扩增抗体重链前导序列及可变区基因序列的方法及其引物.pdf

本发明公开了一种特别适合于扩增单克隆抗体重链基因的引物，所述的引物具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的序列。所述的引物适用于多种类型的单克隆抗体重链可变区的扩增，包括IgG1，IgG2a，IgG2b等抗体亚型。本发明还公开了一种获得单克隆抗体重链基因的方法。

1.  一种获得单克隆抗体重链基因的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)以SEQ ID NO：1所示序列为引物，以杂交瘤细胞的RNA为模板，进行反转录，获得cDNA；
(2)在反转录获得的cDNA的3’末端加上多聚N，获得加尾产物；其中N是选自A、T、C或G之一的碱基，N的个数是5-120个；
(3)以SEQ ID NO：2所示序列和多聚M为引物，以加尾产物为模板，进行PCR扩增，获得扩增产物；其中M是选自A、T、C或G之一且与N互补配对的碱基，M的个数是10-40个；和
(4)从扩增产物中分离获得单克隆抗体重链基因。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，N是选自C或G的碱基。

3.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，PCR扩增的热循环过程中，退火温度是60-65℃。

4.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：对获得的抗体重链基因进行测序，从而获得单克隆抗体重链基因的序列。

5.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单克隆抗体是：IgG1，IgG2a或IgG2b型。

6.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单克隆抗体重链基因包括抗体重链的前导序列和可变区基因。

7.  一种用于扩增单克隆抗体重链基因的引物，其特征在于，所述的引物具有选自下组的序列：SEQ ID NO：1所示的序列，或SEQ ID NO：2所示的序列。

8.  一种扩增单克隆抗体重链基因的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有引物，所述的引物具有SEQ ID NO：1所示的序列和SEQ ID NO：2所示的序列。

9.  如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有：同聚物加尾试剂，用于在反转录产物中cDNA的3’末端加上多聚N，获得加尾产物；其中N是选自A、T、C或G之一的碱基，N的个数是5-120个；和/或
多聚M引物，M是选自A、T、C或G之一且与N互补配对的碱基，M的个数是10-40个。

10.  如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有：
PCR扩增试剂；和/或
RNA提取试剂；和/或
使用说明书。

扩增抗体重链前导序列及可变区基因序列的方法及其引物
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种扩增重链前导序列及可变区基因序列的方法及引物。
背景技术
单克隆抗体作为一种新型生物制剂在人类疾病的预防、诊断和治疗方面已显示出重要的作用。但是由于单克隆抗体大都来自于鼠源，鼠源性单抗属于异种蛋白而具有免疫原性，故在人体内产生不同程度的人抗鼠抗体(HAMA)反应，从而削弱其治疗的有效性，并对清除抗体的器官产生损害。并且在人体中常不能有效地活化补体和Fc受体相关的效应系统，因此其在人体内重复应用具有一定局限性。为了克服这些鼠源单抗的缺点，基因工程抗体技术应运而生。它是在基因水平上，对抗体进行改造，或者构建完全新型的抗体。基因工程抗体主要包括嵌合抗体，人源化抗体及一些小分子抗体，如Fab，scFv等。
嵌合抗体是人源化抗体的最早形式。在嵌合抗体的构建过程中，准确地克隆鼠抗体的信号肽和可变区基因是最为重要的。在B细胞发育过程中重链可变区基因首先重排，然后是轻链可变区基因。最后每个B细胞只含有一个功能性重链可变区DNA序列和一个轻链可变区DNA序列，每个这样的B细胞产生一种特异性抗体。重链可变区基因重排包括D-J重排和V-DJ重排两个独立的过程，可有8262种组合；轻链可变区基因的重排包括V-J重排，可有320种组合。因此，相对于轻链可变区来说，重链可变区的多样性更高，扩增的难度更大。
近年来，由于分子生物学技术的发展，PCR技术已被广泛用于克隆VH或VL基因。根据小鼠Ig重链和轻链V区基因5’端及3’端相对保守的特点，可以设计相应的引物通过反转录PCR来扩增重链及轻链的相应功能区。目前，根据5’端引物配对的位置不同，扩增鼠抗体可变区基因的简并引物设计方式主要分为两种：一种是抗体重链和轻链V区5’端引物与V区的前导序列互补，重链V区3’端引物与IgG CH15’端及所有V区J段3’端互补，轻链V区3’端引物与κ链CL5’端和轻链V区的所有J段3’段互补；另一种引物分别与抗体可变区基因骨架区FR1和FR4互补。上述第一种引物的简并性基本不会造成PCR产物与原基因序列上氨基酸的差异，但由于前导序列变化较大，引物设计难度高，往往得不到所需的扩增产物；而第二种引物因为其简并性，有可能造成抗体氨基酸的变异或缺失，这种差异可能会导致构建的嵌合抗体的亲和力等功能的降低。由于目前抗体基因库的资料有限，因此这些比较常见的引物可能不适用于扩增一些特殊单抗的基因。
鉴于以上问题，近年来出现的RACE技术具有省时、灵敏和高效的特点。RACE(rapid amplification cDNA end)即cDNA克隆法或快速扩增cDNA末端法。5’RACE是以PCR技术为基础，使用Oligo(dT)对mRNA进行反转录后，再用脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)给cDNA的5’端进行同聚物加尾反应，从而在未知的cDNA的5’端加上一段linker，然后再用基因特异引物和linker引物经PCR扩增未知mRNA的5’端。采用5’RACE的方法可以得抗体的可变区及信号肽的真实序列，继而保证通过基因工程改造得到的抗体的功能。然而要成功应用这种方法还有许多技术上的难题。首先，在3个连续的酶促反应(反转录、TdT加尾、PCR扩增)步骤中，每一个步骤的失败都会导致实验完全或部分失败；其次，即使3个酶促反应均能顺利进行，但其结果也通常会出现一些非特异产物或非全长的产物背景，对基因特异引物的设计要求很高。随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，其中以CLONTECH的MarathoTM技术和SMART TM RACE技术为代表。但是这些商业化的产品的操作繁琐，实验周期较长，而且成本高昂，成功率也不很理想，均不太适合用来扩增抗体的可变区序列。
因此，本领域迫切需要开发操作简便、成本低廉、效果优异的扩增抗体可变区序列的方法及产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种获得单克隆抗体重链基因的方法，所述方法适用于多种类型的单克隆抗体的重链扩增，操作简便，成本低廉。
