一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的构建.pdf

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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310579783.9 (22)申请日 2013.11.19 C12N 15/11(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12R 1/865(2006.01) C12R 1/68(2006.01) (73)专利权人 湖北工业大学 地址 430068 湖北省武汉市武昌区南湖李家 墩 1 村 1 号 (72)发明人 薛栋升 汪江波 蔡凤娇 曹敬华 陈茂彬 方尚玲 镇达 (74)专利代理机构 武汉科皓知识产权代理事务 所 ( 特殊普通合伙 ) 42222 代理人 张火春 Mura。

2、i, T. et al.Assimilation of cellooligosaccharides by a cell surface-engineered yeast expressing-glucosidase and carboxymethylcellulase from Aspergillus aculeatus.APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY .1998, 第 48574861 页 . NCBI.Genbank ： HM769954.1.NCBI GENBANK .2010, NCBI.Z46234.1.NCBI GENBANK .200。

3、5, Fei Wen et al.Yeast Surface Display of Trifunctional Minicellulosomes for Simultaneous Saccharification and Fermentation of Cellulose to Ethanol.APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY .2010, 摘要， 第 1252 页右栏 第二段， 第 1253 页图 1， 第 1254 页左栏第二段 . NCBI.XM002419047.1.NCBI GENBANK .2009, NCBI.AB304872.1.NC。

4、BI GENBANK .2009, NCBI.JX268037.1.NCBI GENBANK .2012, (54) 发明名称 一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能 的酵母菌株的构建 (57) 摘要 本发明公开了一种具有生产和回收纤维素外 切酶双重功能的酵母菌株的构建， 属于酶工程领 域。通过把酿酒酵母 TDH3 启动子序列、 酿酒酵母 分泌信号肽编码序列、 黑曲霉纤维素外切酶编码 序列、 酿酒酵母凝聚因子 C 端的 400 个氨基酸片 段编码序列、 酿酒酵母 TDH3 终止子序列按顺序合 成， 在两端加上限制性内切酶位点， 通过酶切构建 到 pPIC9K 质粒中， 再将该质粒转化到酵母中得。

5、到 具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌 株。其生产纤维素外切酶的回收率达到 86%， 发酵 后外切酶的酶活达到 1.5U/g 湿酵母。本发明实 现了纤维素外切酶生产和同步浓缩回收的一步完 成， 降低了能源消耗， 降低了成本， 具有较强的实 用性。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 沈晶晶 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 序列表5页 CN 103589719 B 2016.03.30 CN 103589719 B 1/1 页 2 1.用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的 DNA 片段， 其特征在 于 ：。

6、 包括按顺序排列的酿酒酵母 TDH3 启动子序列、 酿酒酵母分泌信号肽编码序列、 黑曲霉 纤维素外切酶编码序列、 酿酒酵母凝聚因子 C 端的 401 个氨基酸片段编码序列、 酿酒酵母 TDH3 终止子序列 ； 所述的序列分别如 SEQ ID NO.1 5 所示。 2.用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的质粒， 其特征在于 ： 为包含权利要求 1 所述的 DNA 片段的真核表达质粒。 3.根据权利要求 2 所述的质粒， 其特征在于 ： 所述的真核表达质粒为 pPIC9K 质粒。 4.根据权利要求2所述的质粒， 其特征在于 ： 通过包含如下步骤的方法制备得到 ： 合成 两端有限制。

7、性内切酶识别位点含有权利要求 1 所述的 DNA 片段的序列， 通过限制性内切酶 连接到真核表达质粒上。 5.根据权利要求 4 所述的质粒， 其特征在于 ： 所述的真核表达质粒为 pPIC9K 质粒时， 限制性内切酶为 Bgl 和 FspA 。 6.一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株， 其特征在于 ： 包含权利要 求 2-5 任一项所述的质粒 ； 所述的酵母菌株由权利要求 2-5 任一项所述的质粒电转化酵母 菌株 SMD1168 而得。 7.权利要求 6 所述的酵母菌株的构建方法， 其特征在于包括如下步骤 ： 制备酵母电转 化感受态细胞， 将权利要求 2-5 任一项所述的质粒通过。

