技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及分子生物学、免疫学及免疫应用等相关领 域。本发明涉及腺病毒重组转移载体的改建及其对肾综合征出血热(HFRS)致 病原的一种用于促进汉坦病毒融合蛋白G1S0.7有效提呈的重组腺病毒高表达载 体。
背景技术
肾综合征出血热及其基因工程疫苗研究现状：
肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)是由汉坦 病毒(Hantavirus，HV)引起，由鼠类等传播的一种急性病毒性传染病，临床上 以发热、出血和急性肾功能损害为主要特征。中国是世界上HFRS疫情最严重 的国家，具有流行范围广、发病人数多、病死率高等特点，到目前为止临床上 尚缺乏特异有效的治疗药物。
为易感人群接种疫苗是预防传染性疾病大规模扩散最有效的防控措施。因 此，针对HFRS疫苗的研究一直是该领域的热点。国内外近年来虽已研制出HFRS 的灭活疫苗，但从部分人群试用的情况来看，该类疫苗还存在明显不足，主要 是其诱导机体产生中和抗体的能力较弱，也不能有效地刺激细胞免疫应答。目 前在HFRS基因工程疫苗基础研究中主要使用的是病毒囊膜糖蛋白 (Glycoprotein，GP)，但GP免疫原性相对较弱，刺激机体产生的抗体出现较晚， 滴度亦不高。本发明人多年对HV中免疫原性最强的核蛋白(Nucleocapsid Protein，NP)的结构及功能，NP与GP不同片段嵌合基因(G1S0.7、G2S0.7) 的构建及其表达，以及不同融合基因(蛋白)刺激机体免疫应答的能力及其影 响因素等进行了较为深入的研究。一系列体内、外实验结果表明，上述嵌合基 因在腺病毒表达系统中能有效地刺激机体的体液免疫(包括中和抗体)应答以 及细胞免疫应答，且其效果均高于非嵌合组。
然而在研究中我们也发现了一些问题，如尽管利用各种系统均能表达出完 整的融合蛋白，但总的来说蛋白表达量还是偏低。此外，用融合蛋白免疫动物 后虽然各表达系统均能刺激机体产生体液及细胞免疫应答，且腺病毒表达系统 的效果要优于其他系统，但是整体的免疫水平还不十分理想。因此，进一步选 择合适的表达载体、优化表达系统对目前HFRS基因工程疫苗的研究有着重要 的意义。
本申请人前期对含嵌合基因G1S0.7的重组腺病毒转移载体G1S0.7-pShuttle 进行改建，将其CMV启动子替换为CAG启动子/增强子，得到含CAG启动子/ 增强子的汉坦病毒融合蛋白G1S0.7的重组腺病毒转移载体，命名为 G1S0.7-pCAG，整合入腺病毒载体DNA中，得到重组腺病毒rAd-G1S0.7-pCAG。 通过与未替换启动子的重组腺病毒rAd-G1S0.7比较融合蛋白G1S0.7的表达水 平，结果显示该重组腺病毒能有效提高G1S0.7的表达。
在此基础上，本发明将Ub基因连接到该转移载体上，利用基因重组技术将 重组片段整合入腺病毒载体DNA中，得到能够促进汉坦病毒融合蛋白G1S0.7 有效提呈的重组腺病毒高表达载体。
优化腺病毒表达载体，促进机体对抗原的提呈：
促进疫苗组份在体内的有效提呈是提高HFRS基因工程疫苗的效率的途径 之一，而Ub在抗原提呈方面具有突出的优势。泛素-蛋白酶复合体通路是细胞 内源性蛋白降解的主要途径，同时也是内源性抗原加工、处理和呈递的主要途 径。泛素Ub是一种由76个氨基酸组成的蛋白质分子，其C端为甘氨酸(Glycine， Gly)。当要降解的底物蛋白被识别后，泛素末位Gly与靶蛋白上的赖氨酸(Lysine， Lys)残基共价结合，其它泛素分子的Gly再顺次结合到前一分子的第46位Lys 上，形成多聚泛素-底物蛋白复合物，该复合物最终被蛋白酶体降解。有研究发 现Ub与质粒编码的病毒抗原共同转录、翻译，可提高该抗原的细胞内降解，使 更多肽段进入MHC-I类抗原提呈途径，增加进入MHC-I途径的表位肽，从而诱 导强烈的MHC-I限制的CTL和Thl类细胞应答的细胞免疫反应。此外，研究还 发现将末位的Gly改为Ala后，可以防止融合蛋白降解为抗原和Ub单体，这种 泛素化的抗原能被快速地降解，提高了它被MHC-I类分子识别呈递的机率，从 而大大提高了CTL活性和对小鼠的保护效率。
发明内容
