《一种戈舍瑞林的合成方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种戈舍瑞林的合成方法.pdf（6页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610328261.5 (22)申请日 2016.05.18 (71)申请人 江苏开元药业有限公司 地址 210033 江苏省南京市栖霞区纬地路9 号江苏生命科技创新园F6栋9层 (72)发明人 燕立波王宝利李佼佼金永华 王军花杨振伟 (51)Int.Cl. C07K 7/23(2006.01) C07K 1/04(2006.01) C07K 1/06(2006.01) (54)发明名称 一种戈舍瑞林的合成方法 (57)摘要 本发明公开了一种多肽的合成方法， 具体涉 及一种。
2、戈舍瑞林的合成方法， 属于药物合成领 域。 本发明的技术方案包括如下步骤： 先分别合 成第一片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH和第二片 段Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH， 将 第二片段与盐酸氨基脲反应后脱去保护基得到 第三片断NH2-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro- Azgly-NH2， 将第一片断与第三片断液相耦合后 进行硝基的氧化即得目标产物戈舍瑞林。 经纯化 和冻干后后得到戈舍瑞林纯品。 本发明的产生的 废液少， 环境污染小， 纯化难度低， 不易产生消 旋， 终产物收率高， 适合于工业化生产。 权利要求书1页 。
3、说明书4页 CN 105884865 A 2016.08.24 CN 105884865 A 1.一种戈舍瑞林的合成方法， 其特征在于包括如下步骤： （1） 合成第一片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH； （2） 固相合成第二片段脱去树脂后得到Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH; （3） 将第二片断与盐酸氨基脲反应后脱去D-Ser上的Fmoc保护基得到第三片断NH2-D- Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azgly-NH2； （4） 将第一片断与第三片断在卤甲基叔丁酯存在下耦合反应得到戈舍瑞林前体， 对该 前体Arg上的硝基进。
4、行氧化后即得目标产物戈舍瑞林。 2.根据权利要求1所述的戈舍瑞林的合成方法， 其特征在于步骤 （1） 中第一片断的合成 采用固相合成方法， 由起始氨基酸Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Wang-Resin树脂反应， 再依次接入 侧链保护的氨基酸， 脱去树脂和侧链保护基后得到第一片断。 3.根据权利要求1所述的戈舍瑞林的合成方法， 其特征在于步骤 （2） 中固相合成第二片 断的方法为， 以CTC-Resin为固相载体， 起始氨基酸为Fmoc-Pro-OH， 依次接入侧链保护的氨 基酸后脱去树脂得第二片断。 4.根据权利要求1所述的戈舍瑞林的合成方法， 其特征在于步骤 （3） 中第二片断与盐酸 。
5、氨基脲反应， 盐酸氨基脲的用量为Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH摩尔量的3-5 倍。 5.根据权利要求1所述的戈舍瑞林的合成方法， 其特征在于步骤 （3） 中第二片断与盐酸 氨基脲的反应条件为： PyBop/NMM或HCTU/NMM或HBTU/NMM； PyBop或HCTU或HBTU的用量为盐 酸氨基脲相同的摩尔量； NMM的用量为盐酸氨基脲的1-1.2倍摩尔量。 6.根据权利要求1所述的戈舍瑞林的合成方法， 其特征在于步骤 （4） 中第一片段与第三 片段在卤甲基叔丁酯存在下耦合反应条件均为： PyBop/NMM或HCTU/NMM或HBTU/NMM； Py。
6、Bop 或HCTU或HBTU的用量为卤甲基叔丁酯相同的摩尔量； NMM的用量为卤甲基叔丁酯的1-1.2倍 摩尔量。 7.根据权利要求1所述的戈舍瑞林的合成方法， 其特征在于步骤 （4） 中卤甲基叔丁酯为 氯甲基丁酯或溴甲基丁酯。 8.根据权利要求1所述的戈舍瑞林的合成方法， 其特征在于步骤 （4） 中第一片断与第三 片段的用量为1： 1； 卤甲基叔丁酯与肽片断两者的用量为摩尔比1： 3-5。 9.根据权利要求1所述的戈舍瑞林的合成方法， 其特征在于步骤 （3） 中脱去Fmoc保护基 的条件为向Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azgly-OH中加入DBLK;DB。