8、电转化转进酵母 SMD1168 中得到。 权 利 要 求 书 CN 103589719 B 2 1/5 页 3 一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的 构建 技术领域 0001 本发明属于酶工程领域， 具体涉及一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的 酵母菌株的构建。 背景技术 0002 纤维素是地球上最丰富的可再生资源， 地球上每年因光合作用产生的纤维素达到 100 亿吨左右， 利用纤维素生产生物能源， 是缓解能源危机， 实现人类可持续发展的关键。 0003 纤维素利用的关键是把纤维素降解为可发酵性的糖类 - 葡萄糖。纤维素的降解需 要外切酶、 内切酶、 葡聚糖苷酶的共同作用。其。

9、中外切酶降解晶体结构的纤维素， 是纤维素 降解的限速步骤。用纤维素酶降解纤维素具有绿色、 条件温和、 转化率高的特点， 但是纤维 素较高的生产成本成为纤维素酶降解纤维素的瓶颈。 0004 液体发酵具有发酵体积大， 易实现自动化控制等特点， 被广泛用来生产纤维素外 切酶等。但是液体发酵生产的酶类产品浓度低的特征。生产的纤维素外切酶等都游离在发 酵醪液中， 为得到高浓度的纤维素外切酶或外切酶的固体粉末， 需要对发酵醪液进行浓缩。 为纯化浓缩纤维素外切酶往往需要通过真空蒸发或喷雾干燥等工艺来浓缩。 在纤维素蒸发 浓缩或喷雾干燥的过程中， 纤维素外切酶的活性丧失一部分， 而且浓缩工艺大幅度提高了 纤维。

10、素酶的生产成本。在蒸发或喷雾干燥的过程中， 消耗大量的能源如电或燃气等。因此 浓缩成本， 成为降低液体发酵生产纤维素外切酶生产成本的必然选择。 发明内容 0005 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足， 提供一种具有生产和回收纤 维素外切酶双重功能的酵母菌株。 0006 本发明的另一目的在于提供用于构建上述酵母菌株的 DNA 片段。 0007 本发明的再一目的在于提供用于构建上述酵母菌株的质粒。 0008 本发明的目的还在于提供上述酵母菌株的构建方法。 0009 本发明的目的通过下述技术方案实现 ： 0010 用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的 DNA 片段， 包括。

11、按 顺序排列的酿酒酵母 TDH3 启动子序列、 酿酒酵母分泌信号肽编码序列、 黑曲霉纤维素外切 酶编码序列、 酿酒酵母凝聚因子 C 端的 400 个氨基酸片段编码序列、 酿酒酵母 TDH3 终止子 序列 ； 上述序列分别如 SEQ ID NO.1 5 所示。 0011 优选的， 所述的用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的 DNA 片段的序列如 SEQ ID NO.6 所示。 0012 用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的质粒为包含上述 DNA 片段的真核表达质粒。所述的真核表达质粒优选为 pPIC9K 质粒。 0013 所述的用于构建具有生产和回收纤维素外切。

12、酶双重功能的酵母菌株的质粒通过 说 明 书 CN 103589719 B 3 2/5 页 4 包含如下步骤的方法制备得到 ： 合成两端有限制性内切酶识别位点含有上述 DNA 片段的序 列， 通过限制性内切酶连接到真核表达质粒上。所述的真核表达质粒 pPIC9K 质粒时， 限制 性内切酶优选为 Bgl 和 FspA 。 0014 一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株， 含有上述质粒。所述的 酵母菌株优选为酵母菌株 SMD1168。 0015 所述的具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的构建方法， 包括如下 步骤 ： 制备酵母电转化感受态细胞， 将上述质粒通过电转化转进酵母中得。

13、到。 0016 本发明相对于现有技术具有如下优点和效果 ： 0017 本发明的酵母菌株能在生产纤维素外切酶的同时， 把纤维素外切酶吸收在菌株自 身表面， 通过简单过滤， 就能达到浓缩纤维素外切酶的目的。 0018 本发明大大简化了纤维素外切酶的浓缩工艺， 降低了能源消耗， 大幅度降低了成 本， 因此该发明具有较强的实用性。 0019 本发明把黑曲霉 （Aspergillus niger） 纤维外切酶基因在酵母内表达， 并实现了 烟曲霉外切酶生产和同步浓缩回收的一步完成， 现有技术未有相关报道， 具有较高的创新 型。 0020 本发明酵母菌株生产纤维素外切酶的回收率达到 88%， 发酵后外切酶的。

