663-397)、 EGFP(1383-664)、 多克 隆位点(1453-1389)、 35S启动子(1997-1453)、 氨苄抗性基因启动子及氨苄抗性基因(4223- 3169)和细菌复制子起始位点(3042-2365)。 0018 与现有技术相比， 本发明具有以下有益的技术效果： 0019 以往柳枝稷基因功能研究包括亚细胞定位和蛋白质相互作用等， 需要借助洋葱细 胞或者烟草叶片的异源细胞， 研究有可能不能反映柳枝稷体内真实情况。 本发明提供的方 法使得相关研究可以在柳枝稷本身的细胞中进行， 使得研究柳枝稷目的基因的实验结果更 为可靠。 0020 柳枝稷荧光标记载体瞬时转化柳枝稷。
13、原生质体细胞的方法， 未涉及到复杂的实验 设备， 方便易行。 本发明所用材料为温室或培养箱中生长的柳枝稷幼苗， 不受生长季节的限 制， 实验随时可以进行。 柳枝稷叶片和叶鞘纤维素含量相对于双子叶植物组织较高， 本发明 中使用1.5纤维素酶RS和0.75离析酶R10共同酶解柳枝稷细胞， 获得较为理想的原生质 体， 能够取得较好的转染效果。 附图说明 0021 图1为质粒图谱。 0022 图2为裂解柳枝稷原生质体所用材料。 0023 图3为裂解出来的原生质体。 0024 图4为荧光显微镜下荧光蛋白表达的原生质体细胞。 具体实施方式 0025 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明， 所述是。
14、对本发明的解释而 不是限定。 0026 本发明提供一种高效的荧光标签载体瞬时转化柳枝稷原生质体的技术， 目的是为 在柳枝稷本身细胞中研究目的基因功能。 具有简单、 易行、 高效的特点。 下面结合具体实施 方案对本发明进行进一步详细说明。 所述是对本发明的解释而不是限定。 0027 材料准备： 将柳枝稷(Alamno)种植在营养钵中， 于30下、 16/8光照/黑暗的光周 期生长20天， 生长至5-8cm。 0028 配制各缓冲液： 0029 酶解液： 0.6M甘露醇， 10mMMES(pH5.7)， 质量百分比1.5的纤维素酶RS， 质量百分 说明书 2/3 页 4 CN 105505980 。
15、A 4 比0 .75的离析酶R10。 55水浴15分钟冷却至室温， 再加入质量百分比0 .1BSA， 3.4mMCacl2， 5mM -巯基乙醇和50ug/ml氨苄。 0030 W5溶液： 154mMNaCl， 125mMCaCl2， 5mMKCl， 5mMglucose， 质量百分比0.03的MES 用KOH调pH值至5.8， 高温高压灭菌20分钟， 4保存。 0031 转化缓冲液： 0.6M甘露醇， 100mMCacl2， 40体积的PEG4000， 彻底溶解， 现用现 配。 0032 参见图1， 本发明所采用的质粒为Puc35SGFP， 其主要元件排列顺序为LACZ蓝白斑 筛选报告基因(。
16、397-185)、 NOS终止子(663-397)、 EGFP(1383-664)、 多克隆位点(1453- 1389)、 35S启动子(1997-1453)、 氨苄抗性基因启动子及氨苄抗性基因(4223-3169)和细菌 复制子起始位点(3042-2365)。 0033 酶解： 取柳枝稷地上部分10g， 用锋利刀片切割成细丝， 放入浓度为10ml0.6M的甘 露醇溶液中预培养10min。 过滤后放入酶解液中， 28暗培养箱中轻摇5小时。 裂解出原生质 体镜检待用。 0034 洗涤： 裂解好的组织用200目细胞筛过滤， 得到含有原生质体的溶液， 300g离心5分 钟后， 沉淀即为原生质体细胞。。
17、 用W5重悬后离心(300g， 5分钟)去除上清， 重复一次。 加入适 量W5溶液使原生质体细胞浓度达到106个/ml。 冰上放置30分钟。 0035 原生质体细胞转化： 取100 l原生质体加入10 g去内毒素质粒， 轻柔混匀。 再加入 等体积转化缓冲液， 轻柔混匀。 置入28暗培养箱中静置培养20分钟。 0036 原生质体细胞细胞培养： 转化过的原生质体用W5溶液洗涤， 去除转化缓冲液， 加入 1mlW5溶液置入6孔细胞培养板中， 避光静置培养16-18小时。 0037 吸入离心管中300g离心2分钟去除多余上清， 留少量底部供观察。 0038 观察转化后的原生质体细胞： 用荧光显微镜观察488nm激发观察绿色荧光以观察 GFP表达情况。 0039 观察结果如图4所示， 可以看到绿色荧光， 而且荧光非常明显， 表明转染效果良好。 0040 以上给出的实施例是实现本发明较优的例子， 本发明不限于上述实施例。 本领域 的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、 替换， 均属于本 发明的保护范围。 说明书 3/3 页 5 CN 105505980 A 5 图1 图2 说明书附图 1/2 页 6 CN 105505980 A 6 图3 图4 说明书附图 2/2 页 7 CN 105505980 A 7 。