本发明的另一目的在于提供用于扩增单克隆抗体重链基因的引物，以及含有所述引物或其它相关试剂的试剂盒。
在本发明的第一方面，提供一种获得单克隆抗体重链基因的方法，所述方法包括：
(1)以SEQ ID NO：1所示序列为引物，以杂交瘤细胞的RNA为模板，进行反转录，获得cDNA；
(2)在反转录获得的cDNA的3’末端加上多聚N，获得加尾产物；其中N是选自A、T、C或G之一的碱基，N的个数是5-120个；
(3)以SEQ ID NO：2所示序列和多聚M为引物，以加尾产物为模板，进行PCR扩增，获得扩增产物；其中M是选自A、T、C或G之一且与N互补配对的碱基，M的个数是10-40个；和
(4)从扩增产物中分离获得单克隆抗体重链基因。
在一个优选例中，N是选自C或G的碱基。更佳的，当N选择C或G时，N或M的个数是10-40个；较佳的，N或M的个数是15-30个，如15个。
在另一优选例中，当N选择A或T时，N的个数是50-120个；较佳的，N的个数是70-100个，如80个。M的个数是10-40个，较佳的为10-30个，更佳的为15-30个。
在另一优选例中，在步骤(3)中，PCR扩增的热循环过程中，退火温度是60-65℃(更佳的是62-63℃)。
在另一优选例中，还包括步骤：对获得的抗体重链基因进行测序，从而获得单克隆抗体重链基因的序列。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体是(但不限于)：IgG1，IgG2a或IgG2b型。
在另一优选例中，所述的杂交瘤细胞是鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。
在另一优选例中，所述的鼠是小鼠。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体重链基因包括抗体重链的前导序列和可变区基因。
在本发明的第二方面，提供一种用于扩增单克隆抗体重链基因的引物，所述的引物具有选自下组的序列：SEQ ID NO：1所示的序列，或SEQ ID NO：2所示的序列。
在本发明的第三方面，提供一种扩增单克隆抗体重链基因的试剂盒，所述的试剂盒中含有引物，所述的引物具有SEQ ID NO：1所示的序列和SEQ ID NO：2所示的序列。
在另一优选例中，所述试剂盒中还含有：同聚物加尾试剂，用于在反转录产物中cDNA的3’末端加上多聚N，获得加尾产物；其中N是选自A、T、C或G之一的碱基，N的个数是5-120个；和/或
多聚M引物，M是选自A、T、C或G之一且与N互补配对的碱基，M的个数是10-40个。
在另一优选例中，所述试剂盒中还含有：
PCR扩增试剂；和/或
RNA提取试剂；和/或
使用说明书。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示了利用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3对同聚物加尾后的cDNAPCR扩增结果。其中：
泳道1.获自N-57-19(anti-VSV-G)的cDNA的扩增产物电泳结果；
泳道2.获自N-34-12(anti-IA-2)的cDNA的扩增产物电泳结果；
泳道3.获自S-42-27(anti-BHLHB3-BSA)的cDNA的扩增产物电泳结果；
泳道4.获自N-176-15(anti-SARS Spike protein)的cDNA的扩增产物电泳结果；
泳道5.获自23-7(anti-EGFR/-)的cDNA的扩增产物电泳结果；
泳道6.获自S-19-9(anti-BHLHB3-BSA)的cDNA的扩增产物电泳结果；
泳道7.获自S-200-23(anti-NP)的cDNA的扩增产物电泳结果；
泳道8.获自S-44-10(anti-PSA)的cDNA的扩增产物电泳结果；
泳道9.获自S-29-3(anti-e-Ag)的cDNA的扩增产物电泳结果；
M表示100bp DNA Marker。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，分析和总结了大量的单克隆抗体基因的序列特性并在此基础上设计了一类可有效扩增单克隆抗体重链可变区的引物。所述的引物适用于多种类型的单克隆抗体重链可变区的扩增，包括IgG1，IgG2a，IgG2b等抗体亚型。并且，在PCR扩增过程中，反转录后不需要纯化cDNA即可进行后续的加尾和扩增，因而操作简便，成本低廉。
如本文所用，术语“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成(制成)”、“基本上由......构成”、和“由......构成”。
引物
本发明提供了一类用于扩增单克隆抗体重链基因的引物，所述的引物具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列，适用于IgG1，IgG2a，IgG2b等亚型的单克隆抗体重链基因的扩增。
SEQ ID NO：1的引物具有18个碱基，由本发明人在对大量的已知免疫球蛋白基因进行保守性分析和总结的基础上设计而成，其对应于鼠抗体重链恒定区CH1的部分序列。SEQ ID NO：1的引物用于从杂交瘤细胞的RNA(如总RNA或mRNA)中反转录获得含有单克隆抗体重链前导序列和可变区基因的cDNA第一链。
SEQ ID NO：2的引物具有33个碱基组成，由本发明人在对大量的已知免疫球蛋白基因进行保守性分析和总结的基础上设计而成，其对应于鼠抗体重链恒定区CH1的接近N端的部分序列。SEQ ID NO：2的引物中，GC比例约为51％，Tm值为79℃，较高的GC比例和Tm值的引物可提高产物特异性，更适用于RACE反应。SEQ ID NO：2的引物用于cDNA同聚物加尾后的PCR扩增。
此外，在cDNA同聚物加尾后的PCR扩增中，还需要对应于cDNA另一端加尾序列的引物。所述的加尾序列对应的引物是多聚M(PolyM)引物，其中M是选自A、T、C或G的碱基，其可与加尾序列的碱基互补。优选的M是选组C或G的碱基。更具体地，若加尾序列是多聚C(PolyC)，则所述的加尾序列对应的引物是多聚G(PolyG)；反之若加尾序列是多聚G，则所述的加尾序列对应的引物是多聚C。M的个数没有特别的限制，其是与加尾序列相适应的，通常是10-40个，例如10-40个，较佳的15-30个，如15个。一种优选的多聚M引物如SEQ ID NO：3所示，其对应于cDNA加尾序列是多聚G的情形。
扩增单克隆抗体重链基因的方法
本发明提供了一种获得单克隆抗体重链基因的方法，所述方法包括：
(1)以SEQ ID NO：1所示序列为引物，以杂交瘤细胞的RNA为模板，进行反转录，获得cDNA；
(2)在反转录获得的cDNA的3’末端加上多聚N，获得加尾产物；其中N是选自A、T、C或G的碱基，N的个数是15-120个；
(3)以SEQ ID NO：2所示序列和多聚M为引物，以加尾产物为模板，进行PCR扩增，获得扩增产物；其中M是选自A、T、C或G且与N互补配对的碱基，M的个数是10-40个；和
(4)从扩增产物中分离获得单克隆抗体重链基因。
