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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201511028040.8 (22)申请日 2015.12.30 C12Q 1/34(2006.01) (71)申请人 广州医科大学 地址 510182 广东省广州市越秀区东风西路 195 号 (72)发明人 彭享 董伟华 香咏欣 王菡 孔天翰 (74)专利代理机构 广州知友专利商标代理有限 公司 44104 代理人 宣国华 马赟斋 (54) 发明名称 一种快速测定透明质酸酶活性的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种快速测定透明质酸酶活性 的方法， 包括以下步骤 ： (1) 采用醋酸钠醋酸缓冲 液配制透明质酸溶液， 溶液 pH 值 ：。
2、 3pH 7 ； (2) 配制十六烷基三甲基溴化铵溶液 ； (3) 取步骤 (1) 的透明质酸溶液， 加入透明质酸酶溶液在 37反 应 0.5 1 小时， 加入十六烷基三甲基溴化铵溶 液后 37下继续反应 8 15 分钟， 获得样品溶 液 ； (4) 制备对照溶液 ： 取步骤 (1) 的透明质酸溶 液， 加入十六烷基三甲基溴化铵溶液， 37下反应 8 15 分钟， 获得对照溶液 ； (5) 采用酶标仪在 波长 400nm 下测定对样品溶液和对照溶液的光密 度值 ； (6) 根据所获得的样品溶液和对照溶液的 光密度值采用计算获得透明质酸酶的活力及比活 力。该方法操作简单， 稳定性好， 灵敏度和可。
3、重复 性高， 为透明质酸酶的规模化提取、 制备及应用奠 定基础。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图5页 CN 105524977 A 2016.04.27 CN 105524977 A 1.一种快速测定透明质酸酶活性的方法， 其特征是， 包括以下步骤： (1)配制透明质酸溶液： 采用醋酸钠缓冲液配制透明质酸溶液， 溶液pH为： 3pH 7； (2)配制十六烷基三甲基溴化铵溶液； (3)制备样品溶液： 取步骤(1)的透明质酸溶液， 加入透明质酸酶溶液在37反应0.5 1小时， 加入十六烷基三甲基溴化铵溶液后37下。
4、继续反应815分钟， 获得样品溶液； (4)制备对照溶液： 取步骤(1)的透明质酸溶液， 加入十六烷基三甲基溴化铵溶液， 37 下反应815分钟， 获得对照溶液； (5)测定光密度值： 采用酶标仪在波长400nm下测定对样品溶液和对照溶液的光密度 值； (6)计算结果： 根据所获得的样品溶液和对照溶液的光密度值采用下式计算获得透明 质酸酶的活力及比活力， A对 照为对照溶液的光密度值， A酶为样品溶液的光密度值， 浓度为样品溶液的浓度， 加样量为样品溶 液的加样量。 2.根据权利要求1所述的快速测定透明质酸酶活性的方法， 其特征是， 所述步骤(1)的 醋酸钠缓冲液的离子强度在0.5M以下且3p。
5、H 7。 3.根据权利要求2所述的快速测定透明质酸酶活性的方法， 其特征是， 所述醋酸钠缓冲 液由0.2M醋酸钠缓冲液添加不同质量的氯化钠配制而成。 4.根据权利要求1或2或3所述的快速测定透明质酸酶活性的方法， 其特征是， 所述步骤 (1)的透明质酸溶液浓度为0.51.5 g/ l。 5.根据权利要求1或2所述的快速测定透明质酸酶活性的方法， 其特征是， 所述步骤(2) 的十六烷基三甲基溴化铵溶液为， 2.5gCTAB溶解于100ml2的NaOH中， 浓度为2.5， 并于 25以上温度下储存。 6.根据权利要求5所述的快速测定透明质酸酶活性的方法， 其特征是， 所述步骤(3)中 透明质酸酶溶。
6、液由透明质酸酶溶解于醋酸钠缓冲液构成。 7.根据权利要求6所述的快速测定透明质酸酶活性的方法， 其特征是， 所述透明质酸酶 溶液以含透明质酸酶的粗蛋白进行配制时， 溶液的蛋白浓度为35 g/ l， 加样量为2040 l。 8.根据权利要求6所述的快速测定透明质酸酶活性的方法， 其特征是， 所述透明质酸酶 溶液以纯透明质酸酶进行配制时， 溶液的蛋白浓度为0.10.3 g/ l， 加样量为38 l。 9.根据权利要求6所述的快速测定透明质酸酶活性的方法， 其特征是， 所述步骤(3)和 (4)的十六烷基三甲基溴化铵溶液的添加量为200 l。 10.根据权利要求1所述的快速测定透明质酸酶活性的方法， 。
