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1、(10)授权公告号 CN 101585875 B (45)授权公告日 2011.11.02 CN 101585875 B *CN101585875B* (21)申请号 200910031725.6 (22)申请日 2009.06.20 C07K 14/765(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/113(2006.01) (73)专利权人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号江南大学食品学院 (72)发明人 胥传来 林菲 宋珊珊 (74)专利代理机构 无锡市大为专利商标事务所 32104 代理人 时旭丹 刘品超 WO 03009869。
2、 A1,2003.12.04,说明书和权利 要求书全文 . CN 101402683 A,2009.04.08,说明书和权利 要求书全文 . 任立松 . 苏丹红 I 与柠檬黄单链融合抗 体的制备及快速免疫学检测方法研究 .中国 博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑 （月 刊） .2008,( 第 11 期 ), 论文全文 . 周思祥等 . 农药人工抗原的合成研究进 展 . 农药 .2005, 第 44 卷 ( 第 8 期 ), 第 337 页 至 341 页 . 肖理文等 . 四环素人工抗原的合成与鉴 定 . 细胞与分子免疫学杂志 .2008, 第 24 卷 ( 第 4 期 ), 第 419 。
3、页至第 421 页 . (54) 发明名称 一种柠檬黄完全抗原的合成方法 (57) 摘要 一种柠檬黄完全抗原的合成方法， 属于生物 化工技术领域。 本发明以柠檬黄为半抗原， 用混合 酸酐法将其与载体蛋白 BSA 偶联， 用分光光度法 测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了柠檬黄 的人工抗原， 合成步骤简洁， 有效， 完全可用于免 疫分析中， 为以后人们的研究提供了必需的人工 抗原， 可以满足国内对柠檬黄研究的需要。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 管冰 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 CN 1015858。
4、75 B1/1 页 2 1. 一种柠檬黄完全抗原的合成方法， 其特征是以柠檬黄为半抗原， 用混合酸酐法将其 与载体蛋白 BSA 偶联， 用分光光度法测定偶联物的偶联比 ； 步骤为 ： (1) 柠檬黄完全抗原的合成 ： 配制 A 液 ： 取 53.4mg 柠檬黄溶于 2mL DMSO 中， 冰浴 10min， 加入 51L 三正丁胺， 冰浴 10min， 加入 87L 氯甲酸异丁酯， 4下， 搅拌孵育 1h， 为 A 液， 4保存备用 ； 配制 B 液 ： 130mg 牛血清蛋白 BSA 溶于 2mL 0.01mol/L pH7.4 PBS 缓冲液， 为 B 液， 4 保存备用 ； 冰浴条件下把。
5、 A 液逐滴滴加入 B 液中， 边加边摇， 于 4下孵育 4h， 即得柠檬黄完全抗 原混合液 ； 透析袋前处理 ： 取 10cm 的透析袋， 于沸水中煮沸 5min， 再用 60的去离子水冲洗 3min， 保存在 4去离子水中备用 ； 透析 ： 将柠檬黄完全抗原混合液移入透析袋中， 用22L的0.01mol/L的pH7.4的磷酸 盐缓冲溶液和22L的去离子水透析3天， 最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末， 即 得到柠檬黄完全抗原 ； (2) 柠檬黄完全抗原的鉴定 ： 柠檬黄完全抗原采用分光光度法鉴定其偶联结果， 利用 牛血清蛋白标准液得到标准曲线， 从曲线上比对得到抗原溶液的蛋白浓度， 计。