14、酶活达到 1.5 U/g 湿酵母。 具体实施方式 0021 下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限于此。 若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 0022 实施例 1 0023 （1） pPIC9K 质粒的提取 0024 1） 接 1% 含 pPIC9K 质粒的大肠杆菌细胞于 2 mL LB 培养基。 0025 2） 37 振荡培养 12 h。 0026 3） 取 1.5 mL 菌液于 EP 管， 以 4000 rpm 离心 3 min， 弃上清液。 0027 4） 加 0.l mL 溶液 （1% 葡萄糖， 50 mM EDTA p。

15、H 8.0， 25 mM Tris-HCl pH 8.0） 充 分混合。 0028 5） 加入 0.2 mL 溶液 （0.2 mM NaOH， 1% SDS） ， 轻轻翻转混匀， 置于冰浴 5 min。 0029 6） 加入 0.15 mL 预冷溶液 （5 mol/L KAc， pH4.8） ， 轻轻翻转混匀， 冰浴 5 min。 0030 7） 以 10000 rpm 离心 20 min， 取上清液于另一新 EP 管中。 0031 8） 加入等体积的异戊醇， 混匀后静置 10 min。 0032 9） 再以 10000 rpm 离心 20 min， 弃上清。 0033 10） 用 70% 乙。

16、醇 0.5 mL 洗涤一次， 抽干所有液体。 0034 11） 待沉淀干燥后， 溶于 0.05 mL TE 缓冲液中。 0035 （2） 大肠杆菌 DH5 感受态细胞的制备 0036 1） 将大肠杆菌 DH5 置于 LB 或其它营养丰富的培养基上， 在 37 下过夜培养。 0037 2） 高温灭菌大的离心瓶 （250 500 mL） 以备第二天摇瓶用。 0038 3） 准备几瓶灭菌水 （总量约 1.5 升） ， 保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用。 说 明 书 CN 103589719 B 4 3/5 页 5 0039 4） 转移 0.2 1 mL 过夜培养物至装有 20 mL LB（或其他。

17、营养丰富的培养基） 的 100 mL 摇瓶。 0040 5） 37 下剧烈振荡培养 6 小时。 0041 6） 监控 OD600 值 （培养 1 小时后每半小时测定一次） 。 0042 7） 当 OD600 值达到 0.5 1.0 时， 从摇床中取出摇瓶， 置于冰上冷却 15 分钟。 0043 8） 细胞在 4 5000g 下离心 15 分钟， 弃上清液。 0044 9） 用灭菌的冰水重悬浮细胞， 先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中 （几 毫升） ， 然后加水稀释至离心管的 2/3 体积。 0045 10） 照上面步骤重复离心， 小心弃去上清液。 0046 11） 照上面步骤用灭菌的冰水。

18、重悬浮细胞。 0047 12） 离心， 弃上清液。 0048 13） 用 20 mL 灭菌的、 冰冷后的 10% 甘油重悬浮细胞。 0049 14） 照上面步骤离心， 小心弃去上清液 （沉淀可能会很松散） 。 0050 15） 用 10% 甘油重悬浮细胞至最终体积为 2 3 mL。 0051 16） 将细胞按 150 L 等份装入微量离心管， 于 -80 保存。 0052 （3） pPIC9K-CHB 质粒构建 0053 1） 用限制性内切酶 Bgl 、 FspA 分别酶切质粒 pPIC9K。限制性内切酶 Bgl 、 FspA （TAkaRA） 各 1.5 L， 提取的 pPIC9K 质粒溶液。

