《一种微生物转化的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种微生物转化的方法.pdf（7页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610085562.X (22)申请日 2016.02.15 C12P 7/42(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 蔡宇杰 沈天成 邓华祥 陈佳君 钟妮尔 王静 白亚军 郑晓晖 (54) 发明名称 一种微生物转化的方法 (57) 摘要 本发明涉及采用普罗维登斯菌属微生物转化 L-苯丙氨酸生产R-(+)-2-羟基-3-苯基丙酸。 该 方法过程简单， 具有重要的工业应用价值。 (51)Int.Cl. (19)中华。
2、人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 CN 105543291 A 2016.05.04 CN 105543291 A 1.普罗维登斯菌属微生物转化L-苯丙氨酸生产R-(+)-2-羟基-3-苯基丙酸， 具体的微 生物有： 产碱普罗威登斯菌、 斯氏普罗威登斯菌、 雷极普罗威登斯菌、 害虫普罗威登斯菌、 Providenciasneebia、 Providenciaburhodogranariea。 2.根据权利1所述的菌种， 其培养过程可以在厌氧状态也可以在好氧状态进行。 3.根据权利2所述的培养得到的菌体， 其转化L-苯丙氨酸可以在厌氧状态也可以在好 氧状。
3、态进行。 4.根据权利2所述的菌体培养过程中可以直接加入L-苯丙氨酸边长菌体边转化生产R- (+)-2-羟基-3-苯基丙酸。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105543291 A 2 一种微生物转化的方法 技术领域 0001 本发明采用普罗维登斯菌转化L-苯丙氨酸生产D-苯乳酸， 属于工业微生物领域。 背景技术 0002 D-苯乳酸， 学名R-(+)-2-羟基-3-苯基丙酸， 英文名为： R-(+)-2-hydroxy-3- phenylpropanoicacid、 D-(+)-3-Phenyllacticacid。 0003 苯乳酸是近年来发现可以由部分乳酸菌分泌产生的一种新型生物防腐剂。
4、。 它有D- 苯乳酸和L-苯乳酸两种对映异体体， 能够有效抑制多种引起食物腐败的细菌及产生毒素的 真菌。 研究表明D-苯乳酸的抑菌能力略高于L-苯乳酸。 0004 作为一种新型生物防腐剂， 苯乳酸在食品工业中具重要的应用价值。 当前主要通 过大肠基因工程菌表达乳酸脱氢酶转化苯丙酮酸生产， 如中国专利CN201410818165.X、 CN201410393768.X和CN201210338378.3。 也有通过各类乳酸菌转化苯丙酮酸或苯丙氨酸生 产， 如中国专利CN201510089823.0、 CN201210005544.8等。 也有采用芽孢杆菌转化苯丙酮酸 产苯乳酸的方法(Efficie。
5、ntConversionofPhenylpyruvicAcidtoPhenyllactic AcidbyUsingWholeCellsofBacilluscoagulansSDM， 2011， PLoSOne.6(4): e19030)。 0005 基于D-苯乳酸的重要应用价值， 本专利提出了普罗维登斯菌属微生物转化L-苯丙 氨酸生产D-苯乳酸的方案。 L-苯丙氨酸当前主要通过微生物发酵法生产， 原料丰富易得。 0006 普罗维登斯菌(Providencia)是一类可使苯丙氨酸氧化脱氨的革兰氏阴性细菌。 现有主要8个种： 产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)、 。
