单胺氧化酶诊断试剂盒及单胺氧化酶活性浓度测定方法.pdf

本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的单胺氧化酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定单胺氧化酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、胺类化合物、碳酸氢钠(二氧化碳)、乙酰辅酶A、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出单胺氧化酶的活性浓度大小。

1.  一种利用酶比色法及酶联法技术的单胺氧化酶活性浓度测定方法，其方法原理如下：
胺类化合物+水+氧单胺氧化酶相应醛类产物+氨+
                                        过氧化氢
二氧化碳+过氧化氢+乙酰辅酶A  丙酮酸氧化酶  丙酮酸
                                         +辅酶A+氧
氨+丙酮酸+还原型辅酶  丙氨酸脱氢酶  丙氨酸+水+辅酶
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出单胺氧化酶的活性浓度大小结果。

2.  一种单胺氧化酶诊断试剂盒，主要成分包括：
缓冲液                20——500mmol/L
稳定剂                1——4000mmol/L
还原型辅酶            0.1——0.35mmol/L
丙酮酸氧化酶          1000——80000U/L
丙氨酸脱氢酶          1000——80000U/L
胺类化合物            1——50mmol/L
碳酸氢钠(二氧化碳)    1——50mmol/L
乙酰辅酶A             1——50mmol/L
试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.  根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、胺类化合物、碳酸氢钠(二氧化碳)、乙酰辅酶A组成单剂试剂。

4.  根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、胺类化合物、碳酸氢钠(二氧化碳)、乙酰辅酶A组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、胺类化合物、碳酸氢钠(二氧化碳)、乙酰辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶组成。还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、胺类化合物、碳酸氢钠(二氧化碳)、乙酰辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。

5.  根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、胺类化合物、碳酸氢钠(二氧化碳)、乙酰辅酶A组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、胺类化合物、碳酸氢钠(二氧化碳)、乙酰辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶组成。还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、胺类化合物、碳酸氢钠(二氧化碳)、乙酰辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。

6.  根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。

单胺氧化酶诊断试剂盒及单胺氧化酶活性浓度测定方法
技术领域
本发明涉及一种单胺氧化酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定单胺氧化酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术
单胺氧化酶(MAO)测定可分为化学分光光度法、荧光法、免疫抑制法及现在申请专利的酶法。一般多用化学分光光度法，单胺氧化酶反应底物以苄胺(Benzylamine)和对苯甲胺-β-偶氮萘酚，也可应用单胺氧化酶催化胺类释放出的H₂O₂氧化发色剂，如10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-二甲氨基-10-氢-吩噻嗪(MCDP)。除此之外，单胺氧化酶反应底物还有丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine)、β-苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyramine：3-对羟基苯乙胺3-parahdroxyphenylethylamine)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine)等，丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺约为3-对羟基苯乙胺活性的30％，通常应用苯甲胺作为底物比其他底物的单胺氧化酶活性要高。目前单胺氧化酶测定多用苄胺和对苯甲胺-β-偶氮萘酚为底物，但对苯甲胺-β-偶氮萘酚苄胺法需要用环乙烷提取，限制了该方法的实用性，且不能应用全自动生化仪分析；苄胺法的原理是苄胺在单胺氧化酶的作用下生成苄醛，然后在强碱性氢氧化钠的条件下与二硝基苯肼反应，生成醛苯腙，在生化仪上测定也较困难。
荧光法检测单胺氧化酶是以β-苯乙胺作为底物，其在10~100mg时Km最大，高于苄胺和5-羟色胺的Km值。
免疫学方法是利用单胺氧化酶抗体与单胺氧化酶发生反应，作用后进行单胺氧化酶同工酶测定。目前应用较多的单克隆抗体是MAO-A3C9、MAO-A4F10、MAO-A7B10、MAO-A7E10和MAO-B1C2等。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定单胺氧化酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的单胺氧化酶诊断试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行单胺氧化酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明单胺氧化酶活性浓度测定方法原理如下：
胺类化合物+水+氧单胺氧化酶相应醛类产物+氨+
                                        过氧化氢
二氧化碳+过氧化氢+乙酰辅酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸
                                        +辅酶A+氧
氨+丙酮酸+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶丙氨酸+水+辅酶
这种方法应用单胺氧化酶(Monoamine Oxidase；EC 1.4.3.4；EC 1.4.3.6)酶(偶)联丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase(CoA-acetylating)；EC 1.2.3.6)、丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase；EC 1.4.1.1)酶促反应连续监测法。单胺氧化酶酶解胺类化合物反应产生氨及过氧化氢，再通过(偶)联合丙酮酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算单胺氧化酶的活性浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明单胺氧化酶诊断试剂较为理想：
缓冲液                    100mmol/L
稳定剂                    500mmol/L
还原型辅酶                0.25mmol/L
丙酮酸氧化酶              10000U/L
丙氨酸脱氢酶              10000U/L
胺类化合物                10mmol/L
碳酸氢钠(二氧化碳)        15mmol/L
乙酰辅酶A                 8mmol/L
本发明的单胺氧化酶诊断试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、胺类化合物、碳酸氢钠(二氧化碳)、乙酰辅酶A。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、胺类化合物、碳酸氢钠(二氧化碳)、乙酰辅酶A。
试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶。
还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、胺类化合物、碳酸氢钠(二氧化碳)、乙酰辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、胺类化合物、碳酸氢钠(二氧化碳)、乙酰辅酶A。
试剂2
缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶。
还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、胺类化合物、碳酸氢钠(二氧化碳)、乙酰辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定单胺氧化酶活性浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的单胺氧化酶诊断试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
还原型辅酶                       0.25mmol/L
丙酮酸氧化酶                    10000U/L
丙氨酸脱氢酶                    10000U/L
胺类化合物                      10mmol/L
碳酸氢钠(二氧化碳)              15mmol/L
乙酰辅酶A                       8mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测单胺氧化酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值-4180。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出单胺氧化酶的活性浓度大小。
实施例二
本实施例的单胺氧化酶诊断试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
还原型辅酶                       0.25mmol/L
胺类化合物                       10mmol/L
碳酸氢钠(二氧化碳)               15mmol/L
乙酰辅酶A                        8mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
丙酮酸氧化酶                     10000U/L
丙氨酸脱氢酶                     10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测单胺氧化酶样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值-2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出单胺氧化酶的活性浓度大小。
实施例三
本实施例的单胺氧化酶诊断试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
还原型辅酶                       0.25mmol/L
胺类化合物                       10mmol/L
碳酸氢钠(二氧化碳)               15mmol/L
乙酰辅酶A                        8mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
丙氨酸脱氢酶                        10000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液       100mmol/L
稳定剂                              500mmol/L
丙酮酸氧化酶                        10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定单胺氧化酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测单胺氧化酶样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值-2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出单胺氧化酶的活性浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.0003；吸光度时间反应曲线应呈直线下降；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达500U/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±3％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤2％；试剂在2-8℃下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。