7、其特征是， 所述透明质酸 酶来源于蛇毒。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105524977 A 2 一种快速测定透明质酸酶活性的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种透明质酸酶活性的方法， 尤其一种快速测定透明质酸酶活性的方 法。 背景技术 0002 透明 质酸酶有三类同工酶 ， 第一类为经典的透明 质酸酶( 透明 质酸酶EC 3.2.1.35)， 多存在哺乳动物的睾丸中， 蛇毒中的透明质酸酶也属于此类； 第二类为透明质 酸酶EC3.2.1.36， 多存在水蛭的唾液腺中； 第三类为透明质酸酶EC4.2.2.1， 多来源于细 菌、 真菌、 噬菌体等微生物。 不同种属来源的透明质酸酶的最适p。
8、H值、 等电点以及分子量都 不相同， 透明质酸酶的活性分为酸性活性(acidactive)和中性活性(neutralactive)， 前 者最适pH值在3与4之间， 后者最适pH值在5与6之间。 0003 透明质酸又名玻尿酸， 主要功能有保水， 保湿， 抗衰老， 促进伤口愈合， 减少伤口炎 症。 其基本结构是一条无支链的多聚糖。 十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammonium bromide， CTAB)， 是一种阳离子表面活性剂， 被广泛应用于DNA的提取、 粘多糖的测量、 改变 固体表表面的湿润性、 电池稳定剂等。 1955年， FerranteN发现透明质酸与CTAB。
9、在一定条件 发生反应产生浊度， 在紫外分光光度计400nm下呈线性相关； 陈永浩等人首次将CTAB测定透 明质酸含量的方法称之为CTAB浊度法( “发酵液中透明质酸含量快速检测方法研究J” ， 食 品与发酵工业.2009,35(1)。 0004 DorfmanA等用牛睾丸酶解透明质酸， 用酸性蛋白与小分子透明质酸反应产生浊 度， 在600nm测吸光度， 酸性蛋白需要在4操作， 其实验条件要求高， 重复性差。 SternM等 用ELISA使透明质酸覆盖在板孔中， 时间为10h， 然后用透明质酸酶进行酶解， 洗去降解的透 明质酸， 用牛血清白蛋白进行反应， 在492nm下测吸光度， 此方法反应时间。
10、长， 条件要求高， 且不足以反应透明质酸酶活性。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种快速测定透明质酸酶活性的方法， 该方法操作简单， 稳定性好， 灵敏度和可重复性高， 为透明质酸酶的规模化提取、 制备及其应用奠定基础。 0006 本发明的目的通过以下技术方案来实现： 一种快速测定透明质酸酶活性的方法， 包括以下步骤： 0007 (1)配制透明质酸溶液： 采用醋酸钠缓冲液配制透明质酸溶液， 溶液pH为： 3pH 7； 0008 (2)配制十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液； 0009 (3)制备样品溶液： 取步骤(1)的透明质酸溶液， 加入透明质酸酶溶液在37反应 0.51小时， 加。
11、入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液后37下继续反应815分钟， 获得样 品溶液； 0010 (4)制备对照溶液： 取步骤(1)的透明质酸溶液， 加入十六烷基三甲基溴化铵溶液， 说明书 1/6 页 3 CN 105524977 A 3 37下反应815分钟， 获得对照溶液； 0011 (5)测定光密度值： 采用酶标仪在波长400nm下测定对样品溶液和对照溶液的光密 度值(OD值)； 0012 (6)计算结果： 根据所获得的样品溶液和对照溶液的光密度值采用下式计算获得 透明质酸酶的活力及比活力， 0013A对 照为对照溶液的光密度值， A酶为样品溶液的光密度值， 0014浓度为样品溶液的浓度，。
12、 加样量为样 品溶液的加样量。 0015 CTAB中氮原子与透明质酸中羧基的氧原子形成配对， 从而形成不溶于水的复合 物， 且经实验证明， CTAB与透明质酸结合所产生的浊度与溶液中透明质酸的量成正相关。 利 用透明质酸酶对透明质酸的专一性， 让透明质酸酶部分分解透明质酸， 将大分子透明质酸 分解为小分子化合物， 与CTAB反应形成的复合物减少， 降低了样品溶液的浊度， 因而可根据 样品溶液和对照溶液的OD值差值计算获得透明质酸酶的活性。 由于透明质酸分子量小于 15000Da不能产生足够的电荷与CTAB产生连续的吸附， 以至不产生浊度， 不遵循朗伯-比尔 定律， 导致无法获得准确的测定结果。。