19、 6 L， 10K Buffer 1 L 加入到 100 L EP 管中， 在 30 水浴锅中酶切 60 min。再通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切的质粒 pPIC9K。 0054 2） 序列合成 0055 合成两端具有 Bgl 和 FspA 识别序列的序列 GGAGATCTTCTAGACC 酿酒酵母 TDH3 启动子序列 酿酒酵母分泌信号肽编码序列 黑曲霉纤维素外切酶编码序列 酿酒酵母凝聚因子 C 端的 400 个氨基酸片段编码序列 酿酒酵母 TDH3 终止子序列 GGTGCGCACCC， 各片段及全长片段如 SEQ ID NO.1 6 所示。 0056 3） 连接 0057 合成的碱基序列 20。

20、 L， 酶切的 pPIC9K 质粒 5 L， 10buffer 5 L， ddH2O 10L， T4 DNA 连接酶 （Takara） 5 L 加入 100 L EP 管中， 16 连接过夜。 0058 4） 将上述连接产物电转化到大肠杆菌 DH5， 电转化具体方法如下 ： 0059 4.1） 在冰上解冻大肠杆菌 DH5 感受态细胞添加 1 10 L 连接产物， 冰上放置 约 5 分钟。 0060 4.2） 转移连接产物 / 细胞混合物至冷却后的 2mm 电穿孔容器中。 0061 4.3） 加载电转仪 P1000， 准备好 300 L LB 或 2YT。 0062 4.4） 对电穿孔容器进行脉。

21、冲 （200 欧姆， 25 F， 2.5 千伏） ， 检查时间常数， 应该在 3 以上。 0063 4.5） 立即添加 300 L 的 LB 或 2YT 至电转杯中 。 0064 4.6） 37 下培养细胞 40 分钟至 1 小时以复苏。 0065 4.7） 复苏后离心弃掉 150 L 上清， 剩余 150 L 重悬菌体涂布到含有氨苄 （100 g/mL） 的 LB 或 2YT 培养基的固体平板上， 于 37 培养过夜。 说 明 书 CN 103589719 B 5 4/5 页 6 0066 5） 挑去固体平板上生长的单克隆， 通过培养， 提取质粒， 用Bgl和FspA对质粒 进行酶切鉴定， 。

22、鉴定正确的质粒再进一步测序， 得到质粒 pPIC9K-CBH。 0067 （4） 酵母感受态细胞的制备 0068 1） 挑一环酵母菌 （SMD1168） 接种于 5 mL YEPD 培养基中， 30 250 300 rpm 培 养过夜得到一级种子。 0069 2） 取 1 mL 一级种子分别接种于两瓶 50 mL YEPD 培养基中， 30 250 300 rpm 培养约 16 18 h（OD600 约 1.3 1.5） 。 0070 3） 于 4 离心收集菌体， 用 25 mL 冰预冷无菌水洗涤一次后， 细胞用 10 mL 冰预 冷无菌水重悬， 可换成较小的离心管。 0071 4） 加入 1。

23、 mL pH 7.5 的 10TE 缓冲液， 摇晃均匀， 再加入 1 mL 10LiAc， 旋转摇 匀， 于 30 轻轻摇动 45 min。 0072 5） 再加入 0.4 mL 1 mol/L DTT， 并同时旋转摇动， 于 30 轻轻摇动 15 min。 0073 6） 于 4 离心， 弃上清 （用枪吸） ， 再用 25 mL 冰预冷无菌水洗涤。 0074 7） 2.5 mL 冰预冷的 1 mol/L 山梨醇洗涤， 离心收集菌体， 弃上清 （用枪吸） 。 0075 8） 每管用100 L 1 mol/L山梨醇溶解， 分装于3个EP管中 （80 L/管） ， 于-70 冰箱保存。 0076 。

24、（5） pPIC9K-CBH 质粒电转化酵母 0077 1） 向酵母感受态细胞中加入约 5 10 g（体积小于 10 L） pPIC9K-CBH 质粒， 用枪吹吸均匀， 转移至预冷的电转杯中， 静置 5min。 0078 2） 擦干电转杯， 电击， 电击参数 ： 1.5 KV， 25 F， 200 欧姆。 0079 3） 立即加入 1 mL 冰预冷的 1 mol/L 山梨醇， 转移至离心管中， 于 30 静置 1h。 0080 4） 离心， 弃上清， 加入 1 mL YEPD 后， 于 30 、 200 rpm 培养 2 h。 0081 5） 离心得菌体后， 吸除 550 L 上清液， 然后取。