6、算摩尔吸光 系数 ， 再测定柠檬黄完全抗原的偶联比。 权 利 要 求 书 CN 101585875 B1/3 页 3 一种柠檬黄完全抗原的合成方法 技术领域 0001 一种柠檬黄的通用人工抗原的合成方法， 属于生物化工技术领域。 背景技术 0002 柠檬黄色素 (Tar) 是目前我国批准使用的六种食用合成色素之一， 其分子结构为 偶氮化合物， 在体内代谢的产物为对人体具有潜在危害的 - 芳香类化合物。因此， 我国对在 食品中的柠檬黄色素有严格限制。凡是肉类及其加工品， 鱼类及其加工品等都不能使用人 工合成色素， 即使在适用的品种和范围内， 使用剂量也有严格规定， 决不允许过量使用。但 实际上，。
7、 我国食品中普遍存在柠檬黄色素的超标、 超范围使用现象屡禁不止。 如果人们长期 或一次性大量食用柠檬黄含量超标的食品， 可能会引起过敏、 腹泻等症状， 当摄入量过大， 超过肝脏负荷时会在体内蓄积， 对肾脏、 肝脏产生一定伤害。目前， 检测柠檬黄含量采取的 方法是薄层分析及分光光度法， 近年来， 我国科研工作者在柠檬黄检测方面做了大量的工 作， 但都主要集中在理化检测方面， 这些方法不仅需要昂贵的仪器设备， 专业的操作人员， 对检材的要求也比较高， 并且需要进一步的样本前处理才能进行， 这已经不能达到现代检 测对快速、 方便、 准确的要求。 近年来， 国内外已经开展了对色素类免疫分析方法的研究，。
8、 但 国内外尚没有针对柠檬黄的酶联免疫检测的报道， 为了弥补这一空白， 有必要制备柠檬黄 完全抗原。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种柠檬黄完全抗原的合成方法。 所制备的产品用于柠檬黄 的免疫分析方法研究。为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。 0004 本发明的技术方案 ： 一种柠檬黄完全抗原的合成方法， 以柠檬黄为半抗原， 用混合 酸酐法将其与载体蛋白 BSA 偶联， 用分光光度法测定偶联物的偶联比 ； 步骤为 ： 0005 (1) 柠檬黄完全抗原的合成 ： 0006 配制 A 液 ： 取 53.4mg(0.1mmol) 柠檬黄溶于 2mL 二甲亚砜 (DMSO) 中， 冰浴 1。
9、0min， 加入 51L 三正丁胺， 冰浴 10min， 加入 87L 氯甲酸异丁酯， 4下， 搅拌孵育 1h， 为 A 液， 4保存备用 ； 0007 配制 B 液 ： 130mg(0.002mmol) 牛血清蛋白 BSA 溶于 2mL 0.01mol/L pH7.4PBS 缓 冲液， 为 B 液， 4保存备用 ； 0008 冰浴条件下把 A 液逐滴滴加入 B 液中， 边加边摇， 于 4下孵育 4h， 即得柠檬黄完 全抗原混合液 ； 0009 透析袋前处理 ： 取 10cm 的透析袋， 于沸水中煮沸 5min， 再用 60的去离子水冲洗 3min， 保存在 4去离子水中备用。 0010 透析。
10、 ： 将柠檬黄完全抗原混合液移入透析袋中， 用 22L 的 0.01mol/L 的 pH 7.4 的磷酸盐缓冲溶液和 22L 的去离子水透析 3 天， 最后使用冻干法将透析袋中的液体制成 粉末， 即得到柠檬黄完全抗原 ； 说 明 书 CN 101585875 B2/3 页 4 0011 (2) 柠檬黄完全抗原的鉴定 ： 柠檬黄完全抗原采用分光光度法鉴定其偶联结果， 利用牛血清蛋白标准液得到标准曲线， 从曲线上比对得到抗原溶液的蛋白浓度， 计算摩尔 吸光系数 ， 再测定柠檬黄完全抗原的偶联比。 0012 偶联比测定 ： 是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法， 虽然 测定方法种类。
11、很多， 但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量 ( 或相对含量 ) 的原 理建立起来的。 分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被 偶联的两种分子浓度 . 在大分子与小分子偶联物中， 两种分子均有各自不同的紫外扫描光 谱， 并表现出光谱图迭加的性质。 0013 摩尔吸光系数 ： 配制柠檬黄浓度为 0， 10， 20， 30gmL-1的 0.01M 的 PBS 溶液， 通过紫外扫描可知柠檬黄的最大吸收波长为 427nm， 在 427nm 处测吸光值， 每个浓度做平行 样 . 摩尔吸光系数计算为 ： 吸光值 / 摩尔浓度。 0014 偶联物蛋白浓度测定 ： 配制浓度为0。
