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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201511008331.0 (22)申请日 2015.12.30 C12N 5/0775(2010.01) (71)申请人 上海大学 地址 200444 上海市宝山区上大路 99 号 (72)发明人 尹静波 宋丽 张坤玺 张丽丽 (74)专利代理机构 上海上大专利事务所 ( 普通 合伙 ) 31205 代理人 顾勇华 (54) 发明名称 一种用于培养干细胞聚集体的培养皿的制作 方法 (57) 摘要 本发明公开了一种用于培养干细胞聚集体的 培养皿的制作方法， 依据抗细胞粘附原理， 将亲水 性材料单组份或者多组分交联体系以不同涂覆方 式涂覆。
2、于普通培养皿表面， 再通过不同的干燥方 法制备得到用于干细胞聚集体培养的培养皿。该 培养皿可阻断细胞的贴壁粘附， 使干细胞自发聚 集形成干细胞聚集体， 且所形成的干细胞聚集体 中包含大量的细胞 - 细胞相互作用， 模拟体内细 胞所处的微环境， 表现出优异的干性维持能力和 诱导分化能力。本发明制备的培养皿可直接用于 干细胞聚集体的培养， 且操作便捷、 高效、 可控， 使 干细胞聚集体能够更广泛地用于细胞学研究， 干 细胞治疗或组织工程。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 105543166 A 2016。
3、.05.04 CN 105543166 A 1.一种用于培养干细胞聚集体的培养皿的制作方法， 其特征在于： 采用单组份的亲水 性材料或者多组份亲水性材料交联制备的材料体系作为涂覆材料， 并控制涂覆材料的溶液 的质量浓度为1-5wt%， 然后将涂覆材料均匀涂布于传统培养皿表面上形成湿膜， 再通过干 燥方法， 将培养皿上的湿膜固化在培养皿表面上， 干燥成膜， 制备得到用于培养干细胞聚集 体的培养皿。 2.根据权利要求1所述用于培养干细胞聚集体的培养皿的制作方法， 其特征在于： 所述 亲水性材料采用壳聚糖、 聚丙烯酸、 聚乙二醇、 聚L-谷氨酸、 海藻酸钠、 透明质酸、 葡聚糖和 透明质酸中的任意一。
4、种材料或任意几种材料， 其中壳聚糖的脱乙酰度为6090%。 3.根据权利要求1或2所述用于培养干细胞聚集体的培养皿的制作方法， 其特征在于： 所述培养皿的基质材料为塑料。 4.根据权利要求3所述用于培养干细胞聚集体的培养皿的制作方法， 其特征在于： 所述 培养皿的基质材料是聚丙烯或聚苯乙烯。 5.根据权利要求1或2所述培养皿用于干细胞聚集体培养方法， 其特征在于： 通过在培 养皿上制备不同的亲水性材料薄膜涂层来制备不同的培养皿， 进而调节控制形成微团聚集 体的直径尺寸。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105543166 A 2 一种用于培养干细胞聚集体的培养皿的制作方法 技术领域 0001。
5、 本发明属于生物再生医学技术领域， 具体涉及一种干细胞聚集体的培养方法和用 于培养干细胞聚集体的培养皿的制作方法。 背景技术 0002 干细胞是一类是具有自我复制能力的多潜能细胞， 能够诱导分化为骨， 软骨， 神 经， 脂肪等细胞， 可以作为种子细胞应用到组织工程， 自发现以来受到广泛关注。 0003 传统的干细胞培养方式一般是在培养皿上进行二维单层贴壁培养。 目前有研究发 现， 相比于传统的二维单层贴壁培养的干细胞， 干细胞三维聚集体培养的干细胞具有如下 优势： 干细胞聚集体中存在广泛的细胞-细胞间相互作用， 更好地模拟了细胞在体内所处的 微环境， 使得干细胞的诱导分化能力和干性维持能力更强。
6、， 细胞活性更高。 0004 目前细胞聚集体的培养方法有持续搅拌的悬浮培养， 悬滴培养， 离心和磁性纳米 颗粒介导等方法。 利用这些方法均能形成细胞聚集体， 但是或操作复杂， 或需要特殊装置， 耗时费力且不利于技术人员操作和大范围的应用。 理想的细胞聚集体培养方法是既能便 捷、 高效、 可控地实现细胞聚集体形成， 同时又能方便技术人员收集和应用细胞聚集体。 总 之， 目前细胞聚集体的培养方法还不够理想。 发明内容 0005 为了解决现有干细胞聚集体的培养技术问题， 本发明的目的在于克服已有技术存 在的不足， 提供一种培养干细胞聚集体的培养皿的制作方法， 这种培养皿可直接用于培养 干细胞聚集体。。