25、 150 L 涂 100 g/mL 氨苄 YEPD 板于 30 培养至长出转化子。 0082 （6） 酵母转化子发酵 0083 挑取的转化子在 YEPD 培养基中 30 培养 24 h， 以 10% 接种量 （v/v） 接种于发酵 培养基 （酵母浸膏 10 g/L， 蛋白胨 20 g/L， 50 mM 柠檬酸缓冲液， 麸皮 200 g/L， 羟甲基纤维 素 20 g/L， 1 L 水） 中。发酵在 500 mL 摇瓶中发酵， 装液量为 20%（v/v） 。在发酵培养基中 培 48 h。 0084 （7） 纤维素外切酶的回收 0085 发酵液在离心机中 4000 r/m 离心 10 min， 收。

26、集上清 （上清中有游离的外切酶， 用 于外切酶回收率的计算） ， 按酵母沉淀湿重与蒸馏水质量比 1:10 的比例加入蒸馏水， 用蒸 馏水洗涤两次， 收集酵母沉淀， 纤维素外切酶固定在酵母表面。 0086 外切酶酶活测定 ： 以微晶纤维素为底物， 在 50 进行酶降解反应。在 25 mL 试管 中加入 10 mL 含有 20 g/L pH 5.0 的微晶纤维素柠檬酸缓冲液 （微晶纤维素溶于 pH 5.0 的 0.05 M 柠檬酸缓冲液） ， 再加入离心后上清液 20 mL 或酵母沉淀 0.1 g， 在水浴锅中 50 保温 30 min， 然后用沸水煮沸 5 min。用 DNS 法测定还原糖的含量。

27、。 0087 酶活定义为 ： 每分钟释放出 1 mol 还原糖所需要的酶量。 0088 外切酶回收率 （%） =酵母沉淀的酶活/(上清液的酶活+酵母沉淀的酶活)100%。 说 明 书 CN 103589719 B 6 5/5 页 7 0089 经过测定外切酶的回收率达到88%， 发酵后外切酶的酶活达到1.5 U/g湿酵母。 外 切酶较高的回收率， 说明在发酵的时候， 构建的酵母能很好的富集浓缩纤维素外切酶， 实现 了发酵和浓缩的一步完成。 0090 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替。

28、代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103589719 B 7 1/5 页 8 SEQUENCE LISTING 湖北工业大学 一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的构建 1 8 PatentIn version 3.5 1 711 DNA Saccharomyces cerevisiae 1 agtttatcat tatcaatact agtttatcat tatcaatact cgccatttca aagaatacgt 60 aaataattaa tagtagtgat tttcctaact ttatttagtc aaa。

29、aaattag ccttttaatt 120 ctgctgtaac ccgtacatgc ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt 180 aggtgtctgg gtgaacagtt tattcctggc atccactaaa tataatggag cccgcttttt 240 aagctggcat ccagaaaaaa aaagaatccc agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc 300 atcagttcat aggtccattc tcttagcgca actacagaga acaggggcac aaacaggcaa 3。

30、60 aaaacgggca caacctcaat ggagtgatgc aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg 420 caattgaccc acgcatgtat ctatctcatt ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc 480 tctgatttgg aaaaagctga aaaaaaaggt tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta 540 cttgactaat aagtatataa agacggtagg tattgattgt aattctgtaa atctatttct 600 taaacttctt aaattc。

31、tact tttatagtta gtcttttttt tagttttaaa acaccagaac 660 ttagtttcga cggatttagt tttaaaacac cagaacttag tttcgacgga t 711 2 253 DNA Saccharomyces cerevisiae 2 ggatccaaac gatgagattt ccttcaattt ttactgcagt tttattcgca gcatcctccg 60 cattagctgc tccagtcaac actacaacag aagatgaaac ggcacaaatt ccggctgaag 120 ctgtcatcgg。