12、， 10， 20， 40， 60， 80， 100g mL-1的牛血清蛋白 溶液 1.5mL， 加入 5mL 考马斯亮蓝染色液， 立即混匀， 30水浴温热 5 分钟， 每个浓度做平行 样 . 在 595nm 处测吸光值， 绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀 释， 在 595nm 处测定抗原溶液的吸光值， 从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。 0015 偶联比测定 ： 配制 150gmL-1牛血清蛋白的 20乙醇溶液， 将偶联产物人工抗 原用 20乙醇稀释到 150gmL-1， 在 427nm 处测吸光值， 以 20乙醇为空白， 测出牛血 清蛋白溶液的吸光值为 A1， 偶联。
13、产物的吸光值为 A2， 则偶联比率 r 为 ： (A1-A2)/ (15010-3/66200)。 0016 其中 为摩尔吸光系数 (Lmol-1)， 66200 为牛血清蛋白的分子量， 15010-3为 牛血清蛋白浓度 (gmL-1)。 0017 本发明的有益效果 ： 本发明合成了柠檬黄完全抗原， 合成步骤简洁， 有效， 完全可 用于免疫分析中， 为以后人们的研究提供了方便的途径， 可以满足国内对其研究的需要。 附图说明 0018 图 1 柠檬黄完全抗原制备前后的紫外扫描图。 0019 具体实施方法 0020 实施例 1 0021 (1) 柠檬黄完全抗原的制备 0022 配制 A 液 ： 取。
14、柠檬黄 53.4mg(0.1mmol) 溶于 2mL DMSO 中， 冰浴 10min， 加入 51L 三正丁胺， 冰浴 10min， 加入 87L 的氯甲酸异丁酯， 4下， 搅拌孵育 1h， 为 A 液。 0023 配制 B 液 ： 130mg(0.002mmol) 牛血清蛋白 BSA 溶于 2mL 0.01mol/L PBS 缓冲液， 为 B 液。把 A 液逐滴滴加入 B 液中， 边加边摇， 于 4下孵育 4h， 即得柠檬黄完全抗原混合 液。 0024 透析袋前处理 ： 取 10cm 的透析袋， 于沸水中煮沸 5min， 再用 60的去离子水冲洗 3min， 保存在 4去离子水中备用。 0。
15、025 透析 ： 将柠檬黄完全抗原混合液移入透析袋中， 用 22L 的 0.01M 的 PBS 溶液和 22L的去离子水透析3天。 最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末， 即得到柠檬黄完 全抗原。 说 明 书 CN 101585875 B3/3 页 5 0026 (2) 柠檬黄完全抗原的鉴定 0027 摩尔吸光系数 ： 配制柠檬黄浓度为 0， 10， 20， 30gmL-1的 0.01M 的 PBS 溶液， 通过紫外扫描可知柠檬黄的最大吸收波长为 427nm， 在 427nm 处测吸光值， 每个浓度做平行 样.摩尔吸光系数计算为 ： 吸光值/摩尔浓度。 本实验计算得25649.76L mol。
16、-1。 0028 偶联物蛋白浓度测定 ： 配制浓度为0， 10， 20， 40， 60， 80， 100g mL-1的牛血清蛋白 溶液 1.5mL， 加入 5mL 考马斯亮蓝染色液， 立即混匀， 30水浴温热 5 分钟， 每个浓度做平行 样 . 在 595nm 处测吸光值， 绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀 释， 在 595nm 处测定抗原溶液的吸光值， 从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验 计算得抗原溶液的蛋白浓度为 3.35mgmL-1。 0029 偶联比测定 ： 配制 150gmL-1牛血清蛋白的 20乙醇溶液， 将偶联产物用 20乙醇稀释到 150gmL-1， 在 427nm 处测吸光值， 以 20乙醇为空白， 测出牛血清蛋 白溶液的吸光值为 A1， 偶联产物的吸光值为 A2， 则偶联比率 r 为 ： (A1-A2)/ (15010-3/66200)， 本实验计算得 r 18。 0030 其中 为摩尔吸光系数 (Lmol-1)， 66200 为牛血清蛋白的分子量， 15010-3为 牛血清蛋白浓度 (gmL-1)。 说 明 书 CN 101585875 B1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 。