本发明的目的是：提供一种用于促进汉坦病毒融合蛋白G1S0.7有效提呈的 重组腺病毒高表达载体，它能够有效的提高机体的部分体液免疫应答水平和细 胞免疫应答水平。
本发明的技术方案是：设计用于促进汉坦病毒融合蛋白G1S0.7有效提呈的 重组腺病毒高表达载体，其制备方法是对含嵌合基因G1S0.7的重组腺病毒转移 载体G1S0.7-pCAG进行改建，将泛素抗原递呈分子基因连接到该载体上，其全 基因序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明目的是通过以下方式实现的：将本申请人前期构建的含汉坦病毒 76-118株的G1S0.7嵌合基因及CAG启动子/增强子的重组腺病毒转移载体 G1S0.7-pCAG进行改建，将Ub抗原递呈分子基因连接到该载体上，并整合入腺 病毒载体DNA中，以获得一种用于促进汉坦病毒融合蛋白G1S0.7有效提呈的 重组腺病毒高表达载体。
对含嵌合基因G1S0.7的重组腺病毒转移载体pCAG-G1S0.7进行改建，将 Ub基因连接到该载体上，得到改建的重组腺病毒转移载体，命名为 Ub-G1S0.7-pCAG，其全基因序列为SEQ ID NO：1所示。对重组转移载体和腺 病毒载体双酶切，将重组片段Ub-G1S0.7-pCAG整合入腺病毒载体DNA中， 得到了重组腺病毒载体rAd-Ub-G1S0.7-pCAG。
本发明利用基因重组技术，将本申请人前期构建的含汉坦病毒76-118株的 G1S0.7的嵌合基因及CAG启动子/增强子重组腺病毒转移载体pCAG-G1S0.7进 行改建，并将重组片段整合入腺病毒载体DNA中，以期获得一种用于促进汉坦 病毒融合蛋白G1S0.7有效提呈的重组腺病毒高表达载体。将本发明 rAd-Ub-G1S0.7-pCAG及前期未整合Ub基因的重组腺病毒rAd-G1S0.7-pCAG和 未替换CAG启动子的重组腺病毒rAd-G1S0.7分别免疫实验小鼠，并进行免疫 学特性的研究，结果发现本发明rAd-Ub-G1S0.7-pCAG能够有效的提高机体的部 分体液免疫应答水平和细胞免疫应答水平。
附图说明
下面结合实施例附图对本发明做进下说明：
图1.Ub基因的PCR扩增结果。其中：L：Ub；M：DL2000DNA maker；
图2.Ub-S0.7-pCAG Nhe I和Sfi I双酶切鉴定结果。其中：L：Ub-S0.7- pCAG；M1：DNA wide range maker；M2：DL2000DNA maker；
图3.重组腺病毒DNA的PCR鉴定。其中：L1：Ub-G1S0.7-pCAG；M： 200bp maker；
图4.重组腺病毒的PCR鉴定。其中：L1：Ub-G1S0.7-pCAG；M：200bp maker；
图5.HEK293细胞的CPE现象。其中A：正常对照；B：转染6天后；
图6.Ub-G1S0.7-pCAG表达产物的免疫荧光检测结果。其中A：检测NP的 表达；B：检测Ub的表达；C：HEK 293阴性对照；
图7.各组免疫小鼠细胞因子IFN-γ的检测结果；
图8.各组免疫小鼠细胞因子IL-2的检测结果；
图9.含G1S0.7嵌合基因的重组腺病毒免疫小鼠CTL检测结果。
具体实施方式
本发明所用的腺病毒表达系统购自CLONTECH公司的Adeno-XTM系统(货 号K1650-1)，其转移载体为pShuttle。
本发明中所采用的重组腺病毒转移载体G1S0.7-pCAG由本申请人前期构 建。(见专利申请号200910254561.3)
本发明中所采用的重组腺病毒rAd-G1S0.7-pCAG、rAd-G1S0.7由本申请人 前期包装、纯化。
本发明中所采用的双价HFRS灭活疫苗购自浙江天元公司。
本发明中所插入Ub基因序列是以Ub up primer、Ub down primer上下游引 物，以pCMV-F3Ub为模板，以55℃为退火温度进行PCR扩增，如附图1所 示。PCR产物与T-easy载体14℃连接过夜，连接产物电转化E.coli JM109后涂 布含Amp+抗性的琼脂平板，37℃培养12hr，挑选单菌落增菌，提质粒后以Ub up primer、Ub down primer为引物进行PCR鉴定，阳性克隆命名为T easy-Ub，送 金斯瑞生物科技公司进行测序。
