用于诊断和治疗癌症的组合物和方法
技术领域
本发明涉及肿瘤学领域并提供了用于诊断和治疗癌症的新型组合物和方法。本发明提供了抗癌干细胞标记物的用于诊断和治疗实体瘤的抗体。
背景技术
在发达世界中癌症是死亡的主要原因之一，仅在美国，每年就有超过一百万人被诊断为癌症患者，并且有500,000人死亡。总体而言，据估计在3人当中就有不止1人会在他们的一生当中患上某种形式的癌症。癌症有超过200种不同的类型，其中的四种-乳癌、肺癌、结肠直肠癌和前列腺癌-占超过所有新发病例的一半(Jemal等，2003，Cancer J.Clin.53：5～26)。
乳癌是女性中最常见的癌症，据估计，有12％的女性在她们的一生中有患上该疾病的风险。尽管由于检查的提早和治疗的改善，死亡率已得到降低，但是乳癌仍然是中年女性死亡的主要原因，并且转移性乳癌依然是不可治愈的疾病。大部分患有转移性乳癌的患者在显现时只有一个或两个器官系统受到影响，但是随着疾病的发展，常常会使多个部位受累。转移受累的最常见部位是胸腔壁的皮肤和软组织以及腋窝和锁骨上区域中的局部复发。远端转移的最常见的部位是骨(远端转移的30％～40％)，其次是肺和肝。而且，尽管只有约1％～5％的新诊断患有乳癌的女性在诊断时具有远端转移，但是约有50％的患有局部疾病的患者最终在5年内都出现转移复发。目前，远端转移显现的中位存活期约为3年。
目前对乳癌进行诊断和分期的方法包括肿瘤结节转移(TNM)体系，该体系依赖于肿瘤尺寸、淋巴结中肿瘤的存在和远端转移的存在(American Joint Committee on Cancer：AJCC Cancer Staging Manual.Philadelphia，Pa.：Lippincott-Raven Publishers，第5版，1997，第171～180页；Harris，J R：“Staging of breast carcinoma”于Harris，J.R.，Hellman，S.，Henderson，I.C.，Kinne D.W.(编)：Breast Diseases.Philadelphia，Lippincott，1991)。这些参数用以提供预后和选择适当的疗法。还可以对肿瘤的形态外观进行评价，但是由于具有相似的组织病理学外观的肿瘤能够表现出明显的临床变化性，因此这种方法具有严重的局限性。最后，可使用细胞表面标记物的测定来将某些肿瘤类型分为亚类。例如，在乳癌的预后和治疗中所考虑的一个因素是雌激素受体(ER)的存在，因为ER-阳性乳癌通常比ER-阴性肿瘤更容易对诸如三苯氧胺或芳香化酶抑制剂等激素疗法作出应答。这些分析尽管有用，但是只能部分地预测乳腺肿瘤的临床行为，并且在当前诊断工具无法检测并且当前疗法无法治疗的乳癌中还存在大量的表型多样性。
前列腺癌是发达世界的男性中最为常见的癌症，在美国所有新发癌症病例中估计占33％，是频率次高的死亡原因(Jemal等，2003，CA CancerJ.Clin.53：5～26)。由于前列腺特异性抗原(PSA)血液测试的引入，前列腺癌的早期检测显著提高了存活率；诊断时患有局部区域性阶段前列腺癌的患者的5年存活率接近100％。但是仍有超过50％的患者最终将发展为局部晚期疾病或转移性疾病(Muthuramalingam等，2004，Clin.Oncol.16：505～16)。
目前，根治性前列腺切除术和放射疗法为大部分的局部前列腺肿瘤提供了治愈性治疗。然而对于晚期病例，可选择的治疗方案非常有限。对于转移性疾病，单独使用黄体生成素释放激素(LHRH)激动药或者结合使用黄体生成素释放激素(LHRH)激动药与抗雄激素的雄激素阻断是标准治疗。尽管使雄激素得到最大程度的阻断，但是疾病病情几乎总还是发展，大部分发展成雄激素非依赖性疾病。目前对激素难以医治的前列腺癌还没有普遍接受的治疗，并且常用的是化学疗法(Muthuramalingam等，2004，Clin.Oncol.16：505～16；Trojan等，2005，Anticancer Res.25：551～61)。
结肠直肠癌在世界范围内是第3位最常见癌症，并且是第4位频率最高的癌症死亡原因(，Weitz等，2005，Lancet 365：153～65)。所有结肠直肠癌中约有5％～10％是遗传的，其主要形式之一是家族性腺瘤性息肉病(FAP)，该家族性腺瘤性息肉病是常染色体显性疾病，其中有约80％的受影响个体在结肠腺瘤性息肉病(APC)基因中含有种系突变。结肠直肠癌通过周向生长而局部侵入，在其它位置则通过淋巴扩散、血行扩散、跨腹膜扩散和周围神经扩散来侵入。淋巴外受累的最常见部位是肝脏，腹部外器官受影响的频率最高的是肺。血行扩散的其它部位包括骨、肾、肾上腺和脑。