13、 因此， 在测定过程中应避免过度酶解， 酶解反应时间 不宜过长， 一般控制在0.51小时， 以保留部分透明质酸不被分解， 保证检测结果的准确 性。 CTAB既能和未被酶解成小分子的透明质酸合成， 使溶液产生浊度， 又能终止透明质酸酶 的酶解反应， 优化了终止酶解步骤， 因而简化了本发明的操作步骤。 0016 在本发明人实验过程中发现离子强度和pH值均对CTAB与透明质酸结合产生的浊 度有较大影响。 其中离子强度越高， 对CTAB与透明质酸结合产生的浊度影响越大， 在离子强 度高于0.5M后， 不产生浊度； 而pH值的影响较为温和， 当pH值 5的时候对CTAB浊度法基本 无影响， pH值3时C。
14、TAB与透明质酸结合不产生浊度。 CTAB与透明质酸结合不产生浊度， 会 导致无法准确检测透明质酸酶的活性。 故， 所述步骤(1)的醋酸钠缓冲液的离子强度在0.5M 以下且3pH 7。 具体地， 以0.2M醋酸钠缓冲液为基础添加氯化钠以调整离子强度， 调整离 子强度在00.5M范围内。 本发明中所述离子强度均为氯化钠的离子强度。 0017 所述步骤(1)的透明质酸溶液浓度为0.51.5 g/ l。 0018 所述步骤(2)的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液为， 2.5gCTAB溶解于100ml2 (w/v)的NaOH中， 浓度为2.5(w/v)， 在本发明人的实验过程中发现20时候会出现大。
15、量成 团结晶， 因此该溶液要在25以上储存， 防止温度太低导致CTAB结晶。 0019 所述步骤(3)中透明质酸酶溶液由透明质酸酶溶解于醋酸钠缓冲液构成， 在测透 明质酸酶活性的过程中， 蛋白量很重要， 量太少， OD值减少不明显， 容易出现假阴性， 但是也 要防止过度酶解， 特别是经过提纯的透明质酸酶， 其量应该要比粗蛋白减少到它的提纯倍 数。 所以若含透明质酸酶的粗蛋白进行配制， 则配成的蛋白浓度为35 g/ l， 加样量为20 40 l； 若纯透明质酸酶进行配制， 则配成的蛋白浓度为0.10.3 g/ l， 加样量为38 l。 本发明所述的透明质酸酶可以从各种来源获得， 作为本发明的一个。
16、实施例， 所述透明质酸 酶来源于蛇毒。 0020 所述步骤(3)和(4)的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液的添加量为200 l。 说明书 2/6 页 4 CN 105524977 A 4 0021 本发明与现有技术相比具有以下优点： 0022 (1)本发明运用CTAB与透明质酸结合的原理来测透明质酸酶活性， 以透明质酸为 指示剂， 通过CTAB法测定透明质酸酶活性。 0023 CTAB中氮原子与透明质酸中羧基的氧原子形成配对， 从而形成不溶于水的复合 物， 且CTAB与透明质酸结合所产生的浊度与溶液中透明质酸的量成正相关。 透明质酸酶水 解部分透明质酸， 将部分大分子透明质酸分解为小分子化。
17、合物， 那么与CTAB形成不溶于水 的复合物减少， 溶液的浊度就会降低， 从而与对照溶液的检测结果进行计算， 获得透明质酸 酶的活性。 0024 (2)本发明耗时短： 0025 透明质酸分子量小于15000Da不能产生足够的电荷与CTAB产生连续的吸附， 以至 不产生浊度， 不遵循朗伯-比尔定律， 因此， 在测定过程中应避免过度酶解， 因而酶解反应时 间不宜过长， 一般控制在0.51小时， 以保留部分透明质酸不被分解， 保证检测结果的准确 性。 0026 (3)CTAB既能和未被酶解成小分子的透明质酸合成， 使溶液产生浊度， 又能终止透 明质酸酶的酶解反应， 优化了终止酶解步骤， 因而简化了操。
18、作步骤。 0027 (4)透明质酸酶是透明质酸的专一性水解酶， 不会受其他杂蛋白的影响， 故透明质 酸酶无需经过提纯， 也能获得准确的检测结果， 测定稳定性好， 灵敏度高， 可重复性高。 0028 (5)本发明用酶标仪代替紫外分光光度计来检测， 可同时测定多个样品， 一次性可 进行96孔检测， 非常便捷， 还能减少比色皿的误差， 可取得更好的测定效果。 0029 (6)本发明操作简单、 快速、 稳定性好且灵敏度高， 在透明质酸及透明质酸酶的制 备、 检测等方面具有较高的应用价值。 0030 (7)本发明尤其适用于对蛇毒来源的透明质酸酶活性的检测 具体实施方式 0031 图1是CTAB与透明质酸。