上述方法中，步骤(1)是反转录过程，即利用一条引物以RNA(如杂交瘤细胞的总RNA或mRNA)为模板合成cDNA第一链。利用SEQ ID NO：1所示序列的引物，所合成的cDNA第一链含有抗体重链恒定区CH1的部分序列，抗体重链前导序列(包括信号肽编码序列)和可变区序列。
所述的杂交瘤细胞是所需扩增的单克隆抗体的分泌细胞。较佳的，所述的杂交瘤细胞是鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。较佳的，所述的鼠是小鼠。
上述方法中，步骤(2)是给cDNA第一链进行同聚物加尾的步骤，其基于的是5’RACE原理。同聚物加尾的方法是本领域技术人员已知的技术，一种加尾的方法是以末端脱氧核苷酸转移酶(如TdT)催化，在cDNA末端加上多聚的核苷酸(称为多聚N(Poly(N))。
进行加尾时，N优选的是碱基C或G，C与G的互补可形成三个氢键的结构，结合特异性优于A与T两个氢键的的互补结合。较佳的，N的个数是10-40个；更佳的，N的个数是15-30个，如15个。
当N选择A或T时，N的个数是50-120个；较佳的，N的个数是70-100个，如80个。M的个数是10-40个，较佳的为1O-30个，更佳的为15-30个。
上述方法中，步骤(3)是基于同聚物加尾后的cDNA为模板PCR扩增抗体重链的过程。该过程中，采用SEQ ID NO：2所示序列的引物和可与cDNA上加尾序列互补的多聚M引物。由于SEQ ID NO：2所示序列的引物是针对CH1的接近N端的部分序列设计而成，因此扩增所获得的序列上含有的C()H1序列少且易于被区分；且扩增产物含有完整的抗体重链前导序列和可变区序列。
PCR扩增的方法没有特别的限制，可以采用本领域常规的PCR扩增方法。较佳的，在PCR扩增的热循环过程中，退火温度较佳的是60-65℃；更佳的是62-63℃。
采用本发明的方法，在反转录后得到的cDNA第一链不需要经过乙醇沉淀纯化等步骤就可以直接用于后续的cDNA加尾和PCR扩增，大大简化了步骤，提高了效率。并且，加尾后的cDNA也不需经过纯化，可直接用常规的PCR，即不需要采用热启动PCR，就可以获得抗体重链前导序列及可变区序列。在不进行纯化的情况下，也可获得较为理想的效果。
当然，为了获得更加理想的PCR扩增效率，也可在合成cDNA第一链后，以及cDNA加尾后进行cDNA的纯化，所述方法也包括在本发明内。
在获得了PCR扩增产物后，可以通过本领域已知的多种技术对所述的扩增产物进行分离，以获得纯化的重链基因。一种较为常用的方法是将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，收集具有合适大小(如约500bp)的电泳条带，然后通过常规基因纯化技术从电泳条带中分离出所述的重链基因。
对获得的抗体重链基因进行测序的技术是本领域技术人员熟知的，从而可得知单克隆抗体重链基因的基因序列。
在得知了所述抗体重链可变区的基因序列后，可将测序得到的序列与一些已知的抗体重链序列(如一些被记载在GenBank中的抗体重链序列)进行比对，确定其前导肽及可变区的编码序列。
在得知了所述抗体重链可变区的基因序列后，可将基因序列进行翻译获得抗体重链可变区的氨基酸序列，并区分可变区的CDR区与FR区。这是本领域技术人员熟知的。
试剂盒
本发明还提供了一种扩增单克隆抗体重链基因的试剂盒，所述的试剂盒中含有SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示序列的引物。
较佳的，所述的试剂盒中还含有多聚M引物。
较佳的，所述试剂盒中还含有其它对于PCR扩增，RNA提取，同聚物加尾等有用的试剂。
较佳的，所述试剂盒中还含有使用说明书，以指导试剂盒的使用。
本发明具有以下主要优点：
(1)针对性强；本发明人在分析和总结了大量的单克隆抗体基因的序列特性的基础上设计了可有效扩增单克隆抗体重链可变区的引物，特异性强。
(2)与采用简并引物的PCR方法相比较，本发明的方法可以得到抗体重链信号肽和可变区的真实序列，不会造成由于引物简并性带来的氨基酸的突变；并且，本发明的引物及方法对多种常用亚型的抗体均适用，而简并引物并不是对所有抗体均有效。
(3)操作简单；本发明方法的整个过程中即使不对RNA、cDNA以及dG-tailed cDNA进行纯化，也可获得良好的扩增效果，从而简化了操作流程，缩短了操作周期。
(4)成本低廉，本发明方法的整个操作对实验条件要求不高，易于实现，并且不需要购置昂贵的RNA抽提或纯化试剂盒，大大降低了成本。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例18株单克隆抗体的重链前导序列及可变区序列的扩增
选取8株单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别为：
1.N-57-19(anti-VSV-G)
来源于上海中科英沐生物科技有限公司，商品号为M006；抗体属于IgG1/Kappa亚型；
2.N-34-12(anti-IA-2)
来源于上海中科英沐生物科技有限公司，商品号为M013；抗体属于IgG1/Kappa亚型；
3.S-42-27(anti-BHLHB3-BSA)
来源于上海中科英沐生物科技有限公司，商品号为M011；抗体属于IgG1/Kappa亚型；
4.23-7(anti-EGFR/-)
来源于上海中科英沐生物科技有限公司，商品号为M008；抗体属于IgG1/Kappa亚型；
5.S-19-9(anti-BHLHB3-BSA)
来源于上海生命科学研究院抗体研究中心；抗体属于IgG2a/Kappa亚型；
6.S-200-23(anti-NP)
保藏号CCTCC-C200812；抗体属于IgG1/Kappa亚型；
7.S-44-10(anti-PSA)
保藏号CCTCC-C200622；抗体属于IgG1/Kappa亚型；
8.S-29-3(anti-e-Ag)
保藏号CCTCC-C200516；抗体属于IgG1/Kappa亚型。
抗体的重链前导序列及可变区序列的扩增的具体操作步骤如下：
(1)收集细胞
用完全培养基将生长状态良好的杂交瘤细胞，约5-10×10⁶，吹打至悬浮，并收集至50ml离心管中，1200rpm离心3min，再用1×PBS洗涤两次，1200rpm离心3min后彻底去掉上清。
(2)总RNA抽提
前述收集的细胞用1ml Sigma公司的Tri Reagent试剂裂解，充分混匀，室温放置5min。加入200μl氯仿剧烈摇匀，室温5min，冰上放置5min。4℃下12000rpm离心15min。取水相(500μl以上)加入等体积异丙醇，立即上下颠倒5-10次混匀，室温5min，冰上放置5min。4℃下12000rpm离心15min，倾倒除去上清，并用枪吸干，加入1ml 75％乙醇，用枪吹打均匀，4℃下7500rpm离心5min，去上清。风干2-3min，加入50μlDEPC-H₂O混匀，检测OD值及浓度。
(3)合成eDNA第一条链
将以下试剂按顺序加入0.5ml微量离心管中：
RNA样品                    (2μg总量RNA)；
SEQ ID NO：1引物(20μM)             1μl；
DEPC-H₂O                       至18.5μl；
