《一种微生物转化的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种微生物转化的方法.pdf（7页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610085608.8 (22)申请日 2016.02.15 C12P 7/42(2006.01) C12R 1/37(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道 1800 号 申请人 西北大学 (72)发明人 蔡宇杰 徐锦槿 邓华祥 陈佳君 王静 钟妮尔 白亚军 郑晓晖 (54) 发明名称 一种微生物转化的方法 (57) 摘要 本发明涉及采用变形杆菌属微生物转化左旋 多巴生产R-(+)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙 酸。该方法过程简单， 具有重要的工业应用价值。 (51)I。
2、nt.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 CN 105543292 A 2016.05.04 CN 105543292 A 1.变形杆菌属微生物转化左旋多巴生产R-(+)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸， 具 体的微生物有： 普通变形杆菌、 奇异变形杆菌、 产黏变形杆菌、 潘氏变形杆菌和豪氏变形杆 菌。 2.根据权利1所述的菌种， 其培养过程可以在厌氧状态也可以在好氧状态进行。 3.根据权利2所述的培养得到的菌体， 其转化左旋多巴可以在厌氧状态也可以在好氧 状态进行。 4.根据权利2所述的菌体培养过程中可以直接加入左旋多巴边。
3、长菌体边转化生产R- (+)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105543292 A 2 一种微生物转化的方法 技术领域 0001 本发明采用变形杆菌转化左旋多巴生产丹参素， 属于工业微生物领域。 背景技术 0002 丹参素， 学名R-(+)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸、 D-(+)- -(3,4-二羟基苯 基)乳酸， 英文名为： Danshensu、 (R)-(+)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-lacticacid、 (R)- (+)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropan。
4、oicacid， 是一种右旋酚酸类化合物。 0003 丹参素是丹参水提液中的重要要有效成份， 国内于1980年从丹参水提液中得到并 鉴定了结构(丹参水溶性有效成分的研究,.D(+) (3,4-二羟基苯基)乳酸的结构， 上海第 一医学院学报， 1980， 05(7)， 384-385)， 各种研究表明丹参素具有重要的药理药效作用， 在 心脑血管疾病的治疗等方面具有独特治疗作用。 0004 当前丹参素主要从丹参中提取得到(专利CN200810038853.9)。 丹参素在丹参中的 含量较低， 并且丹参素种植成本高且产量有限， 因此当前丹参素不仅价格高而且远远无法 满足市场的需求。 专利CN2013。
5、10559498.0提出了一种构建大肠杆菌基因工程图利用葡萄糖 发酵产丹参素的方法， 由于合成代谢途径涉及利用羟基化酶， 该酶很容易使代谢过程产物 氧化而影响丹参素的产率， 同时由于大肠杆菌发酵是高耗氧过程， 也会氧化丹参素， 因此当 前该方法产率较低， 成本将会高于植物提取过程。 专利CN201210190171.6提出了水解丹酚 酸B生产丹参素的方法， 丹酚酸B需从丹参提取， 并且化学水解过程有大量副反应， 同样不适 用于规模化生产。 手性合成丹参素(专利CN201210420488.4)的催化剂极为昂贵， 当前也仅 停留在实验室水平。 0005 基于丹参素的重要应用价值， 本专利提出了采。