7、 本发明依据抗细胞粘附原理， 将亲水性材料的单组份或者多组分进行交联， 应用各类涂覆方式涂覆于普通培养皿表面， 再通过不同的干燥方法制作用于干细胞聚集体 培养的培养皿。 这种培养皿可用于大范围干细胞聚集体的培养， 且操作便捷、 高效、 可控， 使 干细胞聚集体能够更广泛地用于细胞学研究， 干细胞治疗或组织工程。 0006 为达到上述发明创造目的， 本发明采用下述技术方案： 一种用于培养干细胞聚集体的培养皿的制作方法， 采用单组份亲水性材料进行溶解或 者多组分亲水性材料进行溶解交联后制备得到的材料体系作为涂覆材料， 并控制涂覆材料 的溶液的质量浓度为1-5wt%， 然后将涂覆材料均匀涂布于传统培。
8、养皿表面上形成湿膜， 再 通过干燥方法， 将培养皿上的湿膜固化在培养皿表面上， 干燥成膜， 制备得到用于培养干细 胞聚集体的培养皿。 0007 作为本发明优选的技术方案， 所述亲水性材料优选采用壳聚糖、 聚丙烯酸、 聚乙二 醇、 聚L-谷氨酸、 海藻酸钠、 透明质酸、 葡聚糖和透明质酸中的任意一种材料或任意几种材 料， 其中壳聚糖的脱乙酰度为6090%。 0008 作为本发明上述方案的进一步优选的技术方案， 所述培养皿的基质材料为塑料。 所述培养皿的基质材料进一步优选为聚丙烯或聚苯乙烯。 0009 本发明制作的用于培养干细胞聚集体的培养皿， 在培养干细胞聚集体之前， 首先 说明书 1/3 页 。
9、3 CN 105543166 A 3 对用于干细胞聚集体培养的培养皿进行消毒和杀菌处理， 然后将干细胞接种于洁净的培养 皿上， 使干细胞在培养皿上自发聚集， 形成直径为50200 m的球状的微团聚集体， 微团形 成时间少于72h。 本发明利用抗细胞粘附原理， 利用涂覆在传统培养皿上的亲水性材料阻断 细胞在所制备的培养皿上的粘附， 让细胞在所制备的培养皿上自发聚集形成直径范围约 50-200 m的聚集体， 具体直径可通过涂层材料调控。 而直径50-200 m的聚集体是较为适宜 的聚集体培养尺寸， 聚集体内细胞的存活能力强， 在诱导因子的作用下， 定向分化能力高。 0010 本发明制备的用于干细胞。
10、聚集体培养的培养皿适用的干细胞可为以下细胞， 包括 但不限于： 胚胎干细胞和间充质干细胞， 间充质干细胞包括脂肪干细胞、 骨髓干细胞和滑膜 间充质干细胞。 0011 作为本发明上述方案的进一步优选的技术方案， 优选通过在培养皿上制备不同的 亲水性材料薄膜涂层来制备不同的培养皿， 进而来调节控制形成微团聚集体的直径尺寸。 0012 本发明与现有技术相比较， 具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点： 1.本发明制备的培养皿可直接用于干细胞聚集体的培养， 且操作便捷、 高效、 可控， 使 干细胞聚集体能够更广泛地用于细胞学研究， 干细胞治疗或组织工程； 2.本发明所选的传统培养皿直径范围不限， 。
11、适用于多种尺寸的培养皿， 扩大了培养皿 的应用范围和适用生物领域； 3.本发明制备的培养皿可阻断细胞的贴壁粘附， 使干细胞自发聚集形成干细胞聚集 体， 且所形成的干细胞聚集体中包含大量的细胞-细胞相互作用， 模拟体内细胞所处的微环 境， 表现出优异的干性维持能力和诱导分化能力。 附图说明 0013 图1是荧光显微镜拍摄的人脂肪干细胞在本发明实施例一制作的培养皿上自发聚 集形成的聚集体照片。 具体实施方式 0014 本发明的优选实施例详述如下： 实施例一： 在本实施例中， 一种用于培养干细胞聚集体的培养皿的制作方法， 具体为： 在常温搅拌 下， 取自制的脱乙酰度为80%的壳聚糖粉末0.06g分散。