本发明中重组腺病毒载体构建方法及重组腺病毒免疫学特性的研究内容具 体如下：
1.重组转移载体Ub-G1S0.7-pCAG的构建：采用Sfi I及Nhe I双酶切 S0.7-pCAG-pShuttle和T easy-Ub质粒，采用Takara胶回收试剂盒回收目的片段 和载体。片段和载体通过T4连接酶14℃连接过夜，连接产物电转化E.coli JM109，涂布含Kana+抗性的2×YT琼脂平板后置于37℃培养12hr。挑选单菌 落增菌，提质粒后酶切鉴定，获得阳性克隆，命名为Ub-S0.7-pCAG。采用Nhe I、 Not I双酶切Ub-S0.7-pCAG，获得Ub-pCAG骨架。采用Xba I、Not I双酶切 G1S0.7，获得G1S0.7片段。片段和载体14℃连接过夜，转化E.coli JM109。挑 取单菌落并扩大培养后提取质粒，经过PCR扩增后进对产物行进行琼脂糖凝胶 电泳分析。获得的阳性克隆命名为Ub-G1S0.7-pCAG(Ub基因位于G1S0.7嵌合 基因的上游)。附图2.为Ub-S0.7-pCAG-pShuttle阳性克隆Nhe I和Sfi I双酶切 鉴定结果。
2.重组腺病毒载体rAd-Ub-G1S0.7-pCAG的构建、鉴定、包装及单斑纯化： 将上述构建成功的重组转移载体和腺病毒质粒分别用PI-Sce I和I-Ceu I双酶 切，胶回收目的片段和载体，T4连接酶14℃连接过夜，连接产物转化(JM109 感受态)后涂布含Amp+的2×YT固体培养基，37℃孵箱培养12～14hr，挑选单菌 落摇菌提质粒后酶切鉴定，获得阳性克隆。附图3.为rAd-Ub-G1S0.7-pCAG重组 腺病毒载体的PCR鉴定结果。将重组腺病毒载体DNA用Pac I酶单切以线性化质 粒，转染HEK293细胞，待出现明显CPE(Cytopathic Effect，细胞病变)后收细 胞，如附图5所示。离心后将沉淀重悬于高压灭菌的PBS，反复冻融该沉淀3次后 离心收集上清，即获得重组腺病毒。附图4为rAd-Ub-G1S0.7-pCAG的PCR鉴定结 果。采用空斑法纯化重组腺病毒，-80℃保存。
3.rAd-Ub-G1S0.7-pCAG融合蛋白G1S0.7表达的检测结果：测定重组腺病毒 滴度(具体方法参见CLONTECH Adeno-XTM Rapid Titer Kit，Cat.No.631028)。 以100pfu/cell的MOI(multiplicity of infection，感染复数)感染293细胞，同时感 染本申请人前期包装的rAd-G1S0.7重组腺病毒作为对照，48hr后免疫荧光检测目 的蛋白的表达。
3.1NP表达的检测
感染前24hr以1×105细胞/孔的密度将HEK293细胞铺于24孔板，第二天 以100pfu/cell的MOI感染HEK293细胞，4hr后更换为新鲜的10％S-DMEM 培养液，每孔500μL。将细胞置于CO2孵箱中培养48hr，使细胞密度达到75％， 之后用冷甲醇-20℃固定细胞20min，PBS轻柔冲洗3次。加入1∶1000稀释的 mAb-1A8(由本申请人制备并保存，可识别汉坦病毒特异抗原位点，具有较高 的结合活性)，37℃孵育2hr，PBS轻柔洗3次，加入用0.2‰伊文氏兰液1∶100 稀释的FITC标记的羊抗鼠二抗，于37℃孵育1h，PBS轻柔洗3次。避光保存， 在荧光倒置显微镜下观察结果。
3.2Ub表达的检测
于24孔板中培养细胞及感染病毒步骤如前，以1∶200稀释商品化特异性抗 抗Ub抗体，37℃孵育1hr，PBS轻柔冲洗3次后加入用0.2‰伊文氏兰液1∶100 稀释的FITC标记的羊抗兔二抗，于37℃孵育1hr，PBS轻柔洗3次，避光保存， 在荧光倒置显微镜下观察结果。附图6分别为rAd-Ub-G1S0.7-pCAG中融合蛋白 S0.7及Ub的免疫荧光检测结果。其中A为S0.7免疫荧光检测结果，B为Ub 免疫荧光检测结果，C为HEK293细胞阴性对照。
