一种用AFLP指纹技术鉴定青菜品种的方法 所属技术领域
本发明涉及AFLP指纹技术鉴定青菜品种的方法。
背景技术
传统的青菜品种鉴定方法主要是对植株形态进行观察，但由于大部分青菜品种苗期相似，要到成株才开始表现品种的特性，所以从植株形态对青菜品种进行鉴定往往需要几个月的时间。
AFLP技术是一项分子标记技术，是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可做为一种分子标记。AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段，它是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术。近年来，随着该技术的逐渐成熟，在品种鉴定及辅助育种上得到了具体的应用。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种利用AFLP指纹技术鉴定青菜品种的方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
(1)基因池DNA的来源
从不同青菜品种的叶片提取DNA，混合成品种的基因池。提取及纯化方法采用CTAB法，其过程为：取0.1g青菜叶片，液氮下研磨成粉末；加入750μl CTAB提取液后转入1.5ml离心管中；然后65℃水浴30min，其间震荡混匀；分别用等体积的Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液和等体积的氯仿、异戊醇混合溶液各提取一次，于常温下在12000r/min条件下离心2次，每次10min；取上清夜加入2倍的预冷的无水乙醇沉淀DNA，于4℃条件下离心15min；离心转速为12000r/min，离心后用70％乙醇清洗沉淀2～3次；加入双蒸水溶解DNA，经DNA纯度检测证实纯化度，存于-20℃冰箱中备用。
(2)AFLP接头和预扩增、选扩增引物序列设计
接头的碱基序列：
EcoR I接头 5′＞CTCGTAGACTGCGTACC
CTGACGCATGGTTAA＜5′
Mse I接头 5′＞GACGATGAGTCCTGAG
TACTCAGGACTCAT＜5′
预扩增引物
EcoR I预扩引物序列：5’＞GAC TGC GTA CCA ATT CA＜3’
Mse I预扩引物序列：5’＞GAT GAG TCC TGA GTA AC＜3’
选扩增引物
Mse I扩增引物用FAM标记
Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA C/MseI-3：GAT GAG TCC TGA GTA ACA G
Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/MseI-2：GAT GAG TCC TGA GTA ACA C
Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/MseI-6：GAT GAG TCC TGA GTA ACT C
Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/MseI-8：GAT GAG TCC TGA GTA ACT T
Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAC A/MseI-5：GAT GAG TCC TGA GTA ACT A
(3)AFLP反应条件
A、酶切和连接 限制性酶切及连接(20ul反应体系)，在0.5ml离心管中加入对照模板DNA4μl(50ng/μl)，Adapter 1μl(Mse I接头50pmoles/μL，EcoR I接头5pmoles/μL)，EcoRI/MseI 2μl(4u/μl每种)，10×Reaction buffer 2.5μl，10mM ATP 2.5μl，T4 Ligase 1μl(3u/μl)，AFLP-Water 7μl，混匀离心数秒，37℃保温5h，8℃保温4h，4℃10h；