19、反应产生浊度的标准曲线(酶标仪检测OD值)； 0032 图2是不同离子强度对CTAB法测透明质酸OD值的影响； 0033 图3-A是离子强度为0M的CTAB法测透明质酸含量的标准曲线； 0034 图3-B是离子强度为0.1M的CTAB法测透明质酸含量的标准曲线； 0035 图3-C是离子强度为0.2M的CTAB法测透明质酸含量的标准曲线； 0036 图3-D是离子强度为0.3M的CTAB法测透明质酸含量的标准曲线； 0037 图3-E是离子强度为0.4M的CTAB法测透明质酸含量的标准曲线； 0038 图3-F是离子强度为0.5M的CTAB法测透明质酸含量的标准曲线； 0039 图4是不同pH。
20、值对CTAB法测透明质酸OD值的影响。 具体实施方式 0040 0041 以下实施例仅用于阐述本发明， 但是本发明的保护范围并非仅仅局限于此， 本技 术领域的普通技术人员通过以上本发明公开内容均可实现本发明的目的。 0042 实施例1： 酶标仪代替紫外分光光度计做透明质酸含量的标准曲线 说明书 3/6 页 5 CN 105524977 A 5 0043 食品与发酵工业.2009,35(1)中的 “发酵液中透明质酸含量快速检测方法研究 J” 公开的CTAB法测透明质酸含量检测仪器多为紫外分光光度计， 然而紫外分光光度计不 能同时测量多个样品， 且需要样品量较大。 酶标仪能同时测量多个样品， 用一。
21、次性96孔板， 操作非常便捷， 还能减少比色皿的误差。 0044 将550 l透明质酸(浓度为1 g/ l)加入有200 l醋酸钠缓冲液1.5mlEP管， 不足 250ul的用醋酸钠缓冲液补充， 然后加500ulCTAB， 放入37水浴锅， 自加入开始计时， 反应 时间10min； 然后准确取200 l到96孔板， 用酶标仪在波长400nm测OD值， 并做标准曲线和线 性相关。 从图1可见， R20.997， 呈直线线性相关， 陈永浩等用紫外分光光度计在400nm测透 明质酸含量的其R20.999， 两者相比p值0.05， 无显著性差异； 因此酶标仪完全可以代替 紫外分光光度计。 0045 实。
22、施例2： 离子强度对CTAB浊度法的影响 0046 以0.2M醋酸钠缓冲液为基础， 在不变pH6条件下用氯化钠调离子强度分别为0、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9M(本文所述离子强度均为氯化钠的离子强度)， 将 10个不同离子强度的醋酸钠缓冲液并取透明质酸为50 g与之配成1 g/ l透明质酸溶液， 然 后加500ulCTAB， 放入37水浴锅， 自加入开始计时， 反应时间10min； 然后准确取200 l溶液 到96孔板， 采用酶标仪在波长400nm测溶液的OD值。 0047 从图2可见， 随着离子强度的升高， 其OD值越小； 表1可见。
23、， 0.6M以上的离子强度与 对照相比几乎不产生浊度。 从图3-A至图3-F以及表2可见各离子强度的线性相关R值相比较 P值0.05， 无显著性差异， 可见离子强度虽然影响CTAB浊度的产生， 但不影响其标准曲线 的R值， 故在做CTAB法测透明质酸含量及透明质酸酶活性时候， 只需选定0.5M以下的离子强 度。 0048 表1： 不同离子强度的OD值 0049 0050 a.不加入透明质酸， 以50ul醋酸钠缓冲液代替 0051 表2不同离子强度的R2值 0052 0053 P值0.05， 各组之间R值无显著性差异。 0054 实施例3： pH值对CTAB浊度法影响 0055 透明质酸酶活性p。
24、H一般在3-7之间， 故以0.2M醋酸钠缓冲液为基础， 用冰乙酸调pH 值， 配置不同pH值的透明质酸溶液， 浓度为1 g/ l， 溶液pH值分别为3、 4、 5、 6、 7， 在CTAB浊度 法实验过程中发现当pH3时不产生浊度。 分别取不同pH值透明质酸溶液50ul， 加入已标记 好的不同1.5mlEP管中， 管中有200ul的不同pH值的醋酸钠缓冲液。 加入500 l的CTAB溶液， 在37水浴锅中反应10min后， 精确取200ul反应液加入96孔板， 采用酶标仪在波长400nm下 测量OD值 说明书 4/6 页 6 CN 105524977 A 6 0056 图4可见， 随着pH的增。