4.重组腺病毒免疫C57BL/6小鼠：将各组重组腺病毒经过增殖、纯化和滴 度测定后，以108pfu/0.5ml/只经腹腔注射入小鼠体内(4周龄C57BL/6小鼠雌鼠， 每组5只，购自本校动物实验中心)，间隔2周免疫一次，共三次；正常小鼠组 (4周龄C57BL/6小鼠雌鼠，每组5只，购自本校动物实验中心)腹腔注射生 理盐水0.5ml/只，Adenovirus组(4周龄C57BL/6小鼠雌鼠，每组5只，购自本 校动物实验中心；Adenovirus购自Clotech公司，含lacZ基因，通过检测β-半 乳糖苷酶的表达，可作为腺病毒阴性对照)腹腔注射腺病毒108pfu/ml/只，灭活 疫苗组腹腔注射疫苗10μl/只，间隔2周注射一次，共三次。
5.重组腺病毒免疫小鼠血清特异性抗体的检测结果：在第三次免疫后10天 对各组免疫小鼠摘眼球取血并分离血清。包被HTNV NP 10μg/ml，4℃过夜；将 各组免疫小鼠血清做1∶10～1∶640倍比稀释，疫苗对照组稀释至1∶640，37℃孵育 1hr；洗涤后各孔加入1∶20000稀释的HRP-抗鼠二抗，37℃孵育1hr；洗涤后加 入OPD底物液显色，室温下避光放置15min后加入终止液，测定各孔的A490值。 附表1为各组免疫小鼠血清特异性抗体检测结果。
6.重组腺病毒免疫小鼠血清中和抗体的检测结果：在第三次免疫后10天对 各组免疫小鼠摘眼球取血并分离血清。感染前一天接种Vero-E6细胞于96孔板， 使其长成单层。0.22μm滤器提前过滤各组免疫小鼠的血清，然后用高压过的 1×PBS做1∶5～1∶160倍比稀释，阳性对照mAb-3G1(可识别NP/G2上特异抗原 位点，具有较高中和活性和血凝抑制活性)从1∶1000开始做倍比稀释，阴性对 照Sp2/0腹水做1∶1000稀释。将100TCID50HTNV分别与各实验组血清及对照 样品充分混匀，37℃5％CO2孵育1hr。将96孔板各孔细胞上清吸尽，分别加入 各组病毒与血清(或腹水)混和液100μl/孔，做4个复孔，同时设立病毒对照组 和正常细胞对照组。37℃5％CO2孵育90min后，吸尽各孔上清，加入200μl/孔 含2％小牛血清的完全RPIM-1640培养液，37℃5％CO2孵育9天，每隔3天换 一次培养液。将96孔板放入-80℃反复冻融3次，用ELISA夹心法检测冻融液 中的病毒抗原，具体步骤如下：
1∶1000稀释mAb 1A8及腹水Sp2/0，4℃包被过夜
↓
加入100μl/孔细胞冻融上清，37℃孵育1hr
↓
加入1∶2000稀释的HRP-1A8抗体，37℃孵育1hr
↓
加入100μl/孔OPD底物液显色，静置15min
↓
加入50μl/孔2M H2SO4终止液
↓
测定各孔A490值
结果判定：P值为各免疫组A490值，N为阴性对照组A490值，以P/N值≥ 2.1者为阳性，能抑制50％细胞感染的血清最大稀释度为中和抗体效价。附表2 为各组免疫小鼠血清中和抗体效价检测结果。
7.重组腺病毒免疫小鼠分泌细胞因子的ELISPOT检测结果：
7.1免疫小鼠脾淋巴细胞制备
在第三次免疫后10天摘眼球处死各组小鼠，无菌分离脾脏获取脾细胞悬液。 加入Gey’s溶液裂解其中的红细胞，离心收集脾淋巴细胞，加入不完全 RPIM-1640洗涤2次，离心后重悬于含2％小牛血清完全RPIM-1640培养液中， 计数备用。
7.2ELISPOT检测免疫小鼠细胞因子IFN-γ、IL-2
处死小鼠前一天，包被IL-2检测板(IFN-γ为预包被检测板)，具体程序如 下：无菌条件下每孔加入50μl/孔70％乙醇，静置2min后弃尽，加入200μl/孔无 菌去离子水洗涤5次，100μl/孔加入特异性稀释抗体，4℃包被过夜。用无菌1×PBS 洗涤5次后，200μl/孔加入含10％-小牛血清的完全RPIM-1640培养液室温封闭 30min，用无菌1×PBS洗涤5次后，包被完成备用。上述各组实验小鼠脾细胞稀 释成1×107细胞/ml浓度，100μl/孔加入个细胞因子检测板，并加入10mg/ml HTNV NP作为刺激物，每个样品作3个复孔。阳性对照孔中加入PHA (phytohemagglutinin，植物血凝素)，终浓度为4μg/ml，阴性对照孔不加刺激物， 背景对照孔只加培养基。37℃5％CO2孵育18hr，无菌1×PBS洗涤5次后加入生 物素化抗鼠细胞因子的mAb，室温孵育2hr，无菌1×PBS洗涤5次后加入1∶1000 稀释的HR标记链霉亲和素，室温孵育1hr，高压1×PBS洗涤5次后加入TMB 底物显色液，避光静置，待斑点出现后，自来水冲洗，避光阴干，用ELISPOT 读数仪测定斑点数。附图7为各重组腺病毒细胞因子IFN-γ的检测结果(*P＜0.05， **P＜0.01)。附图8为重组腺病毒细胞因子IL-2的检测结果(*P＜0.05，**P＜0.01)。