7、LK由六氢吡啶 和DMF按体积比1： 4进行混合。 10.根据权利要求1所述的戈舍瑞林的合成方法， 其特征在于步骤 （2） 中脱去树脂的反 应条件为向Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-CTC-Resin中加入裂解液， 裂解液的加入 量与Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-CTC-Resin的摩尔比为10： 1， 裂解反应1-3小时， 裂解液为体积比1:4的三氟乙醇/DCM。 11.根据权利要求1所述的戈舍瑞林的合成方法， 其特征在于步骤 （4） 中硝基氧化的条 件为， 用水和乙醇体积比1比3做溶剂， 加入戈舍瑞林前体四倍摩尔量的铁粉。
8、或者锌粉和两 倍摩尔量的氯化铵， 回流反应2-5小时。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105884865 A 2 一种戈舍瑞林的合成方法 技术领域 0001 本发明涉及一种多肽的制备方法， 具体涉及一种戈舍瑞林的合成方法。 背景技术 0002 目前市场上常见的抗肿瘤药物以化学药为主， 但存在化疗反应副作用大等缺陷， 在临床上出现一种效果较好的促性腺释放激素 （LHRH） 类药物。 戈舍瑞林就是一种促性腺释 放激素 （LHRH） 的衍生物， 它可以抑制性激素的分泌， 从而使激素敏感性肿瘤萎缩， 副作用 少， 无心血管并发症。 该药主要适用于可用激素治疗的前列腺癌及绝经前和绝经期的乳腺 癌。 。
9、子宫内膜异位症。 0003 戈舍瑞林是一种具有十肽(decapeptide)结构的黄体激素释放激素(GnRH)结构类 似物， 也称作促性腺激素释放激素促进剂的结构类似物， 与天然GnRH的不同之处在于肽链 的第6和第10位基团上， 能促进性腺激素的释放， 作用较人体分泌的GnRH强50100倍， LHRH 类似物通过竞争结合垂体LHRH的大部分受体， 反馈性抑制LH和FSH的分泌， 从而抑制卵巢雌 激素的生成， 达到药物性卵巢切除的治疗作用。 男性病人在第一次注射此药后21天左右血 清睾丸酮浓度下降至去势水平， 并在以后的治疗中维持此浓度， 这可使大多数病人的前列 腺肿瘤消退， 症状有所改善。。
10、 0004 戈舍瑞林有两个明显的结构特征： 第一是肽端即第10位基团上有一个Azgly(NH2 结构； 第二是6位的D-Ser上有一个t-Bu保护基团。 也正是因为这两个特殊结构才使得戈舍 瑞林的活性远远高于体内自分泌的黄体激素释放激素。 这两个特征也使得它的合成方法与 传统的固相合成方法不一样， 也直接导致了戈舍瑞林的高难度合成。 0005 现有的戈舍瑞林的合成方法主要有固相或者是液相两种。 专利CN101759777和 CN102190709分别公开了液相和固相两种合成戈舍瑞林的方法。 其中利CN101759777是一 种纯液相合成戈舍瑞林的一种方法， 它是先在液相中合成一个五肽的片段， 。
11、再在液相中合 成一个四肽的片段， 然后两个片段耦合， 用钯碳脱去不需要的保护基。 此方法所有步骤均在 液相中进行， 存在消旋反应， 且随着氨基酸的逐个加入， 液相反应体系复杂， 副反应多， 五肽 和四肽片断的得率均较低， 致使终产物的产率低， 且还原剂钯碳较贵， 不利于工业大生产。 0006 专利CN102190709是一种固相合成方法， 分别固相合成一个五肽片段和四肽片段， 将两个片段进行缩合得到目标产物。 在合成四肽片段时， Azgly与树脂的连接反应难度高， 针对这一问题， US5602231和CN102746383专利都提出了改进的方法， 但仍然存在并且反应 活性差、 时间长， 收率低。
12、， 后期纯化困难等问题。 在众多固相合成戈舍瑞林的方法中， 第一步 都是Azgly与树脂反应， 均存在以上问题。 发明内容 0007 针对以上不足， 本发明提供了一种戈舍瑞林的合成的新方法。 0008 本发明使用的缩写具有如下含义： Fmoc： 芴甲氧羰基 说明书 1/4 页 3 CN 105884865 A 3 HOBt:1-羟基苯骈三唑DIC:N,N-二异丙基碳二亚胺 DMF:N,N-二甲基甲酰胺TFA:三氟乙酸 PyBop： 六氟磷酸苯并三唑 基氧基三吡咯烷基磷 Leu： 亮氨酸 Pyr焦谷氨酸D-Ser:D型丝氨酸 His： 组氨酸Pro： 脯氨酸Trp:色氨酸Ser:丝氨酸 Tyr：。