6、用变形杆菌属微生物转化左旋多巴 生产丹参素的方案。 左旋多巴也叫： L-3-(3 ,4-二羟基苯基)丙氨酸(L-DOPA， L-3 ,4- dihydroxyphenylalanine)。 当前左旋多巴可从植物提取也可微生物发酵生产(Overview onthebiotechnologicalproductionofL-DOPA， 2015， ApplMicrobiolBiotechnol， 99:575584)， 原料丰富易得。 0006 变形杆菌(Proteus)是广泛分布在自然界中， 如土壤、 水、 垃圾、 腐败有机物及人或 动物的肠道内的微生物。 现有5个种： 普通变形杆菌(Prote。
7、usvulgaris)、 奇异变形杆菌 (Proteusmirabilis)、 产黏变形杆菌(Proteusmyxofaciens)、 潘氏变形杆菌(Proteus penneri)和豪氏变形杆菌(Proteushauseri)。 变形杆菌具有强大的氧化脱氨能力 (SherrisMedicalMicrobiology， 2004， 4thed.)， 左旋多巴可以被变形杆菌氧化脱氨成 3,4-二羟基苯丙酮酸(3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-oxopropanoicacid)， 然后再还原成 丹参素。 3,4-二羟基苯丙酮酸虽然是更为直接的底物， 但价格昂贵且不稳定， 因此左旋。
8、多巴 是最佳的底物。 变形杆菌是一种兼性厌氧菌， 可以在厌氧条件或好氧条件下转化生产丹参 素， 具有高转化率和高纯度的特点。 发明内容 说明书 1/5 页 3 CN 105543292 A 3 0007 本发明通过培养变形杆菌属微生物菌体， 转化左旋多巴生产丹参素， 技术方案如 下： 0008 1、 菌株 0009 本发明所用的菌株有购自美国ATCC菌种库的ProteusmirabilisATCC29906、 ProteusmyxofaciensATCC19692、 ProteushauseriATCC700826、 Proteuspenneri ATCC33519、 Proteusmirab。
9、ilisATCC25933、 ProteusmirabilisATCC33946、 Proteus vulgarisATCC19181、 ProteusvulgarisATCC27972以及购自中国工业微生物菌种保藏 管理中心的ProteusvulgarisCICC10401、 ProteusmirabilisCICC22928。 0010 2、 菌体培养 0011 液态发酵培养基组成为： 碳源0-50g/L， 氮源0-50g/L， 磷酸氢二铵0-2g/L， 磷酸二 氢钾0-1g/L， 硫酸镁0-0.5g/L， 硫酸亚铁0-0.5g/L， 氯化纳0-5g/L， 可调节pH至2-8， 可也pH 。
10、自然； 接种量为5-20， 发酵温度为20-40， 发酵周期为24-72小时。 种子和发酵均采用此 培养基。 0012 用于培养菌种的碳源可以是葡萄糖、 果糖、 麦芽糖、 木糖、 蔗糖、 半乳糖、 甘油。 培养 用氮源可以是硫酸铵、 氯化铵、 硝酸铵、 蛋白胨、 酵母膏、 尿素、 玉米浆等有机氮源。 碳源和氮 源可以是一种或多种的组合。 0013 液态培养菌体的过程可以采用厌氧或好氧方式。 0014 3、 转化产丹参素 0015 转化过程采用的方案有2种： 0016 (1)细胞的液态培养过程， 将左旋多巴底物加入上述的培养体系中； 左旋多巴添加 量为0-3g/L。 0017 (2)将液态发酵培。
11、养物离心去除发酵液得到菌体， 将菌体放入含有左旋多巴底物 的水溶液反应体系中进行； 转化过程温度20-40， pH2-8， 转化时间1-24小时。 转化液中左 旋多巴起始浓度为0.1-3g/L。 0018 4、 样品的检测分析 0019 转化液采用PerkinElmerSeries200高效液相色谱仪检测分析， 色谱条件为： 流 动相是甲醇-0.1甲酸水(40:60)、 采用汉邦MegresC18色谱柱(4.6250mm， 5 m)， 流速 0.6ml/min、 柱温30、 进样量20 l、 检测器波长280nm。 0020 采用江苏汉邦科技有限公司的DAC-HB50制备色谱柱制备转化样品， 。