B、预扩增 在0.2ml离心管中按下列方式加入(25ul反应体系)：模板DNA 2μl，预扩引物1μl(50ng/μl每种)，dNTPs 1μl(10mM)，10×PCR buffer 2.5μl，Taq DNA polymease 0.5μl(2u/μl)，水18μl，离心数秒，按下列参数进行PCR扩增循环30轮：变性94℃2min，(变性94℃30s，复性56℃30s，延伸72℃80s.)延伸72℃5min；
C、选择性扩增：将预扩产物1∶20稀释，作为选扩模板。选择性扩增体系：在0.2ml离心管中，按下列方式加入体积(25μl体系)：预扩增稀释样品2μl，10×PCR buffer 2.5μl，dNTPS0.5μl(10mM)，EcoRI引物1μl(5ng/μl)，Mse I引物1μl(30ng/μl)，Taq酶0.5μl(2u/μl)，H2O 17.5μl，以上混匀，离心数秒，按下列参数PCR循环：1轮扩增参数：94℃30s，65℃30s，72℃80s，以后每轮循环温度递减0.7℃，扩增12轮，接着按下列参数扩增23轮94℃30s，55℃30s，72℃80s；
D、扩增产物的聚丙烯酰胺电泳预电泳20-30min，点样，电泳2.5h(电压1200V)，电泳大约1小时，小片段会先跑到胶的底部，测序仪激光管开始收集条带，胶图由测序仪软件自动生成。
(4)AFLP图谱分析及标准的DNA指纹图谱的构建
A、GENESCAN软件分析：用GENESCAN3.1软件打开胶图，对胶图进行数据提取，安装胶图的MATRIX，选择合适的内标即SIZE STANDARD，分析得到结果；
B、通过Binthere软件提取样品的各片段大小的结果，打开Binthere软件，导入数据，选择相应的荧光标记的颜色并选择合适的内标即SIZI STANDARD，点击分析，导出结果并将结果保存为XLS格式；
C、EXCEL转换 将表内的数值不为0转换为1，数值为0的不转换，从而生成由“0”和“1”组成的原始矩阵；
D、EXCEL转换生成的0，1矩阵图，构建标准的青菜DNA指纹图谱；
(5)青菜品种的鉴定
将待测青菜样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。
以上述AFLP扩增的结果为依据，构建青菜不同品种的标准DNA指纹图谱。
本发明与背景技术相比，构建了一个客观、科学、准确的青菜品种鉴定技术体系，特别是以标准样品的0，1矩阵图构建标准的青菜DNA指纹图谱，克服以往用电泳图直接比较可能产生的误差。该发明为保护青菜育种产权、新品种登录、鉴定品种的真实性和纯度提供技术保障。
【附图说明】
图1是引物Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA C/MseI-3：GAT GAG TCC TGA GTAACA G扩增的10个青菜品种AFLP电泳图谱
图2是引物Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA C/MseI-3：GAT GAG TCC TGA GTAACA G扩增的10个青菜品种AFLP的0，1矩阵指纹图谱
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
(1)基因池DNA的来源
分别从抗热605、矮抗青、特矮青、黑油冬儿、早油冬儿、迟油冬儿、苏州青、矮萁苏州青、黑叶五月慢、五月慢10个不同青菜品种的叶片提取DNA，混合成品种的基因池。提取及纯化方法采用CTAB法，其过程为：取0.1g青菜叶片，液氮下研磨成粉末；加入750μl CTAB提取液后转入1.5ml离心管中；然后65℃水浴30min，其间震荡混匀；分别用等体积的Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液和等体积的氯仿、异戊醇混合溶液各提取一次，于常温下在12000r/min条件下离心2次，每次10min；取上清夜加入2倍的预冷的无水乙醇沉淀DNA，于4℃条件下离心15min；离心转速为12000r/min，离心后用70％乙醇清洗沉淀2～3次；加入双蒸水溶解DNA，经DNA纯度检测证实纯化度，存于-20℃冰箱中备用。
(2)AFLP接头和预扩增、选扩增引物序列设计
接头的碱基序列：
