技术领域
本发明属于生物催化、食品生物技术领域，涉及一种酶催化抗坏血酸酯合 成的方法。
背景技术
抗坏血酸是一种天然抗氧化剂，在食品、化妆品等领域有广泛的应用。但 由于其强亲水性的特点，极大地限制了该化合物在脂溶性材料如油脂或脂溶性 化妆品中的应用。因此，人们借助化学修饰的手段将长链脂肪酸引入抗坏血酸 以增强其脂溶性。目前，抗坏血酸棕榈酸酯和硬脂酸酯已被欧盟批准用作食品 或化妆品添加剂，以提高产品的抗氧化性。但是，工业上主要通过酸或碱催化 的化学方法合成抗坏血酸酯。由于化学催化剂区域选择性差，副产物多，产率 较低，并且需要通过复杂的下游分离纯化步骤才能制备得到目标产物。同时， 酸、碱催化剂的大量使用导致严重的环境污染问题。此外，由于化学反应条件 通常较激烈如在高温下进行，易使抗坏血酸发生降解及氧化反应，从而严重影 响产品品质。
近年来，由于酶法具有反应条件温和、区域选择性高、环境友好、后续产 物纯化相对简单等优点，故在抗坏血酸酯合成中越来越受到人们的关注。但是， 由于抗坏血酸亲水性强，在酶友好的疏水性溶剂如正己烷中溶解度极低，故酶 催化抗坏血酸酯合成反应通常以极性较强的有机溶剂如丙酮、叔丁醇及叔戊醇 为反应介质。一方面，酶在这些极性较强的溶剂中通常活性较低，反应速度慢， 并且稳定性欠佳；另一方面，叔丁醇和叔戊醇均来源于石化资源，不可再生。 尽管丙酮是食品安全级、且可再生溶剂，但是抗坏血酸在丙酮中的溶解度仍偏 低（50℃时溶解度仅为16mmol/L），并且丙酮沸点低（56℃），在常用的反 应温度下易挥发，不仅导致溶剂回收率低，而且大规模应用时易导致严重的大 气污染问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提出一种在含2-甲基四氢 呋喃混合溶剂中酶催化抗坏血酸酯合成的方法。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种酶催化抗坏血酸酯合成的方法，具体步骤如下：将抗坏血酸、酰基供 体和分子筛加入含2-甲基四氢呋喃的混合溶剂中混合均匀后，再加入脂肪 酶，进行酯化或转酯化反应，反应温度为40～60℃、振荡速度为150～300rpm， 反应后经分离得到抗坏血酸酯。
所述含2-甲基四氢呋喃的混合溶剂为2-甲基四氢呋喃与叔丁醇、叔戊醇 中的一种组成的混合溶剂。
所述2-甲基四氢呋喃的体积含量为10%～90%。
所述抗坏血酸与酰基供体的摩尔比为1:1～1:15，所述脂肪酶与抗坏血酸 的重量比为10:1～1:10。
所述酰基供体为羧酸、羧酸甲酯、羧酸乙酯、羧酸烯醇酯或酸酐。
所述羧酸、羧酸甲酯、羧酸乙酯或羧酸烯醇酯中的羧酸为1个苯环的芳香 酸或为碳链长度为C2～C22，并含有0～4个双键的脂肪酸；酸酐的脂肪酸碳 链长度为C2～C18。
所述分子筛用量为0.01～0.20g/mL。
所述脂肪酶为来源于南极假丝酵母（Candida antarctica）、嗜热丝孢菌 （Thermomyces lanuginosus）、根霉（Rhizomucor miehei）、洋葱假单胞菌 （Pseudomonas cepacia）、皱落假丝酵母（Candida rugosa）、荧光假单胞菌 （Pseudomonas fluorescens）或扩展青霉（Penicillium expansum）的脂肪酶。
分离抗坏血酸酯的方法为反应后的混合物经过滤除酶和分子筛，真空下除 去溶剂，残渣经柱层析分离得到抗坏血酸酯。
与现有的技术相比，本发明具有如下的优点：
1)采用高效的生物催化剂——酶催化抗坏血酸酯的合成。酶反应具有高区域 选择性，因此克服了传统化学方法选择性低、易生成副产物及产率低等缺 点。同时，酶是易生物降解的生物大分子，克服了化学催化剂环境不友好 的缺点。
2)本发明无需基团保护和脱保护操作，反应过程简单易控，产物易分离；
3)本发明是在温度为40～60℃、振荡速度为150～300rpm、常压条件下进 行，反应条件温和、不易使抗坏血酸发生降解和氧化反应，故产品品质高。
4)本发明利用疏水性的2-甲基四氢呋喃与亲水性的叔丁醇或叔戊醇的混合 液作为溶剂，与已报道的抗坏血酸酶法工艺如在纯叔丁醇或叔戊醇体系中 的酶反应相比，不仅极大地提高了酶反应速度和酶催化效率，并且显著提 高了酶的稳定性。同时，由于部分叔丁醇和叔戊醇被可再生的2-甲基四氢 呋喃代替，极大提高了工艺的生态友好性。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，但是 本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。
实施例1
将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、棕榈酸乙烯酯（1.71mmol）、0.1g分子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔丁醇（4:1,v/v）加入具塞三角瓶中， 然后加入16mg来源于Candida antarctica B的固定化脂肪酶（购于诺维信公 司），常压下置于50℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。 反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-棕榈酸 酯212mg，收率为90%。
实施例2
将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、油酸甲酯（3.99mmol）、0.2g分 子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔丁醇（4:1,v/v）加入具塞三角瓶中，然 后加入100mg来源于Thermomyces lanuginosus的固定化脂肪酶（购于诺维信 公司），常压下置于50℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。 反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-油酸酯 201mg，收率为80%。
实施例3
将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、十一碳烯酸乙烯酯（1.71mmol）、0.3g 分子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔丁醇（4:1,v/v）加入具塞三角瓶 中，然后加入16mg来源于Candida antarctica B的固定化脂肪酶（购于诺维 信公司），常压下置于50℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反 应。反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-十 一碳烯酸酯179mg，收率为92%。