混匀并将溶液离心至管底，置于70℃水浴10min，封口膜封口，之后快速冰浴2-3min，加入以下试剂：
5×第一条链合成缓冲液    8μl；
DTT(0.1M)                4μl；
dNTP(10mM)               8μl；
RNAse抑制剂            0.5μl；
M-MLV反转录酶            1μl；
总计                    40μl；
混均，短暂离心后置于37℃水浴，反应90min后，95℃水浴5min(封口膜封口)，冰浴2-3min后反应完成，获得含有cDNA的反转录产物。
(4)在eDNA末端加polyG尾
在一个0.5ml的微量离心管中依次加入以下组分：
5×反应缓冲液            4μl；
含有cDNA的反转录产物     4μl；
dGTP(100mM)              1μl；
TdT             1.5μl；
DEPC-H₂O        9.5μl；
合计             20μl；
混匀，短暂离心后将反应管置于37℃水浴反应15min，再置于70℃作用10min终止反应，获得含有dG-tailed cDNA的产物，置于冰上备用。
(5)以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3为引物，进行PCR
在一个PCR薄壁管中加入以下组分：
灭菌dd H₂O                           19μl；
2×pfu PCR MasterMix(Tiangen公司)    25μl；
引物1(SEQ ID NO：2)                   2μl；
引物2(SEQ ID NO：3)                   2μl；
含有dG-tailed cDNA的产物              2μl；
合计                                 50μl；
94℃反应5min，之后开始循环，94℃1min，63℃1min，72℃1min，共33个循环后72℃10min，4℃反应5min。
(6)PCR产物电泳纯化
PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，将约500bp处的特异性条带割胶，采用上海申能博彩琼脂糖DNA快速纯化试剂盒回收：
①紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，计算凝胶重量；
②每100mg胶加500μl的SN solution(试剂盒自带)，于55-65℃加热，间断混合，直至凝胶块完全融化(约6-8min)；
③每500μl的SN solution加入50μl的solution B(试剂盒自带)，混匀；
④把混合液加入3S柱(DNA收集柱)，室温放置2分钟后，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体；
⑤向3S柱中加入600μl洗涤液，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体；
⑥重复⑤；
⑦10000rpm离心2min，倒掉收集管中的液体；
⑧将3S柱置于干净的1.5ml的EP管中，在3S柱的膜中央加入30μl 55-65C预热的TE液，放置2min，10000rpm离心1分钟。
(7)使用Promega公司的pGEM-T试剂盒，将PCR产物克隆到pGEM-T载体，转化大肠杆菌感受态DH5α
①加A尾：
在一个0.5ml的微量离心管中，加入以下组分：
纯化后PCR产物        6.1μl；
dATP(1mM)              2μl；
10×Taq缓冲液          1μl；
MgCl₂                0.6μl；
Taq酶                0.3μl；
混均，短暂离心后置于70C水浴反应15-30min；
②连接pGEM-T载体
在一个0.5ml的微量离心管中，加入以下组分：
2×连接缓冲液         5μl；
pGEM-T easy         0.5μl；
纯化后PCR产物       3.5μl；
T4DNA连接酶           1μl；
混均后4℃连接16小时以上。
③转化大肠杆菌感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素和IPTG、X-GAL的LB平板上，37C培养12小时左右。
④质粒转化菌落的验证：挑取至少5个白色克隆于含有氨苄青霉素的LB培养基的灭菌试管中37C摇床培养10-12小时。并以两对引物：基因特异引物SEQID NO：2和SEQ ID NO：3与T载体特异引物进行PCR验证。
(8)测序
测定所克隆的PCR产物的碱基序列：选取至少5个PCR验证双阳性的克隆测序，测定其所含的PCR产物的碱基序列。
(9)将测序得到的序列与NCBI的GenBank中的已知序列进行比对，确定其前导肽编码序列及可变区的编码序列，并通过NCBI的IgBlast区分可变区的CDR区与FR区。
最终获得这8株单克隆抗体的可变区及前导肽的真实序列，分别如下：
N-57-19(anti-VSV-G)
前导序列(信号肽核苷酸序列)(SEQ ID NO：4)：
ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTTGTCCTTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGT
重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：5；下划线依次是CDR1，CDR2和CDR3)：
GATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACT
CTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGC
TCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTAGTGGCAGTAGTACCCTCCAC
TATGCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATCCCAAGAACACCC
TGTTCCTGCAAATGAAACTACCCTCACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCA
GTCACCGTCTCCTCAGC
N-34-12(anti-IA-2)
前导序列(信号肽核苷酸序列)(SEQ ID NO：6)：
ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGCCCTCATTTTAAAAGGTGTCCAGTGT
重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：7；下划线依次是CDR1，CDR2和CDR3)：
GATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAA
CTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCC
AGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAGAGATGGTTTTGA
TTCCTACTATCCAGACAGTGTGAGGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCC
AAGAACACCCTATACCTGCAATTGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTAT
TACTGTACAAGACATGGGGTACACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCACTC
TCACAGTCTCCTCA
S-42-27(anti-BHLHB3-BSA)
前导序列(信号肽核苷酸序列)(SEQ ID NO：8)：
ATGGAATGGAGTTGGATATTTCTCTTTCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCT
重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：9；下划线依次是CDR1，CDR2和CDR3)：
GAGGTCCAGCTGGAGCAGTCCGGACCTGAGCTGGGAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAA
GATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGATTGTTATATACACTGGGTGAA
GCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGACACATTGATCCTTACAATGATA
ACATTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTTAGACAAATC
CTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAAGACTCTGCGGTCTA
TTACTGTGCAAGATCAGGGTTCGCCCCTAAGGACTACTGGGGTCAAGGAACGTCA
GTCACCGTCTCCTCA
23-7(anti-EGFR/-)
前导序列(信号肽核苷酸序列)(SEQ ID NO：10)：
ATGTACTTGGGACTGAACTATGTATTCATAGTTTTTCTCTTAAATGGTGTCCAGAGT
重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：11；下划线依次是CDR1，CDR2和CDR3)：
GAAGTGAAGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAAC
TCTCTTGTGCTGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGCCAG
TCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGAAGCAAAGCTAATAATCATG
CAACATACTATGCTGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAA
AAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACT
GTACCACTTATAGGGACTGGGGGCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
S-19-9(anti-BHLHB3-BSA)
前导序列(信号肽核苷酸序列)(SEQ ID NO：12)：
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCC
重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：13；下划线依次是CDR1，CDR2和CDR3)：
CAGGTCCAATTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGC
TGTCCTGCTTGGCTTCTGGCTACACCTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCA
GAGGCCTGGACAAGGCCTTGAATGGATTGGTATGATTGATCCTTTAGACAGTGAGAC
TCACTACAATCAAATATTCGAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCTTCCAG
CACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTG
TAAAGGGAGGTGGCAATAATTCCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTC
AGTCACCGTCTCCTCA
S-200-23(anti-NP)
前导序列(信号肽核苷酸序列)(SEQ ID NO：14)：
ATGGGATGGAGCTATATCATCCTCTTTTTGGTAGCAACAGCAACAGGTGTCCACTCC
重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：15；下划线依次是CDR1，CDR2和CDR3)：
CAGGTCCAACTGCAGCAGTCTGGGACTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGT
TGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTATATGTACTGGGTGAAACA
GAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTTGATTGGAGAGATTGATCCTAGCAATGGTGGTA
CTAACTTCAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCA
GCACATCATACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGT
TCAAGATCCCGCTTCTATGATGGTTACCGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAG
GGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
S-44-10(anti-PSA)
前导序列(信号肽核苷酸序列)(SEQ ID NO：16)：