EcoR I接头 5′＞CTCGTAGACTGCGTACC
CTGACGCATGGTTAA＜5′
Mse I接头 5′＞GACGATGAGTCCTGAG
TACTCAGGACTCAT＜5′
预扩增引物
EcoR I预扩引物序列： 5’＞GAC TGC GTA CCA ATT CA＜3’
Mse I预扩引物序列： 5’＞GAT GAG TCC TGA GTA AC＜3’
选扩增引物
Mse I扩增引物用FAM标记
Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA C/MseI-3：GAT GAG TCC TGA GTA ACA G
(3)AFLP反应条件
A、酶切和连接限制性酶切及连接(20ul反应体系)，在0.5ml离心管中加入对照模板DNA4μl(50ng/μl)，Adapter 1μl(Mse I接头50 pmoles/μL，EcoR I接头5 pmoles/μL)，EcoRI/MseI 2μl(4u/μl每种)，10×Reaction buffer 2.5μl，10mM ATP 2.5μl，T4 Ligase 1μl(3u/μl)，AFLP-Water 7μl，混匀离心数秒，37℃保温5h，8℃保温4h，4℃ 10h；
B、预扩增在0.2ml离心管中按下列方式加入(25ul反应体系)：模板DNA 2μl，预扩引物1μl(50ng/μl每种)，dNTPs 1μl(10mM)，10×PCR buffer 2.5μl，Taq DNA polymease 0.5μl(2u/μl)，水18μl，离心数秒，按下列参数进行PCR扩增循环30轮：变性94℃ 2min，(变性94℃ 30s，复性56℃ 30s，延伸72℃ 80s.)延伸72℃ 5min；
C、选择性扩增：将预扩产物1∶20稀释，作为选扩模板。选择性扩增体系：在0.2ml离心管中，按下列方式加入体积(25μl体系)：预扩增稀释样品2μl，10×PCR buffer 2.5μl，dNTPS0.5μl(10mM)，EcoRI引物斗1(5ng/μl)，Mse I引物1μl(30ng/μl)，Taq 酶0.5μl(2u/μl)，H2O 17.5μl，以上混匀，离心数秒，按下列参数PCR循环：1轮扩增参数：94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 80s，以后每轮循环温度递减0.7℃，扩增12轮，接着按下列参数扩增23轮94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 80s；
D、扩增产物的聚丙烯酰胺电泳预电泳20-30min，点样，电泳2.5h(电压1200V)，电泳大约1小时，小片段会先跑到胶的底部，测序仪激光管开始收集条带，胶图由测序仪软件自动生成。
(4)AFLP图谱分析及标准地DNA指纹图谱的构建
A、GENESCAN软件分析：用GENESCAN3.1软件打开胶图，对胶图进行数据提取，安装胶图的MATRIX，选择合适的内标即SIZE STANDARD，分析得到结果；
B、通过Binthere软件提取样品的各片段大小的结果，打开Binthere软件，导入数据，选择相应的荧光标记的颜色并选择合适的内标即SIZI STANDARD，点击分析，导出结果并将结果保存为XLS格式；
C、EXCEL转换 将表内的数值不为0转换为1，数值为0的不转换，从而生成由“0”和“1”组成的原始矩阵；
D、EXCEL转换生成的0，1矩阵图，构建标准的青菜DNA指纹图谱；
(5)青菜品种的鉴定
将待测青菜样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。
实施例2
(1)基因池DNA的来源
分别从抗热605、矮抗青、特矮青、黑油冬儿、早油冬儿、迟油冬儿、苏州青、矮萁苏州青、黑叶五月慢、五月慢10个不同青菜品种的叶片提取DNA，混合成品种的基因池。提取及纯化方法采用CTAB法，其过程为：取0.1g青菜叶片，液氮下研磨成粉末；加入750μl CTAB提取液后转入1.5ml离心管中；然后65℃水浴30min，其间震荡混匀；分别用等体积的Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液和等体积的氯仿、异戊醇混合溶液各提取一次，于常温下在12000r/min条件下离心2次，每次10min；取上清夜加入2倍的预冷的无水乙醇沉淀DNA，于4℃条件下离心15min；离心转速为12000r/min，离心后用70％乙醇清洗沉淀2～3次；加入双蒸水溶解DNA，经DNA纯度检测证实纯化度，存于-20℃冰箱中备用。