结肠直肠癌的现有分期体系基于肿瘤穿过肠壁的程度以及结节受累的有无。这种分期体系由3个主要的Duke分级来定义：Duke A级疾病限制于结肠或直肠的黏膜下层；Duke B级疾病具有侵入穿过固有肌层并可能穿过结肠或直肠壁的肿瘤；Duke C级疾病包括任何程度的带有区域性淋巴结转移的肠壁侵入。虽然对于早期的结肠直肠癌来说手术切除是非常有效的，在Duke A级患者中提供95％的治愈率，但是在Duke B级患者中该比率下降到75％，在Duke C级疾病中阳性淋巴结的存在预示在5年内复发可能性为60％。以化学疗法的术后疗程对Duke C级患者的治疗可将复发率降低至40％～50％，目前这是这些患者的护理标准。
肺癌是世界上最常见的癌症，在美国是第三大最常诊断到的癌症，是迄今为止频率最高的癌症死亡原因(Spiro等，2002，Am.J.Respir.Crit.Care Med.166：1166～96；Jemal等，2003，CA Cancer J.Clin.53：5～26)。据信，吸烟所造成的肺癌占所有肺癌的比例估计为87％，使得肺癌成为最致命的可预防疾病。肺癌分为两种主要类型：小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，这两种类型肺癌占所有肺癌的比例超过90％。SCLC病例占15％～20％，其特征在于，这类肺癌根源于大的中心气道并且组织学组成是几近没有细胞质的小细胞的片层。SCLC比NSCLC更具有侵袭性，并且生长快、转移早。NSCLC占所有病例的80％～85％，并基于组织学而进一步分为3个主要亚型：腺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)和大细胞未分化癌。
肺癌通常在其病程中显现较晚，因此诊断后只有6～12个月的中位存活期，总5年存活率仅有5％～10％。虽然手术提供了治愈的最好机会，但是只有少部分肺癌患者适合手术，大部分依赖于化学疗法和放射疗法。尽管尝试了控制这些疗法的时机和剂量强度，但是在过去15年中存活率几乎没有提高(Spiro等，2002，Am.J.Respir.Crit.Care Med.166：1166～96)。
这四种癌症以及其它多种癌症表现为由异源性细胞群组成的实体瘤。例如，乳癌是癌细胞和正常细胞(包括间质(基质)细胞、炎性细胞和内皮细胞)的混合体。癌症的数种模型为这种异源性的存在提供了不同的解释。一种模型(癌症的经典模型)认为表型明显不同的癌细胞群都具有增殖和形成新肿瘤的能力。在该经典模型中，肿瘤细胞异源性源自于环境因素以及癌细胞内正在发生的突变，从而形成多样的致癌细胞群。这一模型基于这样的观点，即，肿瘤细胞的所有群体都具有某种程度的致癌潜能(Pandis等，1998，Genes，Chromosomes & Cancer 12：122～129；Kuukasjrvi等，1997，Cancer Res.57：1597～1604；Bonsing等，1993，Cancer 71：382～391；Bonsing等，2000，Genes Chromosomes & Cancer 82：173～183；Beerman H等，1991，Cytometry 12：147～54；Aubele M和Werner M，1999，Analyt.Cell.Path.19：53；Shen L等，2000，CancerRes.60：3884)。
所观测到的实体瘤细胞异源性的一种替代性模型源自于干细胞对肿瘤发展的影响。根据该模型，癌症起因于控制正常组织发育和维持的机制的失调(Beachy等，2004，Nature 432：324)。在正常的动物发育过程中，绝大部分或所有组织的细胞都来自于正常前体，即所谓的干细胞(Morrison等，1997，Cell 88：287～98；Morrison等，1997，Curr.Opin.Immunol.9：216～21；Morrison等，1995，Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.11：35～71)。干细胞是这样的细胞：(1)具有广泛的增殖能力；(2)能够进行非对称性细胞分裂以生成一种或多种增殖潜力和/或发育潜力下降的子代；和(3)能够进行对称性细胞分裂从而自我再生或自我维持。通过干细胞分化实现成体细胞再生的最佳研究例子是造血体系，其中发育未成熟的前体(造血干细胞和祖细胞)响应分子信号而形成各种血细胞和淋巴样细胞类型。其它细胞(包括内脏、乳管体系和皮肤的细胞)从各自组织的小群体干细胞得到持续的补充，最近研究认为，绝大多数其它成体组织(包括脑)同样存在干细胞。源自于“实体瘤干细胞”(或来自于实体瘤的“癌干细胞”)的肿瘤随后通过对称性和非对称性细胞分裂过程而经历无序的发育。在该干细胞模型中，实体瘤含有明显不同且有限的(甚至可能是稀有的)具有正常“干细胞”性质的细胞亚组，原因在于它们广泛增殖并有效地形成另外的实体瘤干细胞(自我再生)和形成实体瘤的缺乏致瘤潜能的大部分瘤细胞。实际上，长寿干细胞群中的突变可以引发癌干细胞的形成，所形成的癌干细胞成为肿瘤生长和维持的基础，并且癌干细胞的存在造成当前治疗方法的失败。