ATGGAAAGACACTGGATCTTTCTCTTCCTGTTTTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCC
重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：17；下划线依次是CDR1，CDR2和CDR3)：
CAGGTCCAGCTTCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGAT
GTCCTGCAAGCCTTCTGGCTACTCCTTTACTAATTACTGGATGCACTGGATAAAACAGA
GGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTGGCACTGTCTATAGTGA
ATACAATGAGAAATTTAAGAACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAGTCCTCCAACACA
GCCTACATGCAACTGAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCCTCG
GGGGGCAACCCATTTTCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
S-29-3(anti-e-Ag)
前导序列(信号肽核苷酸序列)(SEQ ID NO：18)：
ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTTTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCATTGC
重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：19；下划线依次是CDR1，CDR2和CDR3)：
CAGATCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGTTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGA
TATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTGACTACCATATAAACTGGGTGAAGCA
GAAGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGCTTTATCCTGGAAGCGGTAATA
TTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACACATCCTCCA
GCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGTGGACACTGCTGTCTATTTCTGT
ACAAGATCAGGGTGGGACTCATACTATGGTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCT
CAGTCACCGTCTCCTCA
实施例2杂交瘤细胞株N-176-15(anti-SARS Spike protein)的抗体重链前导肽及可变区序列的扩增
杂交瘤细胞株N-176-15是抗SARS Spike蛋白的一株中和性抗体，保藏号为CCTCC-C200507。
采用其它方法测定N-176-15产生的抗体的重链序列：在以往的研究中，在获得单抗重链可变区序列时，尝试了不同文献报道的多条引物，最后找到一条较为适合的引物，进行PCR获得大小约610bp的目的基因条带(参见张秀琴；抗SARS中和性抗体的人源化过程及功能研究；2007年中国科学院研究生院毕业论文)。
应用本发明实施例1的方法和引物，本发明人很方便地测得了N-176-15产生的抗体的重链前导肽及可变区序列。
N-176-15(anti-SARS Spike protein)：
前导序列(信号肽核苷酸序列)(SEQ ID NO：20)：
ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCTCTCT
重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：21；下划线依次是CDR1，CDR2和CDR3)：
GAGGTCCTGTTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGA
TACCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACATGGACTGGGTGAAAC
AGAGACATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAAGAGTGGTGGT
ACTATCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCC
AGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACT
GTGCAAGAACGAGATATGGTACTAGTTATGACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGG
CACCACTCTCACAGTCTCCTCA
将本发明获得的抗体的重链前导肽及可变区序列与前述采用其它引物扩增获得的序列进行比较，结果发现它们的基因序列是一致的。
生物材料保藏
本发明涉及的杂交瘤细胞株S-200-23保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉)，保藏号为CCTCC NO：C200812；保藏日为2008年3月27日。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>扩增抗体重链前导序列及可变区基因序列的方法及其引物
<130>082242
<160>21
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>1
acagggatcc agagttcc                                    18
<210>2
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>2
cagtggatag acagatgggg gtgtcgtttt ggc                   33
<210>3
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>3
cccccccccc ccccc                                                      15
<210>4
<211>57
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>4
atggactcca ggctcaattt agttttcctt gtccttattt taaaaggtgt ccagtgt        57