8.重组腺病毒免疫小鼠CTL细胞杀伤实验检测结果：
8.1效应细胞的制备
在第3次免疫后10天摘眼球处死各组小鼠，无菌分离脾脏获取脾细胞悬液 (同上)，将其置于含5％小牛血清完全RIPM-1640培养液中，加入终浓度为 10μg/ml的HTNV GP，25U/ml的IL-2，37℃5％CO2，作为CTL细胞杀伤实验 效应细胞。
8.2靶细胞的制备
提前两天用重组腺病毒rAd-G1S0.7感染B16细胞作为CTL细胞杀伤实验 靶细胞。
8.3CTL细胞杀伤实验
计数效应细胞和靶细胞，按照20∶1、50∶1、100∶1的效靶比将50μl(2×106/ 孔、1×106/孔、4×105/孔)效应细胞和50μl(2×104/孔)靶细胞加入96孔板中， 设置3个复孔，并以正常鼠脾细胞作为阴性对照。布板设各项对照孔(附表3 显示各对照孔配制方案)，之后按如下步骤检测：37℃5％CO2孵育细胞4h后， 250×g室温离心5min，离心前40min靶细胞最大释放孔加入10μl/孔裂解液，离 心后每孔吸出50μl细胞上清至新96孔板，加入50μl/孔底物液，室温避光静置 30min，加入50μl/孔终止液，测定A490值，计算杀伤活性。附图9为重组腺病 毒免疫小鼠CTL检测结果，在效靶比为50∶1时，rAd-Ub-G1S0.7-pCAG组小鼠 脾细胞的杀伤活性要高于其他试验组及对照组(P＜0.05)。
表1.各组免疫小鼠血清特异性抗体检测结果
表2.各组免疫小鼠血清中和抗体效价检测结果
表3.CTL杀伤试验各对照孔配制方案
序列表
<110>中国人民解放军第四军医大学
<120>用于促进汉坦病毒融合蛋白G1S0.7有效提呈的重组腺病毒高表达载体
<160>1
<210>1
<211>7975
<212>DNA
<213>Artificial
<400>1
taactataac ggtcctaagg tagcgaaagc tcagatctgg atctcccgat cccctatggt 60
cgactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtatctg ctccctgctt 120
gtgtgttgga ggtcgctgag tagtgcgcga gcaaaattta agctacaaca aggcaaggct 180
tgaccgacaa ttgtcgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt 240
cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc 300
ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag 360
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gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc 540
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ggggagggcc ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccatctcca gcctcggggc 1740
tgccgcaggg ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag ggcggggttc ggcttctggc 1800
gtgtgaccgg cggctctaga gcctctgcta accatgttca tgccttcttc tttttcctac 1860
agctcctggg caacgtgctg gttgttgtgc tgtctcatca ttttggcaaa gaattggcct 1920