12、制备色谱条件 为： 流动相50甲醇、 柱温自然、 流速3ml/min、 进样量5ml。 样品达到色谱纯99.9， 反复进 样分离得到的产品于50下真空旋转蒸干。 称取制备得到的样品0.5g， 溶于去离子水中并 定容至50ml， 采用日本爱宕AP-300全自动旋光仪测定放光度。 进一步采VarianGemini 2000(VnmrS600MHz,600/54/ASP)分析样品的核磁数据。 样品进一步采用UPLC-QTOF-MS法 分析分子量， 仪器为WatersMALDISYNAPTQTOFMS液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪。 具体实施方式 0021 实施例1 0022 转化产物的分析测定。 。
13、0023 配制培养基如下： 酵母酵母膏5g/L， 蛋白胨10g/L， 氯化钠5g/L。 500ml三角瓶中装 说明书 2/5 页 4 CN 105543292 A 4 液量为100ml， 共50瓶， 120， 20分钟灭菌。 取ProteusmirabilisATCC29906甘油管种子 液1mL接种， 发酵温度30， 摇床转速200rpm。 培养24后， 将发酵液离心(转速10000rpm， 时间 10min)， 去除上清液获得菌体， 离心获得的菌体用无菌水清洗两遍。 取20g湿菌体放入左旋 多巴浓度为2g/L的1000ml溶液中， 混合均匀。 于37摇床振荡(100rpm)24小时后， 1。
14、00水 浴加热3分钟杀灭菌体。 再离心(转速10000rpm， 时间10min)去除菌体， 得到转化后的上清 液。 液相分析丹参素浓度为1.3g/L， 剩余左旋多巴浓度为0.5g/L。 采用制备色谱得到1.03g 纯品。 0024旋光仪分析其旋光度为核磁数据为:1HNMR(DMSO-d6,600MHz): 8.76(s,1H),6.63(dd,J24Hz,1H),6.64(dd,J12Hz,1H),6.45(dd,J24Hz,1H),5.48 (s,1H),4.06-4.17(m,1H),2.61-2.81(m,1H)； 13CNMR(DMSO-d6,600MHz): 175.4,174.2,。
15、 144.9,144.7,143.8,143.6,128.9,128.5,120.4,120.2,117.0,116.8,115.4,115.2,71.6, 71.6,51.4。 转化产物的质谱数据为： (-ESI,negativemode)m/z:197.0M-1。 0025 根据以上数据及相关文献(Stereochemicalconfigurationof-(3 ,4- dihydroxyphenyl)lacticacidfromRosmarinusofficinalis.RicereaSci.80:255- 259.Chem.Abs.54:24520.1960， 丹参水溶性有效成分的研究。
16、,.D(+) (3,4-二羟基苯 基)乳酸的结构， 上海第一医学院学报， 1980， 05(7)， 384-385)， 确定其分子及光学结构与天 然丹参素完全一致。 0026 实施例2 0027 好氧培养与厌培养的比较。 配制培养基： 葡萄糖30g/L， 蛋白胨20g/L， 磷酸氢二铵 1g/L， 磷酸二氢钾1g/L， 硫酸镁0.3g/L， 硫酸亚铁0.3g/L； 起始pH和发酵过程pH均为自然 500ml三角瓶中装液量为100ml， 共2瓶， 120， 20分钟灭菌。 0028 取ProteusmirabilisCICC22928甘油管种子液1mL接种1瓶， 于厌氧培养箱中35 培养72小时。