<210>5
<211>312
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>5
gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc     60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct    120
ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg gcagtagtac cctccactat    180
gcagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc    240
ctgcaaatga aactaccctc actatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac    300
cgtctcctca gc                                                        312
<210>6
<211>57
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>6
atgaacttcg ggctcagctt gattttcctt gccctcattt taaaaggtgt ccagtgt        57
<210>7
<211>351
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>7
gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc     60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatggca tgtcttgggt tcgccagact    120
ccagacaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagag atggttttga ttcctactat    180
ccagacagtg tgagggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctatac    240
ctgcaattga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aagacatggg    300
gtacactact ttgactactg gggccagggc accactctca cagtctcctc a             351
<210>8
<211>57
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>8
atggaatgga gttggatatt tctctttctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt ccactct      57
<210>9
<211>351
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>9
gaggtccagc tggagcagtc cggacctgag ctgggaaagc ctggggcttc agtgaagatg   60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact gattgttata tacactgggt gaagcagaag  120
cctgggcagg gccttgagtg gattggacac attgatcctt acaatgataa cattaagtac  180
aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg actttagaca aatcctccag cacagcctac  240
atggagctca gcagcctgac ctctgaagac tctgcggtct attactgtgc aagatcaggg  300
ttcgccccta aggactactg gggtcaagga acgtcagtca ccgtctcctc a           351
<210>10
<211>57
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>10
atgtacttgg gactgaacta tgtattcata gtttttctct taaatggtgt ccagagt      57
<210>11
<211>342
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>11
gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc   60
tcttgtgctg cctctggatt cacttttagt gacgcctgga tggactgggt ccgccagtct  120
ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagaagca aagctaataa tcatgcaaca  180
tactatgctg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt  240
gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta ctgtaccact  300
tatagggact gggggcaagg gactctggtc actgtctctg ca                     342
<210>12
<211>57
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>12
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcc      57
<210>13
<211>360
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>13
caggtccaat tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagctg     60
tcctgcttgg cttctggcta caccttcacc acctactgga tgcactgggt gaagcagagg    120
cctggacaag gccttgaatg gattggtatg attgatcctt tagacagtga gactcactac    180
aatcaaatat tcgaggacaa ggccacattg actgtagaca aatcttccag cacagcctac    240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgt aaagggaggt    300