32、 ttactcagat ttagaagggg atttcgatgt tgctgttttg ccattttcca 180 acagcacaaa taacgggtta ttgtttataa atactactat tgccagcatt gctgctaaag 240 aagaaggggt atc 253 3 1548 DNA Aspergillus niger 3 序 列 表 CN 103589719 B 8 2/5 页 9 cagcaggttg gcacctacac cactgagacg catccgtctt tgacctggca aacctgcacc 60 agcagtggca gctgcacta。

33、c taatgacggc gcggtggtca ttgatgccaa ttggcgctgg 120 gtgcactcga cctccagctc caccaactgc tacactggca acgagtggga cacctcgatc 180 tgtaccgacg atgtgacctg cgccgcgaac tgcgcgctcg atggtgccac ttacgaggcg 240 acctacggtg tgactacctc cggcgacgag ctgcgcctga acttcgtcac ccagggctcc 300 agcaagaaca tcggatcccg gttgtacctc atgagtg。

34、atg acagtaccta tgagatgttc 360 aagctcctcg gccaggagtt cacatttgac gtggacgtgt ccaacctccc ctgcggtctc 420 aacggcgcgc tgtacttcgt cgccatggac gctgacggcg gcacctcgga gtactctggc 480 aacaaggccg gcgccaaata cggtaccgga tactgcgact cgcagtgccc ccgcgacctg 540 aagttcatca atggcgaagc caactgcgac ggctgggagc catctagcaa caacg。

35、tcaac 600 accggtgttg gcgaccacgg ctcctgctgc cctgagatgg acatctggga agcgaacagc 660 atctccaacg ccttcaccgc acacccatgc gactccgtca gccagaccat gtgcgacggc 720 gactcctgcg gtggaactta cagcgccagc ggcgaccgct acagcggcac ttgcgacccc 780 gacggctgcg actacaaccc ctaccgtctg ggcaacacgg acttttacgg tcccggcctg 840 accgtcgaca。

36、 cgaacagccc cttcaccgtc gtcacccagt tcatcaccga cgacggcacc 900 tcctccggta ccctgaccga gatcaagcgg ttgtacgtgc aaaacggcga ggtcatcgcc 960 aacggcgcct ccacctactc cagcgtcaac ggcagctcga tcacttccga tttctgtgaa 1020 tcagaaaaga ctctgtttgg cgatgagaac gtgtttgaca cgcacggcgg tctcgcaggc 1080 atgggcgagg ctatggcgaa tggaat。

37、ggtc ttggtcctga gtctgtggga tgactacgcc 1140 gccaacatgc tctggcttga cagcgactac cccgtcaact cgtcggcctc aacaccgggt 1200 gtggctcgcg gtacttgtag cactgactcg ggtgtcccgg ctactgtgga ggcggattca 1260 cccaatgcgt atgtcacgta ctcgaacatc aagttcgggc ccattggctc gacttactcc 1320 agtgggtctt cttcggggtc ggggtctagc tccagctcca 。

38、gctctactac cacgaaggcc 1380 acttcgacga ccttgaagac taccacgacg accagcagcg gtagcagttc tacttcggcg 1440 gcgcaggcat atggacagtg tggtggacag agctggacgg gtccgaccac ttgtgtgagt 1500 ggatacactt gcacgtatca gaatgcgtac tactcgcagt gtttgtag 1548 4 1203 DNA Saccharomyces cerevisiae 4 atgaaattta gttctactac attattagct gt。

39、gttagcat cactttcggc cactgtcaat 60 gccggatgtt catttgaagg tggaaactac tactgttcag aaaccaaaaa agtcgtctac 120 aagggtatcg gattctctgg ttcttatcaa gacgttacca atatggatga aaacactggt 180 aaatgtactc aaaaatcata ttcctttagt ggtaacttgt ctccattaga cgaagaatta 240 tctgttcatt tcagaggacc tttgaaatta ttagaatttg gtgtttacta c。

40、ccaagcagt 300 aatggtaatt caaagagaca agttgacgaa caagattgta atacaaaaca cgttcatcat 360 aaacacaaga gagcaactga agttgttcaa gtcacacaaa cagttttcgt tgatggtaat 420 ggtaacactg ttacttctca agccctccaa acctctacta ttgaaacaaa ttcagctgct 480 序 列 表 CN 103589719 B 9 3/5 页 10 tcatcacctg ctgctaataa tgatgccaac tcaggttctg 。