17、， 离心获得的菌体用无菌水清洗两遍。 取0.1g湿菌体放入左旋多巴浓度为2g/ L的4ml溶液中， 混合均匀， 厌氧培养箱中35静置转化24小时后， 100水浴加热3分钟杀灭 菌体。 再离心(转速10000rpm， 时间10min)去除菌体， 得到转化后的上清液。 液相分析丹参素 浓度为1.1g/L， 剩余左旋多巴浓度为0.6g/L。 0029 取ProteusmirabilisCICC22928甘油管种子液1mL接种1瓶， 于摇床(200rpm)中 35培养24小时。 将发酵液离心(转速10000rpm， 时间10min)， 去除上清液获得菌体， 离心获 得的菌体用无菌水清洗两遍。 取0.1。
18、g湿菌体放入左旋多巴浓度为2g/L的4ml溶液中， 混合均 匀。 于35摇床振荡(100rpm)12小时后， 100水浴加热3分钟杀灭菌体。 再离心(转速 10000rpm， 时间10min)去除菌体， 得到转化后的上清液。 液相分析丹参素浓度为1.0g/L， 剩 余左旋多巴浓度为0.5g/L。 0030 实施例3 0031 培养基组成为： 葡萄糖1g/L， 尿素1g/L， 磷酸氢二铵1g/L， 磷酸二氢钾0.1g/L， 硫酸 镁0.1g/L， 硫酸亚铁0.1g/L。 250ml三角瓶中装液量为50ml， 120， 20分钟灭菌。 取Proteus vulgarisATCC19181甘油管种子。
19、液0.5mL接种， 发酵温度35， 摇床转速200rpm。 培养24 后， 将发酵液离心(转速10000rpm， 时间10min)， 去除上清液获得菌体， 离心获得的菌体用无 菌水清洗两遍。 取0.05g湿菌体放入左旋多巴浓度为0.1g/L的2ml溶液中， 并调节pH至6， 混 合均匀。 于厌氧培养箱中静止转化24小时， 微孔滤膜过滤转化液， 液相色谱分析转化液中丹 说明书 3/5 页 5 CN 105543292 A 5 参素浓度为0.08g/L及左旋多巴残留量为0g/L。 0032 实施例4 0033 培养基组成为： 果糖50g/L， 硫酸铵5g/L， 磷酸氢二铵1g/L， 磷酸二氢钾1g。
20、/L， 硫酸 镁0.5g/L， 硫酸亚铁0.5g/L。 250ml三角瓶中装液量为50ml， 120， 20分钟灭菌。 取Proteus hauseriATCC700826甘油管种子液0.5mL接种， 发酵温度20， 摇床转速200rpm。 培养72 后， 将发酵液离心(转速10000rpm， 时间10min)， 去除上清液获得菌体， 离心获得的菌体用无 菌水清洗两遍。 取0.1g湿菌体放入左旋多巴浓度为2g/L的2ml溶液中， 混合均匀。 于20摇 床振荡(100rpm)24小时后， 微孔滤膜过滤转化液， 液相色谱分析转化液中丹参素浓度为 0.8g/L及左旋多巴残留量为0.6g/L。 003。
21、4 实施例5 0035 培养基组成为： 木糖50g/L， 硫酸铵1g/L， 磷酸氢二铵1g/L， 磷酸二氢钾1g/L， 硫酸 镁0.2g/L， 硫酸亚铁0.1g/L。 250ml三角瓶中装液量为50ml， 120， 20分钟灭菌。 取Proteus vulgarisCICC10401甘油管种子液0.5mL接种， 发酵温度40， 摇床转速200rpm。 培养48 后， 将发酵液离心(转速10000rpm， 时间10min)， 去除上清液获得菌体， 离心获得的菌体用无 菌水清洗两遍。 取0.1g湿菌体放入左旋多巴浓度为2g/L的2ml溶液中， 混合均匀。 于40摇 床振荡(100rpm)24小时后。
22、， 微孔滤膜过滤转化液， 液相色谱分析转化液中丹参素浓度为 0.5g/L及左旋多巴残留量为1.3g/L。 0036 实施例6 0037 培养基组成为： 甘油15g/L， 硝酸铵1g/L， 磷酸氢二铵1g/L， 磷酸二氢钾0.1g/L， 硫 酸镁0.1g/L， 硫酸亚铁0.1g/L。 250ml三角瓶中装液量为50ml， 120， 20分钟灭菌。 取 ProteusmyxofaciensATCC19692甘油管种子液0.5mL接种， 发酵温度30， 摇床转速 200rpm。 培养24后， 将发酵液离心(转速10000rpm， 时间10min)， 去除上清液获得菌体， 离心 获得的菌体用无菌水清洗。