6、斯氏普罗威登斯菌 (Providenciastuartii)、 雷极普罗威登斯菌(Providenciarettgeri)、 害虫普罗威登斯 菌(Providenciavermicola)、 Providenciasneebia、 Providenciaburhodogranariea。 普 罗维登斯菌具有强大的氧化脱氨能力(SherrisMedicalMicrobiology， 2004， 4thed.)， 0007 相关文献认为这些微生物只能将L-苯丙氨酸氧化成苯丙酮酸， 而无法进一步还原 成苯乳酸(-ketoacidsarenovelsiderophoresinthegeneraprot。
7、eus , providencia,andmorganellaandareproducedbyaminoaciddeaminases， 1993， Journalofbacteriology,175(9),2727-2733)， 这可能与之条件选择不当有关。 0008 本发明可通普罗维登斯菌微生物将L-苯丙氨酸转化成光学纯的D-苯乳酸。 苯丙酮 酸虽然是更为直接的底物， 但价格较高， 因此L-苯丙氨酸是最佳的底物。 普罗维登斯菌是一 种兼性厌氧菌， 可以在厌氧条件或好氧条件下转化生产D-苯乳酸， 具有高转化率和高纯度 的特点。 发明内容 0009 本发明通过培养普罗维登斯菌属微生物菌体， 转化。
8、L-苯丙氨酸生产D-苯乳酸， 技 术方案如下： 0010 1、 菌株 说明书 1/5 页 3 CN 105543291 A 3 0011 本发明所用的菌株有购自美国ATCC菌种库的ProvidenciaalcalifaciensATCC 9886、 ProvidenciarustigianiiATCC33673、 ProvidenciasneebiaATCCBAA-1589、 ProvidenciarettgeriATCC29944、 ProvidenciaheimbachaeATCC35613、 Providencia stuartiiATCC33672、 Providenciaburhod。
9、ogranarieaATCCBAA-1590以及购自中国工 业微生物菌种保藏管理中心的ProvidenciarettgeriCICC10488和中国典型培养物保藏 中心的ProvidenciavermicolaCCTCCAB205297。 0012 2、 菌体培养 0013 液态发酵培养基组成为： 碳源0-50g/L， 氮源0-50g/L， 磷酸氢二铵0-2g/L， 磷酸二 氢钾0-1g/L， 硫酸镁0-0.5g/L， 硫酸亚铁0-0.5g/L， 氯化纳0-5g/L， 可调节pH至2-8， 可也pH 自然； 接种量为5-20， 发酵温度为20-40， 发酵周期为24-72小时。 种子和发酵均采。
10、用此 培养基。 0014 用于培养菌种的碳源可以是葡萄糖、 果糖、 麦芽糖、 木糖、 蔗糖、 半乳糖、 甘油。 培养 用氮源可以是硫酸铵、 氯化铵、 硝酸铵、 蛋白胨、 酵母膏、 尿素、 玉米浆等有机氮源。 碳源和氮 源可以是一种或多种的组合。 0015 液态培养菌体的过程可以采用厌氧或好氧方式。 0016 3、 转化产D-苯乳酸 0017 转化过程采用的方案有2种： 0018 (1)细胞的液态培养过程， 将L-苯丙氨酸底物加入上述的培养体系中； L-苯丙氨酸 添加量为0-20g/L。 0019 (2)将液态发酵培养物离心去除发酵液得到菌体， 将菌体放入含有L-苯丙氨酸底 物的水溶液反应体系中。
11、进行； 转化过程温度20-40， pH2-8， 转化时间1-24小时。 转化液中 L-苯丙氨酸起始浓度为0.1-20g/L。 0020 4、 样品的检测分析 0021 转化液采用PerkinElmerSeries200高效液相色谱仪检测分析， 色谱条件为： 流 动相是甲醇-0.1甲酸水(40:60)、 采用汉邦MegresC18色谱柱(4.6250mm， 5 m)， 流速 0.6ml/min、 柱温30、 进样量20 l、 检测器波长200nm。 0022 采用江苏汉邦科技有限公司的DAC-HB50制备色谱柱制备转化样品， 制备色谱条件 为： 流动相50甲醇、 柱温自然、 流速3ml/min、。