41、gttctggttc cggttccggt 540 tatggatctg tttctgccct tgacggtgaa ggcaaagctt atagaaccga tatctcaacc 600 aaatctgctc caacctcaac atctgctcaa ccatcttcat cagaaactgc ctctgctgat 660 ggtgcttgga ccagagacag tcattacact ccaggatcca ctgataactg tgtgttcttg 720 aactatcatg gtggttctgg ttctggtgtt tggtctgcta attttggtaa ctcattatc。

42、t 780 tatgccaact ccgataattc tggtgggtct tcaactcctg ttgccttggg agaaaccact 840 atcaaatctg gcgaagaatt catcatcttc tctggttcta aatgtggtag tagttccgat 900 tgtggttatt atagagatgg tactgttgct tatcacggtt tcaaaggaac tagcaagatt 960 tttgtttttg aatttgaaat gccaagtgat actaatggta acggttataa ccaagacatg 1020 ccagccgttt gg。

43、ttattgaa tgctaagatc ccaagaactt tacaatacgg tgaagccact 1080 tgttcttgtt ggaagaccgg ttgtggtgaa ttagatttgt ttgaagtctt aagcagtggt 1140 tccagtaaaa tgatttctca cttgcacgat ggtcaaggtt cttctcaaaa cagtaacaat 1200 taa 1203 5 281 DNA Saccharomyces cerevisiae 5 gggggtaccg ggcccggccg caaattaaag ccttcgagcg tcccaaaacc。

44、 ttctcaagca 60 aggttttcag tataatgtta catgcgtaca cgcgtctgta cagaaaaaaa agaaaaattt 120 gaaatataaa taacgttctt aatactaaca taactataaa aaaataaata gggacctaga 180 cttcaggttg tctaactcct tccttttcgg ttagagcgga tgtgggggga gggcgtgaat 240 gtaagcgtga cataactaat tacatgatgc ggccctttaa a 281 6 3996 DNA Artificial Seq。

45、uence 用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的 DNA 片段 6 agtttatcat tatcaatact agtttatcat tatcaatact cgccatttca aagaatacgt 60 aaataattaa tagtagtgat tttcctaact ttatttagtc aaaaaattag ccttttaatt 120 ctgctgtaac ccgtacatgc ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt 180 aggtgtctgg gtgaacagtt tattcctggc atccactaaa tata。

46、atggag cccgcttttt 240 aagctggcat ccagaaaaaa aaagaatccc agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc 300 atcagttcat aggtccattc tcttagcgca actacagaga acaggggcac aaacaggcaa 360 aaaacgggca caacctcaat ggagtgatgc aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg 420 caattgaccc acgcatgtat ctatctcatt ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc 48。

47、0 tctgatttgg aaaaagctga aaaaaaaggt tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta 540 序 列 表 CN 103589719 B 10 4/5 页 11 cttgactaat aagtatataa agacggtagg tattgattgt aattctgtaa atctatttct 600 taaacttctt aaattctact tttatagtta gtcttttttt tagttttaaa acaccagaac 660 ttagtttcga cggatttagt tttaaaacac cagaacttag tttcgacgga 。

48、tggatccaaa 720 cgatgagatt tccttcaatt tttactgcag ttttattcgc agcatcctcc gcattagctg 780 ctccagtcaa cactacaaca gaagatgaaa cggcacaaat tccggctgaa gctgtcatcg 840 gttactcaga tttagaaggg gatttcgatg ttgctgtttt gccattttcc aacagcacaa 900 ataacgggtt attgtttata aatactacta ttgccagcat tgctgctaaa gaagaagggg 960 tatccagcag gttggcacct acaccactga gacgcatccg tctttgacct ggcaaacctg 1020 caccagcagt ggcagctgca ctactaatga cggcgcggtg gtcattgatg ccaattggcg 1080 ctgggtgcac tcgacctcca gctccaccaa ctgctacact ggcaacgagt gggacacctc 1140 gatctg。