12、于6ml去离子水中， 滴加醋酸调节pH 至4-5， 使得其完全溶解， 壳聚糖溶液的浓度为1wt%。 选用的直径为120mm的聚丙烯培养皿， 将这6ml脱乙酰度为80%的壳聚糖溶液均匀涂布在传统培养皿上， 在室温25条件下干燥48 h后， 将所制得的涂覆有薄膜材料的培养皿依次浸泡在梯度无水乙醇溶液中去除残留醋酸， 然后再次在室温条件下干燥48h， 制备得到可用于培养干细胞聚集体的培养皿。 0015 在本实施例中， 一种将本实施例制备的培养皿用于干细胞聚集体的培养方法， 具 体为： 首先对用于培养干细胞聚集体的培养皿进行紫外消毒和杀菌处理， 然后将体外扩增 至P3的人脂肪干细胞消化收集后， 调整细。
13、胞浓度为5105cells/ml， 接种于所制备得到的 培养皿上， 72h后人脂肪干细胞在培养皿上自发聚集， 形成直径约为90-110 m的聚集体， 参见图1。 本实施例将抗细胞粘附贴壁的亲水性材料涂覆在传统培养皿上， 然后利用干燥方 法， 制得抗细胞粘附、 能够使干细胞自发聚集形成聚集体的培养皿。 说明书 2/3 页 4 CN 105543166 A 4 0016 实施例二： 本实施例与实施例一基本相同， 特别之处在于： 在本实施例中， 一种用于培养干细胞聚集体的培养皿的制作方法， 具体为： 在常温搅拌 下， 取自制的脱乙酰度为70%的壳聚糖粉末0.06g分散于6ml去离子水中， 滴加醋酸调。
14、节pH至 4-5， 使得其完全溶解， 壳聚糖溶液的浓度为1wt%。 选用的直径为120mm的聚丙烯培养皿， 将 这6ml脱乙酰度为70%的壳聚糖溶液均匀涂布在传统培养皿上， 在室温25条件下干燥48h 后， 将所制得的涂覆有薄膜材料的培养皿依次浸泡在梯度无水乙醇溶液中去除残留醋酸， 然后再次在室温条件下干燥48h， 制备得到用于培养干细胞聚集体的培养皿。 0017 在本实施例中， 一种将本实施例制备的培养皿用于干细胞聚集体的培养方法， 具 体为： 首先对用于干细胞聚集体培养的培养皿进行紫外消毒和杀菌处理， 然后将体外扩增 至P3的人脂肪干细胞消化收集后， 调整细胞浓度为5105cells/ml。
15、， 接种于所制备得到的 培养皿上， 72h后人脂肪干细胞在培养皿上自发聚集， 形成直径约为130-150 m的聚集体。 0018 实施例三： 本实施例与前述实施例基本相同， 特别之处在于： 在本实施例中， 一种用于培养干细胞聚集体的培养皿的制作方法， 具体为： 在常温搅拌 下， 滴加3mol/L的NaOH将一定量的聚L-谷氨酸溶解于去离子水中， 并调节聚L-谷氨酸溶液 的pH至中性， 然后向聚L-谷氨酸溶液顺序加入定量NHS和EDC粉末用于活化聚L-谷氨酸上侧 链羧基， 控制聚L-谷氨酸、 NHS和EDC的摩尔比为1:1:5， 在活化聚L-谷氨酸侧链羧基8h后， 再 向混合体系中加入一定量的溶。
16、解好的自制脱乙酰度为60%的pH为4-5的壳聚糖溶液， 进行化 学交联， 并控制聚L-谷氨酸上的羧基含量与脱乙酰度为60%的壳聚糖的氨基含量的摩尔比 值为1:1， 以及控制整个聚L-谷氨酸/壳聚糖双组份复合体系的聚合物浓度为1-5wt%。 取一 定量的交联后的复合体系材料涂覆于传统培养皿上， 在培养皿表面上形成湿膜， 然后在室 温25条件下干燥48h后， 再将制得的涂覆有薄膜材料的培养皿用去离子水透析干净， 然后 再次在室温条件下干燥48h， 制备得到可用于培养干细胞聚集体的培养皿。 0019 在本实施例中， 一种将本实施例制备的培养皿用于干细胞聚集体的培养方法， 具 体为： 首先对用于培养干。
17、细胞聚集体的培养皿进行紫外消毒和杀菌处理， 然后将体外扩增 至P3的人脂肪干细胞消化收集后， 调整细胞浓度为5105cells/ml， 接种于所制备得到的 培养皿上， 72h后人脂肪干细胞在培养皿上自发聚集， 形成直径约为100-120 m的聚集体。 0020 上面结合附图对本发明实施例进行了说明， 但本发明不限于上述实施例， 还可以 根据本发明的发明创造的目的做出多种变化， 凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下 做的改变、 修饰、 替代、 组合或简化， 均应为等效的置换方式， 只要符合本发明的发明目的， 只要不背离本发明培养干细胞聚集体的培养皿的制作方法和发明构思， 都属于本发明的保 护范围。 说明书 3/3 页 5 CN 105543166 A 5 图1 说明书附图 1/1 页 6 CN 105543166 A 6 。