12、 进样量5ml。 样品达到色谱纯99.9， 反复进 样分离得到的产品于50下真空旋转蒸干。 称取制备得到的样品0.5g， 溶于去离子水中并 定容至50ml， 采用日本爱宕AP-300全自动旋光仪测定放光度。 进一步采VarianGemini 2000(VnmrS600MHz,600/54/ASP)分析样品的核磁数据。 样品进一步采用UPLC-QTOF-MS法 分析分子量， 仪器为WatersMALDISYNAPTQTOFMS液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪。 具体实施方式 0023 实施例1 0024 转化产物的分析测定。 0025 配制培养基如下： 酵母膏5g/L， 蛋白胨10g/L， 氯化。
13、钠5g/L。 500ml三角瓶中装液量 为100ml， 共100瓶， 120， 20分钟灭菌。 取ProvidenciarustigianiiATCC33673甘油管种 子液1mL接种， 发酵温度30， 摇床转速200rpm。 培养24后， 将发酵液离心(转速10000rpm， 时 说明书 2/5 页 4 CN 105543291 A 4 间10min)， 去除上清液获得菌体， 离心获得的菌体用无菌水清洗两遍。 取40g湿菌体放入L- 苯丙氨酸浓度为20g/L的1000ml溶液中， 混合均匀。 于37摇床振荡(100rpm)48小时后， 100 水浴加热3分钟杀灭菌体。 再离心(转速10000。
14、rpm， 时间10min)去除菌体， 得到转化后的上 清液。 液相分析D-苯乳酸浓度为10.1g/L， 剩余L-苯丙氨酸浓度为7.3g/L。 采用制备色谱得 到8.2g纯品。 0026旋光仪分析其旋光度为核磁数据为:1HNMR(CDCl3600MHz): 7.33(2H,dJ7.6Hz),7.29(1H,d,J7.6Hz),7.24(2H,d,J7.6Hz)， 4.48(1H,dd,J4.3, 7.3Hz)， 4.23(2H,OHs,broad)， 3.21(1H,dd,J4.3,14.0Hz)， 2.98(1H,dd,J7.3,14.0Hz)。 13CNMR(CDCl3,600MHz): 1。
15、77.57， 135.93， 129.52， 129.53， 128.54， 128.64， 127.13， 71.12， 40.13。 转化产物的质谱数据为： (-ESI,negativemode)m/z:165.0M-1。 0027 根据以上数据， 确定其分子及光学结构与D-苯乳酸完全一致。 0028 实施例2 0029 好氧培养与厌培养的比较。 配制培养基： 葡萄糖30g/L， 蛋白胨20g/L， 磷酸氢二铵 1g/L， 磷酸二氢钾1g/L， 硫酸镁0.3g/L， 硫酸亚铁0.3g/L； 起始pH和发酵过程pH均为自然 500ml三角瓶中装液量为100ml， 共2瓶， 120， 20分钟。
16、灭菌。 0030 取ProvidenciarettgeriATCC29944甘油管种子液1mL接种1瓶， 于厌氧培养箱 中35培养72小时， 离心获得的菌体用无菌水清洗两遍。 取0.1g湿菌体放入L-苯丙氨酸浓 度为2g/L的4ml溶液中， 混合均匀， 厌氧培养箱中35静置转化24小时后， 100水浴加热3 分钟杀灭菌体。 再离心(转速10000rpm， 时间10min)去除菌体， 得到转化后的上清液。 液相分 析D-苯乳酸浓度为0.5g/L， 剩余L-苯丙氨酸浓度为1.1g/L。 0031 取ProvidenciarettgeriATCC29944甘油管种子液1mL接种1瓶， 于摇床 (20。