ggcaataatt cctatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca    360
<210>14
<211>57
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>14
atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag caacaggtgt ccactcc        57
<210>15
<211>366
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>15
caggtccaac tgcagcagtc tgggactgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagttg     60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactata tgtactgggt gaaacagagg    120
cctggacaag gccttgagtt gattggagag attgatccta gcaatggtgg tactaacttc    180
aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacatcatac    240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgttc aagatcccgc    300
ttctatgatg gttaccgggg gtacttcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc    360
tcctca                                                               366
<210>16
<211>57
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>16
atggaaagac actggatctt tctcttcctg ttttcagtaa ctgcaggtgt ccactcc        57
<210>17
<211>348
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>17
caggtccagc ttcagcagtc tggggctgaa ctggcaaaac ctggggcctc agtgaagatg     60
tcctgcaagc cttctggcta ctcctttact aattactgga tgcactggat aaaacagagg    120
cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatcctg gcactgtcta tagtgaatac    180
aatgagaaat ttaagaacaa ggccacattg actgcagaca agtcctccaa cacagcctac    240
atgcaactga acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc ctcggggggc    300
aacccatttt cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca                 348
<210>18
<211>57
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>18
atgggatgga gctggatctt tcttttcctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt ccattgc        57
<210>19
<211>360
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>19
cagatccagc tgcagcagtc tggacctgag ttggtgaagc ctggggcttc agtgaagata     60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcact gactaccata taaactgggt gaagcagaag    120
cctggacagg gacttgagtg gattggatgg ctttatcctg gaagcggtaa tattaagtac    180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca catcctccag cacagcctac    240
atgcagctca gcagcctgac atctgtggac actgctgtct atttctgtac aagatcaggg    300
tgggactcat actatggtat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca    360
<210>20
<211>57
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>20
atgggatgga gctggatctt tctcttcttc ctgtcaggaa ctgcaggtgt cctctct        57
<210>21
<211>363
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>21
gaggtcctgt tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata     60
ccctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca tggactgggt gaaacagaga    120
catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta agagtggtgg tactatctac    180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac    240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aagaacgaga    300
tatggtacta gttatgacta ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc    360
tca                                                                  363