25、高， OD值也相应的增高， 当pH 5时OD值趋于平衡， 对CTAB法 测透明质酸不产生影响， pH3时的OD值为0.043， 未加透明质酸用pH6醋酸钠缓冲液的对 照OD值为0.048， 两者对比无差异， 故pH3时CTAB与透明质酸不产生浊度。 因透明质酸酶对 pH敏感， 多数透明质酸酶在pH3-7之间有活性， 所以在测定透明质酸含量和透明质酸活性的 时候， 可根据实验自身需求来选取pH值。 0057 实施例4： CTAB浊度法测透明质酸酶活性 0058 醋酸钠缓冲液(Acetatebuffer)： 16.406g无水醋酸钠和8.766g氯化钠溶于800ml 蒸馏水中， 用冰乙酸调pH值4。
26、.6， 并定容100ml， 制得含0.15M氯化钠的0.2M醋酸钠缓冲液， 离子强度0.15M。 0059 透明质酸溶液： 精确称量10mg透明质酸溶解于10ml的醋酸缓冲液， 搅拌至透明质 酸完全溶解， 配成1ug/ul的透明质酸溶液。 溶解后的透明质酸建议用玻璃瓶装， 实验过程中 发现透明质酸溶液会贴壁于塑料离心管， 若出现这种情况， 为保证透明质酸的浓度， 必须重 新配置。 0060 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液： 2.5gCTAB溶解于100ml2(W/V)的NaOH。 0061 眼镜蛇毒来源的透明质酸酶溶液制备(以舟山眼镜蛇毒的透明质酸酶为例)： 取蛇 毒粗毒溶解于pH4.6。
27、的0.2M醋酸钠缓冲液中， 配成蛋白浓度为35 g/ l， 如果是经过提 纯的透明质酸酶， 配成蛋白浓度为0.10.3 g/ l。 在操作中， 要防止过度酶解， 特别是经过 提纯的透明质酸酶， 其量应该要比粗毒蛋白减少到它的提纯倍数。 0062 对照溶液： 取100ul透明质酸溶液， 放入1.5mlEP管中， 加入30 l醋酸钠， 在37水 浴锅中反应1小时， 加入200ulCTAB液体后， 到37水浴锅静置10min。 0063 样品溶液： 取100ul透明质酸溶液， 放入1.5mlEP管中， 加入透明质酸酶溶液， 如透 明质酸酶溶液为蛇毒粗毒液， 添加量为30 l， 如透明质酸酶溶液为提纯。
28、的酶液则添加5 l并 用25 l醋酸钠缓冲液补齐至30 l， 然后在37水浴锅中反应1小时， 加入200ulCTAB液体 后， 到37水浴锅静置10min。 0064 分别取200 l样品溶液和对照溶液至96孔板， 采用酶标仪在波长400nm下测OD值。 根据所获得的样品溶液和对照溶液的光密度值采用下式计算获得透明质酸酶的活力及比 活力， 结果参见表3-5。 0065活力(unit)公式和比活力公式：A对照为对照溶液的光密度值 (OD值)， A酶为样品溶液的光密度值(OD值)。 0066浓度为样品溶液的浓度， 加样量为样 品溶液的加样量。 0067 表3： 舟山眼镜蛇透明质酸酶活性(粗毒蛋白)。
29、 0068 说明书 5/6 页 7 CN 105524977 A 7 0069 *粗毒蛋白浓度 0070 表4： 舟山眼镜蛇透明质酸酶活性(初步分离蛋白) 0071 0072 *经过SephadexG-50分离的蛋白浓度 0073 表5： 舟山眼镜蛇透明质酸酶活性(提纯蛋白) 0074 0075 *经过CMSepharoseFF分离的蛋白浓度 0076 本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。 凡是依据 本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、 等同变化与修饰， 均属于本发明技 术方案的范围内。 如本发明中可以根据酶的最适pH值， 在3pH 7范围内调整溶液的pH值， 溶液离子强度在0-0.5M的范围内调整， 均可实现本发明目的。 说明书 6/6 页 8 CN 105524977 A 8 图1 图2 说明书附图 1/5 页 9 CN 105524977 A 9 图3-A 图3-B 说明书附图 2/5 页 10 CN 105524977 A 10 图3-C 图3-D 说明书附图 3/5 页 11 CN 105524977 A 11 图3-E 图3-F 说明书附图 4/5 页 12 CN 105524977 A 12 图4 说明书附图 5/5 页 13 CN 105524977 A 13 。