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actacaacat ccagaaagag tccaccctgc acctggtcct tcgcctgaga ggtgcagatc 2160
agatcttaag taagtaggct agcgtttaaa cgggccctct agaatgggga tatggaagtg 2220
gctagtgatg gccagtttag tatggcctgt tttgacactg agaaatgtct atgacatgaa 2280
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taatcaccaa tcgttgaata caataacaaa acatacccaa gtaagttgga gaggaaaggc 2460
tgatcagtca cagtctagtc aaaattcatt tgagacagtg tccactgaag ttgacttgaa 2520
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accaattcat gcatgcaata tgatgaaaag ctgtttgatt gcattgggac catacagagt 2700
acaggtggtt tatgagagaa cttactgtat gacaggagtc ctgattgaag ggaaatgctt 2760
tgtcccagat caaagtgtgg tcagtattat caagcatggg atctttgata ttgcaagtgt 2820
tcatattgta tgtttctttg ttgcagttaa agggaatact tataaaattt ttgaacaggt 2880
taagaaatcc tttgaatcaa catgcaatga tacagagaat aaagtgcaag gatattatat 2940
ttgtattgta gggggaaact ctgcaccaat atatgttcca acacttgatg atttcagatc 3000
catggaagca tttacaggaa tcttcagatc accacatggg gaagatcatg atctggctgg 3060
agaagaaatt gcatcttatt ctatagtcgg acctgccaat gcaaaagttc ctcatagtgc 3120
tagctcagat acattgagct tgattgccta ttcaggtata ccatcttatt cttcccttag 3180
catcctaaca agttcaacag aagctaagca tgtattcagc cctgggttgt tcccaaaact 3240
taatcacaca aattgtgata aaagtgccat accactcata tggactggga tgattgattt 3300
acctggatac tacgaagctg tccacccttg tacagttttt tgcgtattat caggtcctgg 3360
ggcatcatgt gaagcctttt ctgaaggcgg gattttcaac ataacctctc ccatgtgctt 3420
agtgtcaaaa caaaatcgat tccggttaac agaacagcaa gtgaattttg tgtgtcagcg 3480
agtggacatg gacattgttg tgtactgcaa cgggcagagg aaagtaatat taacaaaaac 3540
tctagttatt ggacagtgta tatatactat aacaagctta ttctcattac tacctggagt 3600
agcacattct attgctgttg aattgtgtgt acctgggttc catggttggg ccacagctgc 3660
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