17、0rpm)中35培养24小时。 将发酵液离心(转速10000rpm， 时间10min)， 去除上清液获得 菌体， 离心获得的菌体用无菌水清洗两遍。 取0.1g湿菌体放入L-苯丙氨酸浓度为2g/L的4ml 溶液中， 混合均匀。 于35摇床振荡(100rpm)12小时后， 100水浴加热3分钟杀灭菌体。 再 离心(转速10000rpm， 时间10min)去除菌体， 得到转化后的上清液。 液相分析D-苯乳酸浓度 为0.6g/L， 剩余L-苯丙氨酸浓度为1.2g/L。 0032 实施例3 0033 培养基组成为： 葡萄糖1g/L， 尿素1g/L， 磷酸氢二铵1g/L， 磷酸二氢钾0.1g/L， 硫酸 。
18、镁0 .1g/L， 硫酸亚铁0 .1g/L。 250ml三角瓶中装液量为50ml， 120， 20分钟灭菌。 取 ProvidenciarettgeriCICC10488甘油管种子液0.5mL接种， 发酵温度35， 摇床转速 200rpm。 培养24后， 将发酵液离心(转速10000rpm， 时间10min)， 去除上清液获得菌体， 离心 获得的菌体用无菌水清洗两遍。 取0.05g湿菌体放入L-苯丙氨酸浓度为0.1g/L的2ml溶液 中， 并调节pH至6， 混合均匀。 于厌氧培养箱中静止转化24小时， 微孔滤膜过滤转化液， 液相 色谱分析转化液中D-苯乳酸浓度为0.01g/L。 0034 实施。
19、例4 0035 培养基组成为： 果糖50g/L， 硫酸铵5g/L， 磷酸氢二铵1g/L， 磷酸二氢钾1g/L， 硫酸 镁0 .5g/L， 硫酸亚铁0 .5g/L。 250ml三角瓶中装液量为50ml， 120， 20分钟灭菌。 取 ProvidenciaheimbachaeATCC35613甘油管种子液0.5mL接种， 发酵温度20， 摇床转速 200rpm。 培养72后， 将发酵液离心(转速10000rpm， 时间10min)， 去除上清液获得菌体， 离心 说明书 3/5 页 5 CN 105543291 A 5 获得的菌体用无菌水清洗两遍。 取0.1g湿菌体放入L-苯丙氨酸浓度为2g/L的。
20、2ml溶液中， 混 合均匀。 于20摇床振荡(100rpm)24小时后， 微孔滤膜过滤转化液， 液相色谱分析转化液中 D-苯乳酸浓度为0.5g/L及L-苯丙氨酸残留量为0.9g/L。 0036 实施例5 0037 培养基组成为： 木糖50g/L， 硫酸铵1g/L， 磷酸二氢钾1g/L， 硫酸镁0.2g/L， 硫酸亚 铁0.1g/L。 250ml三角瓶中装液量为50ml， 120， 20分钟灭菌。 取Providenciavermicola CCTCCAB205297甘油管种子液0.5mL接种， 发酵温度40， 摇床转速200rpm。 培养48后， 将 发酵液离心(转速10000rpm， 时间1。
21、0min)， 去除上清液获得菌体， 离心获得的菌体用无菌水 清洗两遍。 取0.1g湿菌体放入L-苯丙氨酸浓度为2g/L的2ml溶液中， 混合均匀。 于40摇床 振荡(100rpm)24小时后， 微孔滤膜过滤转化液， 液相色谱分析转化液中D-苯乳酸浓度为 0.2g/L及L-苯丙氨酸残留量为1.0g/L。 0038 实施例6 0039 培养基组成为： 甘油15g/L， 硝酸铵1g/L， 磷酸氢二铵1g/L， 磷酸二氢钾0.1g/L， 硫 酸镁0.1g/L， 硫酸亚铁0.1g/L。 250ml三角瓶中装液量为50ml， 120， 20分钟灭菌。 取 ProvidenciavermicolaCCTCC。
22、AB205297甘油管种子液0.5mL接种， 发酵温度30， 摇床 转速200rpm。 培养24后， 将发酵液离心(转速10000rpm， 时间10min)， 去除上清液获得菌体， 离心获得的菌体用无菌水清洗两遍。 取0.1g湿菌体放入L-苯丙氨酸浓度为2g/L的2ml溶液 中， 混合均匀。 于20厌氧培养箱中静止转化24小时， 微孔滤膜过滤转化液， 液相色谱分析 转化液中D-苯乳酸浓度为0.5g/L及L-苯丙氨酸残留量为0.7g/L。 0040 实施例7 0041 培养基组成为： 麦芽糖15g/L， 氯化铵1g/L， 磷酸氢二铵1g/L， 硫酸镁0.1g/L， 硫酸 亚铁0.1g/L， 调节。