23、两遍。 取0.1g湿菌体放入左旋多巴浓度为2g/L的2ml溶液中， 混合 均匀。 于20厌氧培养箱中静止转化24小时， 微孔滤膜过滤转化液， 液相色谱分析转化液中 丹参素浓度为0.7g/L及左旋多巴残留量为1.0g/L。 0038 实施例7 0039 培养基组成为： 麦芽糖15g/L， 氯化铵1g/L， 磷酸氢二铵1g/L， 磷酸二氢钾0.1g/L， 硫酸镁0.1g/L， 硫酸亚铁0.1g/L， 调节pH至5。 250ml三角瓶中装液量为50ml， 120， 20分钟 灭菌。 取ProteusvulgarisATCC27972甘油管种子液0.5mL接种， 发酵温度35， 摇床转速 200rpm。
24、。 培养24后， 将发酵液离心(转速10000rpm， 时间10min)， 去除上清液获得菌体， 离心 获得的菌体用无菌水清洗两遍。 取0.1g湿菌体放入左旋多巴浓度为3g/L的2ml溶液中， 混合 均匀。 于40厌氧培养箱中静止转化24小时， 微孔滤膜过滤转化液， 液相色谱分析转化液中 丹参素浓度为1.1g/L及左旋多巴残留量为1.6g/L。 0040 实施例8 0041 培养基组成为： 半乳糖1g/L， 尿素1g/L， 磷酸氢二铵1g/L， 硫酸镁0.1g/L， 硫酸亚铁 0 .1g/L， 调节pH至2。 250ml三角瓶中装液量为50ml， 120， 20分钟灭菌。 取Proteus v。
25、ulgarisATCC25933甘油管种子液0.5mL接种， 发酵温度35， 摇床转速200rpm。 培养24 后， 将发酵液离心(转速10000rpm， 时间10min)， 去除上清液获得菌体， 离心获得的菌体用无 菌水清洗两遍。 取0.1g湿菌体放入左旋多巴浓度为2g/L的2ml溶液中， 并调节pH至2， 混合均 说明书 4/5 页 6 CN 105543292 A 6 匀。 于37厌氧培养箱中静止转化24小时， 微孔滤膜过滤转化液， 液相色谱分析转化液中丹 参素浓度为0.3g/L及左旋多巴残留量为1.4g/L。 0042 实施例9 0043 培养基组成为： 葡萄糖5g/L， 蛋白胨1g/。
26、L， 磷酸二氢钾0.1g/L， 硫酸镁0.1g/L， 硫酸 亚铁0.1g/L， 调节pH至8。 250ml三角瓶中装液量为50ml， 120， 20分钟灭菌。 加入过滤除菌 的左旋多巴使培养基终度达2g/L， ProteusmirabilisATCC33946甘油管种子液0.5mL接 种， 发酵温度35， 摇床转速200rpm。 培养24后， 微孔滤膜过滤转化液， 液相色谱分析转化液 中丹参素浓度为1g/L及左旋多巴残留量为0.2g/L。 0044 实施例10 0045 培养基组成为： 葡萄糖10g/L， 尿素1g/L， 磷酸氢二铵1g/L， 磷酸二氢钾0.1g/L， 硫 酸亚铁0.1g/L，。
27、 调节pH至8。 500ml三角瓶中装液量为100ml， 120， 20分钟灭菌， 共10瓶。 各 取ProteuspenneriATCC33519甘油管种子液0.5mL接种， 发酵温度35， 摇床转速 200rpm。 培养24后， 将发酵液离心(转速10000rpm， 时间10min)， 去除上清液获得菌体， 离心 获得的菌体用无菌水清洗两遍。 取5g湿菌体放入左旋多巴浓度为3g/L的10ml溶液中， 并调 节pH至5， 混合均匀。 于35摇床振荡(100rpm)1小时后， 微孔滤膜过滤转化液， 液相色谱分 析转化液中丹参素浓度为2.3g/L及左旋多巴残留量为0.5g/L。 0046 实施例11 0047 培养基组成为： 葡萄糖10g/L， 蛋白胨1g/L， 磷酸氢二铵1g/L， 磷酸二氢钾0.1g/L， 硫酸镁0.1g/L， pH至5。 250ml三角瓶中装液量为50ml， 120， 20分钟灭菌。 取Proteus mirabilisATCC33946甘油管种子液0.5mL接种， 发酵温度35， 摇床转速200rpm。 培养24 后， 微孔滤膜过滤转化液， 液相色谱分析转化液中丹参素浓度为0.01g/L及左旋多巴含量为 0.05g/L。 说明书 5/5 页 7 CN 105543292 A 7 。