13、 酪氨酸tBu： 叔丁基Arg:精氨酸Azgly-NH2:盐酸氨基脲 DMF： N， N-二甲基甲酰胺Piperdine： 六氢吡啶 WangResin： 王树脂 TFA： 三氟乙酸HAC： 醋酸 PyBop： 六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基磷 Trt： 2-氯三苯基DCM:二氯甲烷TIS： 三异丙基硅烷 DIE(P)A： N， N-二异丙基乙胺CTCresin:CTC树脂 DBLK:哌啶 （20%的六氢吡啶） DMAP： 4-二甲氨基吡啶 本发明采用如下技术方案合成戈舍瑞林， 其合成方案为： 步骤1： 先合成一个五肽片断Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH， 该五肽片断可固相。
14、合成也可液 相合成。 其中优选为固相合成法， 固相合成的步骤如下式所示 步骤2： 固相合成四肽Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH， 其步骤如下式所示 加入裂解液脱去CTCResin树脂： 裂解液的加入量与Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-CTC-Resin的摩尔比为10： 1， 裂解反应1-3小时， 裂解液为体积比1:4的三氟乙醇/DCM。 0009 步骤3： 四肽片断与盐酸氨基脲反应 说明书 2/4 页 4 CN 105884865 A 4 盐酸氨基脲的用量为Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-。
15、OH摩尔量的3-5倍,NMM的 用量为盐酸氨基脲的1-1.2倍摩尔量， PyBop或HCTU或HBTU的用量为盐酸氨基脲相同的摩尔 量。 DBLK由六氢吡啶和DMF按体积比1： 4进行混合所得， DBLK加入适量。 0010 步骤4： 五肽片断与四肽片断液相耦合后对Arg上的硝基进行氧化 五肽与四肽的用量相同， 氯甲基叔丁酯的用量为肽片断摩尔量的3-5倍， NMM的用量为 氯甲基叔丁酯的1-1.2倍摩尔量， PyBop的用量为氯甲基叔丁酯相同的摩尔量， 其中的氯甲 酸叔丁酯也可以用溴甲酸叔丁酯替代， PyBop可以用HCTU或HBTU替代。 销基氧化时水和乙醇 体积比1比3做溶剂， 加入Pyr。
16、-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azgly- NH2四倍摩尔量的铁粉或者锌粉和两倍摩尔量的氯化铵， 回流反应2-5小时。 0011 本发明的有益效果在于所用的原料廉价易得， 通过固相合成Fmoc-D-Ser(tBu)- Leu-Arg(NO2)-Pro-OH片断后再在液相中与盐酸氨基脲反应， 解决了Azgly与树脂连接难的 问题； 分别先合成五肽和四肽， 有保护基的氨基酸集中在五肽片断上， 在脱除肽侧链保护基 的时候避免了对戈舍瑞林6位D-Ser上的t-Bu的干扰， Arg侧链的硝基氧化放在了最后一步 进行， 因为若先氧化再进行五肽和四。
17、肽耦合， Arg上的亚氨基也会与五肽进行反应， 以上几 步的创新， 减少了目标产物合成过程中发生旋光的几率， 提高了产品的质量， 纯化难度低， 终产物收率高， 适合于工业化生产。 本发明粗产物的纯度为80%以上， 产率60-70%， 经过纯化 后产品纯度98%以上， 终产品收率45%-55%。 具体实施方式 0012 实施例一： 1、 制备Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH粗肽 在固相反应柱里面加入处理好的Wang-resin树脂， 按照固相合成多肽的方法在树脂上 依次接入Fmoc-Tyr(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Trp(Boc)-OH、 Fm。
18、oc-Trp(Trt)-OH和 Boc-Pyr-OH， 得到Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Wang-resin树脂。 将得到 的树脂用裂解液进行裂解反应， 裂解液的配比为 （TFA： 苯甲硫醚： 苯甲醚： EDT=90:5:2:3） ， 裂解时间2个小时左右。 裂解结束后， 用砂芯漏斗过滤， 留下滤液， 将滤液在甲基叔丁醚中沉 降， 然后离心， 真空干燥， 得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH粗肽。 0013 2、 Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH粗肽的纯化 采用制备液相色谱仪对Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-O。