(2)AFLP接头和预扩增、选扩增引物序列设计
接头的碱基序列：
EcoR I接头 5′＞CTCGTAGACTGCGTACC
CTGACGCATGGTTAA＜5′
Mse I接头 5′＞GACGATGAGTCCTGAG
TACTCAGGACTCAT＜5′
预扩增引物
EcoR I预扩引物序列：5’＞GAC TGC GTA CCA ATT CA＜3’
Mse I预扩引物序列：5’＞GAT GAG TCC TGA GTA AC＜3’
选扩增引物
Mse I扩增引物用FAM标记
Primer E GAC TGC GTA CCAATT CAA G/MseI-2：GAT GAG TCC TGA GTA ACA C
(3)AFLP反应条件
A、酶切和连接 限制性酶切及连接(20ul反应体系)，在0.5ml离心管中加入对照模板DNA4μl(50ng/μl)，Adapter 1μl(Mse I接头50pmoles/μL，EcoR I接头5pmoles/μL)，EcoRI/MseI 2μl(4u/μl每种)，10×Reaction buffer 2.5μl，10mM ATP 2.5μl，T4 Ligase 1μl(3u/μl)，AFLP-Water 7μl，混匀离心数秒，37℃保温5h，8℃保温4h，4℃10h；
B、预扩增 在0.2ml离心管中按下列方式加入(25ul反应体系)：模板DNA 2μl，预扩引物1μl(50ng/μl每种)，dNTPs 1μl(10mM)，10×PCR buffer 2.5μl，Taq DNA polymease 0.5μl(2u/μl)，水18μl，离心数秒，按下列参数进行PCR扩增循环30轮：变性94℃2min，(变性94℃30s，复性56℃30s，延伸72℃80s.)延伸72℃5min；
C、选择性扩增：将预扩产物1∶20稀释，作为选扩模板。选择性扩增体系：在0.2ml离心管中，按下列方式加入体积(25μl体系)：预扩增稀释样品2μl，10×PCR buffer 2.5μl，dNTPS0.5μl(10mM)，EcoRI引物1μl(5ng/μl)，Mse I引物1μl(30ng/μl)，Taq酶0.5μl(2u/μl)，H2O 17.5μl，以上混匀，离心数秒，按下列参数PCR循环：1轮扩增参数：94℃30s，65℃30s，72℃80s，以后每轮循环温度递减0.7℃，扩增12轮，接着按下列参数扩增23轮94℃30s，55℃30s，72℃80s；
D、扩增产物的聚丙烯酰胺电泳预电泳20-30min，点样，电泳2.5h(电压1200V)，电泳大约1小时，小片段会先跑到胶的底部，测序仪激光管开始收集条带，胶图由测序仪软件自动生成。
(4)AFLP图谱分析及标准的DNA指纹图谱的构建
A、GENESCAN软件分析：用GENESCAN3.1软件打开胶图，对胶图进行数据提取，安装胶图的MATRIX，选择合适的内标即SIZE STANDARD，分析得到结果；
B、通过Binthere软件提取样品的各片段大小的结果，打开Binthere软件，导入数据，选择相应的荧光标记的颜色并选择合适的内标即SIZI STANDARD，点击分析，导出结果并将结果保存为XLS格式；
C、EXCEL转换 将表内的数值不为0转换为1，数值为0的不转换，从而生成由“0”和“1”组成的原始矩阵；
D、EXCEL转换生成的0，1矩阵图，构建标准的青菜DNA指纹图谱；
(5)青菜品种的鉴定
将待测青菜样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。
实施例3
(1)基因池DNA的来源