实施例4
将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、十一碳烯酸乙烯酯（2.85mmol）、0.3g 分子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔丁醇（4:1,v/v）加入具塞三角瓶 中，然后加入480mg来源于Penicillium expansum的固定化脂肪酶（购于绿微 康生物工程有限公司，酶固定化参照Bioresource Technology,2010,101:1所述 方法），常压下置于50℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。 反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-十一碳 烯酸酯172mg，收率为88%。
实施例5
将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、十一碳烯酸乙烯酯（1.71mmol）、0.5g 分子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔丁醇（4:1,v/v）加入具塞三角瓶 中，然后加入16mg来源于Candida antarctica B的固定化脂肪酶（购于诺维 信公司），常压下置于60℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反 应。反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-十 一碳烯酸酯175mg，收率为90%。
实施例6
将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、亚油酸（5.7mmol）、0.8g分子筛、 10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔丁醇（4:1,v/v）加入具塞三角瓶中，然后加入 200mg来源于Candida antarctica B的固定化脂肪酶（购于诺维信公司），常压 下置于60℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应结束 后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-亚油酸酯202mg， 收率为81%。
实施例7
将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、十一碳烯酸乙烯酯（2.85mmol）、0.2g 分子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔丁醇（2:3,v/v）加入具塞三角瓶 中，然后加入16mg来源于Candida antarctica B的固定化脂肪酶（购于诺维 信公司），常压下置于50℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反 应。反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-十 一碳烯酸酯168mg，收率为86%。
实施例8
将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、十一碳烯酸乙烯酯（2.85mmol）、0.5g 分子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔戊醇（3:7,v/v）加入具塞三角瓶 中，然后加入50mg来源于Candida antarctica B的固定化脂肪酶（购于诺维 信公司），常压下置于40℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反 应。反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-十 一碳烯酸酯175mg，收率为90%。
实施例9
将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、硬脂酸乙烯酯（2.85mmol）、0.5g分子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔戊醇（4:1,v/v）加入具塞三角瓶中， 然后加入80mg来源于Pseudomonas cepacia的固定化脂肪酶（购于天野酶制 品公司），常压下置于50℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反 应。反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-硬 脂酸酯224mg，收率为89%。
实施例10
将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、乙酸酐（1.14mmol）、0.5g分子 筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔戊醇（4:1,v/v）加入具塞三角瓶中，然后 加入80mg来源于Pseudomonas cepacia的固定化脂肪酶（购于天野酶制品公 司），常压下置于50℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。 反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-乙酸酯 114mg，收率为92%。
实施例11
将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、苯甲酸乙烯酯（1.71mmol）、0.6g分子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔丁醇（2:3,v/v）加入具塞三角瓶中， 然后加入90mg来源于Candida antarctica B的固定化脂肪酶（购于诺维信公 司），常压下置于50℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。 反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-苯甲酸 酯124mg，收率为78%。