19、H粗肽进行纯化， 制备条件为A相水， B 相为乙腈， 选择C18直径50MM的DAC制备柱， 流速为40ML/MIN， 柱温为25度,波长220nm， 将粗 肽500ml泵入液相进行制备， 制备梯度为时间0-7-50(MIN)， 浓度为5-29-39 （B%） ,出峰时间 为15-20MIN， 出峰时B%浓度为25%时， 收峰高150MV为三肽纯品， 对纯品进行检测后纯度为 99.3%。 说明书 3/4 页 5 CN 105884865 A 5 0014 3、 Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH的制备 在固相反应柱里面加入处理好的CTC-resin （替代度。
20、0.8-1.2mmol/g） 树脂， 按照固相合 成多肽的方法在树脂上依次接入Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Arg(NO2)-OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-D- Ser(tBu)-OH， 得到Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-CTC-resin树脂， 裂解掉树脂后得 到Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH。 0015 4、 NH2-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azgly-NH2的合成 加入Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH摩尔量3倍的盐酸盐酸氨基。
21、脲和PyBop/ NMM反应， 得到NH2-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azgly-NH2， 然后加入DMF和DCM的混合 液中， 用氯甲酸叔丁酯和PyBop/NMM作为缩合剂进行耦合反应两个小时以上， 然后DBLK脱去 Fmoc， DBLK由六氢吡啶和DMF按体积比1： 4进行混合， 将液体旋干后， 可得到NH2-D-Ser (tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azgly-NH2。 0016 5、 Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azgly-NH2的合成。 0017 将已经制备好的等摩尔量的。
22、Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH和NH2-D-Ser(tBu)-Leu- Arg(NO2)-Pro-Azgly-NH2在0.25倍多肽摩尔量的氯甲酸叔丁酯和PyBop/NMM作为缩合剂条 件下进行耦合反应， 反应四个小时左右， 即可得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu- Arg(NO2)-Pro-Azgly-NH2。 0018 6、 在液相上， Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azgly-NH2 用水和乙醇 （体积比： 1/3） 做溶剂， 加入四倍当量铁粉或者锌粉和两倍当量氯化铵， 。
23、回流3小 时后趁热过滤， 冷却， 还原掉硝基后可以得到目标产物戈舍瑞林的粗肽。 0019 7、 将戈舍瑞林的粗肽进行纯化 用制备液色谱仪对戈舍瑞林的粗肽进行纯化， 制备条件为： A相水溶液， B相乙腈， 选择 C18直径30MM*柱长250MM制备柱， 流速为25ML/MIN.柱温为25度， 将上述过滤后粗肽100ML (即为100MG)打入液相进行制备， 制备梯度为时间0-7-50(MIN)， 浓度为5-30-38 （B%） ,出峰 时间为25MIN,出峰是B%浓度为35%。 收峰高100MV时的溶液， 即为戈舍瑞林纯品， 检测纯度 为99.3%， 回收率48%。 0020 以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想， 对本说明书内 容不应理解为对本发明的限制。 说明书 4/4 页 6 CN 105884865 A 6 。