分别从抗热605、矮抗青、特矮青、黑油冬儿、早油冬儿、迟油冬儿、苏州青、矮萁苏州青、黑叶五月慢、五月慢10个不同青菜品种的叶片提取DNA，混合成品种的基因池。提取及纯化方法采用CTAB法，其过程为：取0.1g青菜叶片，液氮下研磨成粉末；加入750μl CTAB提取液后转入1.5ml离心管中；然后65℃水浴30min，其间震荡混匀；分别用等体积的Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液和等体积的氯仿、异戊醇混合溶液各提取一次，于常温下在12000r/min条件下离心2次，每次10min；取上清夜加入2倍的预冷的无水乙醇沉淀DNA，于4℃条件下离心15min；离心转速为12000r/min，离心后用70％乙醇清洗沉淀2～3次；加入双蒸水溶解DNA，经DNA纯度检测证实纯化度，存于-20℃冰箱中备用。
(2)AFLP接头和预扩增、选扩增引物序列设计
接头的碱基序列：
EcoR I接头 5′＞CTCGTAGACTGCGTACC
CTGACGCATGGTTAA＜5′
Mse I接头 5′＞GACGATGAGTCCTGAG
TACTCAGGACTCAT＜5′
预扩增引物
EcoR I预扩引物序列：5’＞GAC TGC GTA CCA ATT CA＜3’
Mse I预扩引物序列：5’＞GAT GAG TCC TGA GTA AC＜3’
选扩增引物
Mse I扩增引物用FAM标记
Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/MseI-6：GAT GAG TCC TGA GTA ACT C
(3)AFLP反应条件
A、酶切和连接 限制性酶切及连接(20ul反应体系)，在0.5ml离心管中加入对照模板DNA4μl(50ng/μl)，Adapter 1μl(Mse I接头50pmoles/μL，EcoR I接头5pmoles/μL)，EcoRI/MseI 2μl(4u/μl每种)，10×Reaction buffer 2.5μl，10mM ATP 2.5μl，T4 Ligase 1μl(3u/μl)，AFLP-Water 7μl，混匀离心数秒，37℃保温5h，8℃保温4h，4℃10h；
B、预扩增 在0.2ml离心管中按下列方式加入(25ul反应体系)：模板DNA2μl，预扩引物1μl(50ng/μl每种)，dNTPs 1μl(10mM)，10×PCR buffer 2.5μl，Taq DNA polymease 0.5μl(2u/μl)，水18μl，离心数秒，按下列参数进行PCR扩增循环30轮：变性94℃2min，(变性94℃30s，复性56℃30s，延伸72℃80s.)延伸72℃5min；
C、选择性扩增：将预扩产物1∶20稀释，作为选扩模板。选择性扩增体系：在0.2ml离心管中，按下列方式加入体积(25μl体系)：预扩增稀释样品2μl，10×PCR buffer 2.5μl，dNTPS0.5μl(10mM)，EcoRI引物1μl(5ng/μl)，Mse I引物1μl(30ng/μl)，Taq酶0.5μl(2u/μl)，H2O 17.5μl，以上混匀，离心数秒，按下列参数PCR循环：1轮扩增参数：94℃30s，65℃30s，72℃80s，以后每轮循环温度递减0.7℃，扩增12轮，接着按下列参数扩增23轮94℃30s，55℃30s，72℃80s；
D、扩增产物的聚丙烯酰胺电泳预电泳20-30min，点样，电泳2.5h(电压1200V)，电泳大约1小时，小片段会先跑到胶的底部，测序仪激光管开始收集条带，胶图由测序仪软件自动生成。
(4)AFLP图谱分析及标准的DNA指纹图谱的构建
A、GENESCAN软件分析：用GENESCAN3.1软件打开胶图，对胶图进行数据提取，安装胶图的MATRIX，选择合适的内标即SIZE STANDARD，分析得到结果；
B、通过Binthere软件提取样品的各片段大小的结果，打开Binthere软件，导入数据，选择相应的荧光标记的颜色并选择合适的内标即SIZI STANDARD，点击分析，导出结果并将结果保存为XLS格式；
C、EXCEL转换 将表内的数值不为0转换为1，数值为0的不转换，从而生成由“0”和“1”组成的原始矩阵；
D、EXCEL转换生成的0，1矩阵图，构建标准的青菜DNA指纹图谱；
(5)青菜品种的鉴定
将待测青菜样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。