23、pH至5。 250ml三角瓶中装液量为50ml， 120， 20分钟灭菌。 取Providencia alcalifaciensATCC9886甘油管种子液0.5mL接种， 发酵温度35， 摇床转速200rpm。 培养 24后， 将发酵液离心(转速10000rpm， 时间10min)， 去除上清液获得菌体， 离心获得的菌体用 无菌水清洗两遍。 取0.1g湿菌体放入L-苯丙氨酸浓度为3g/L的2ml溶液中， 混合均匀。 于40 厌氧培养箱中静止转化24小时， 微孔滤膜过滤转化液， 液相色谱分析转化液中D-苯乳酸 浓度为0.6g/L及L-苯丙氨酸残留量为1.1g/L。 0042 实施例8 0043。
24、 培养基组成为： 半乳糖1g/L， 尿素1g/L， 磷酸氢二铵1g/L， 磷酸二氢钾0.1g/L， 硫酸 镁0.1g/L， 硫酸亚铁0.1g/L， 调节pH至2。 250ml三角瓶中装液量为50ml， 120， 20分钟灭菌。 取ProvidenciasneebiaATCCBAA-1589甘油管种子液0.5mL接种， 发酵温度35， 摇床转 速200rpm。 培养24后， 将发酵液离心(转速10000rpm， 时间10min)， 去除上清液获得菌体， 离 心获得的菌体用无菌水清洗两遍。 取0.1g湿菌体放入L-苯丙氨酸浓度为2g/L的2ml溶液中， 并调节pH至2， 混合均匀。 于37厌氧培养。
25、箱中静止转化24小时， 微孔滤膜过滤转化液， 液相 色谱分析转化液中D-苯乳酸浓度为0.1g/L及L-苯丙氨酸残留量为1.4g/L。 0044 实施例9 0045 培养基组成为： 葡萄糖1g/L， 蛋白胨1g/L， 磷酸氢二铵1g/L， 磷酸二氢钾0.1g/L， 硫 酸亚铁0.1g/L， L-苯丙氨酸2g/L调节pH至8。 250ml三角瓶中装液量为50ml， 120， 20分钟灭 菌。 取ProvidenciastuartiiATCC33672甘油管种子液0.5mL接种， 发酵温度35， 摇床转 说明书 4/5 页 6 CN 105543291 A 6 速200rpm。 培养24后， 微孔滤。
26、膜过滤转化液， 液相色谱分析转化液中D-苯乳酸浓度为1.0g/L 及L-苯丙氨酸残留量为0.1g/L。 0046 实施例10 0047 培养基组成为： 葡萄糖1g/L， 尿素1g/L， 磷酸氢二铵1g/L， 磷酸二氢钾0.1g/L， 硫酸 镁0.1g/L， 调节pH至8。 500ml三角瓶中装液量为100ml， 120， 20分钟灭菌， 共10瓶。 各取 ProvidenciaburhodogranarieaATCCBAA-1590甘油管种子液0.5mL接种， 发酵温度35， 摇床转速200rpm。 培养24后， 将发酵液离心(转速10000rpm， 时间10min)， 去除上清液获得菌 体，。
27、 离心获得的菌体用无菌水清洗两遍。 取5g湿菌体放入L-苯丙氨酸浓度为20g/L的10ml溶 液中， 并调节pH至5， 混合均匀。 于35摇床振荡(100rpm)10小时后， 微孔滤膜过滤转化液， 液相色谱分析转化液中D-苯乳酸浓度为9.3g/L及L-苯丙氨酸残留量为8.2g/L。 0048 实施例11 0049 培养基组成为： 葡萄糖10g/L， 蛋白胨1g/L， 磷酸氢二铵1g/L， 磷酸二氢钾0.1g/L， 硫酸镁0.1g/L， 硫酸亚铁0.1g/L， pH至5。 250ml三角瓶中装液量为50ml， 120， 20分钟灭菌。 取ProvidenciaalcalifaciensATCC9886甘油管种子液0.5mL接种， 发酵温度35， 摇床 转速200rpm。 培养24后， 微孔滤膜过滤转化液， 液相色谱分析发酵液中D-苯乳酸浓度为 0.03g/L。 说明书 5/5 页 7 CN 105543291 A 7 。