癌症的干细胞性首先在血癌(急性髓系白血病(AML))中得到揭示(Lapidot等，1994，Nature 17：645～8)。新近，已证明恶性人类乳腺肿瘤和结肠肿瘤也类似地具有小而明显不同的癌干细胞群，其被富集而能够在免疫缺陷小鼠中形成肿瘤。已发现，在乳腺肿瘤中，ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-细胞群所富集的致瘤性细胞是未分级的肿瘤细胞的50倍(Al-Hajj等，2003，Proc.Nat’l Acad.Sci.100：3983～8)。相似的是，已发现结肠直肠肿瘤中的ESA+、CD44+亚群仅包括致瘤性细胞，而在该亚群(profile)中加入CD166能够进一步富集结肠癌干细胞(CoCSC)(Dalerba等，2007，Proc.Nat’l Acad.Sci.104：10158～63)。有望分离致瘤性癌细胞的能力使得可以研究作为这些细胞中的致瘤性基础的关键生物路径，因此有望为癌症患者研发出更好的诊断测定法和治疗法。这正是本发明所针对的目的。
发明内容
本发明提供了一种抗体，所述抗体特异性结合人类δ样配体4(DLL4)表位，所述表位由人类DLL4N-末端区(SEQ ID NO：27)和人类DSL域(SEQ ID NO：26)组合形成，其中所述抗体影响肿瘤生长。本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本发明所公开的抗体和药用载质(vehicle)。本发明还提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本发明所公开的DLL4抗体。
本发明的其它目标和优势，一部分将在随后说明中给出，一部分根据所述说明是显而易见的，或者通过本发明的实践而习得。本发明的目标和优势将借助所附权利要求书中具体指出的要素和组合来实现和达到。应当理解的是，以上的概述和以下的详述均只是用于例示和解释，而不是用于限制所要求保护的发明。合并在本说明书中并且构成本说明书的一部分的附图示出了本发明的数个实施方式，其与所述说明一起用以解释本发明的原理。在本说明书和所附权利要求书中，单数形式的“一个”、“一种”或“所述”，除非上下文另有明确说明，否则包括复数形式的所指对象。
附图说明
图1：抗DLL4的抗体21M18与天然细胞表面DLL4蛋白的特异性结合。将以全长的DLL4和GFP共转染的HEK 293细胞与抗DLL4的抗体温育并通过FACS分选。如通过DLL4抗体结合与GFP表达之间的线性关系所揭示的，抗DLL4的抗体21M14和21M18显示对表达DLL4的细胞的特异性结合。
图2：DLL4抗体阻断人类DLL4与Notch受体的相互作用。A)在DLL4或对照抗体的存在下将表达DLL4的HEK 293细胞与Notch-Fc或对照Fc蛋白温育。高荧光强度表明，在对照抗体(线2)和抗DLL4的抗体21M12(线5)的存在下出现Notch与DLL4的结合。低荧光强度表明，在不存在Notch(线1)的情况下Notch与DLL4没有相互作用，并且在抗DLL4的抗体21M18(线3)和21M14(线4)的存在下Notch与DLL4相互作用受到破坏。B)将表达Notch 1的HEK 293细胞与人类或鼠类DLL4Fc温育。通过荧光标记的抗Fc抗体检测结合并以FACS分析，高荧光强度表明DLL4与表达Notch 1的细胞之间的结合。21M18阻断了人类DLL4(灰色方块)与Notch受体的结合，但是不阻断鼠类DLL4(黑色圆形)与Notch受体的结合。
图3：抗DLL4的抗体的表位作图。A)将带有人类DLL4的胞外域的嵌套缺失的融合蛋白在ELISA测定中与抗DLL4的抗体21M14和21M18温育。在含氨基酸1～154的融合蛋白的存在下，未能检测到高于背景的结合(aa 1-96，带黑点的白柱；aa 1-154，带白点的黑柱)。相反，可检测到抗DLL4的抗体与含DLL4的氨基酸1～217(包括DSL域)的所有融合蛋白之间的结合(aa 1-217，水平条纹柱；aa 1-251，斜条纹柱；aa 1-283，阴影线柱；aa 1-323，带白点的灰柱)。B)Werstern印迹显示人类DLL4(h-DLL4)C-末端缺失蛋白和鼠类-人类DLL4嵌合融合蛋白(抗hFc；顶部)的表达。DLL4融合蛋白包括域1～6中的一个或多个，其中域1和2是N-末端氨基酸1～154；域3是来自氨基酸155～217的DSL域；域4、5和6各自是C中图示的EGF域。只有存在氨基酸1-217(hDLL4域1-3)，抗体21M18才识别h-DLL4蛋白。与人类蛋白相反，含鼠类DLL4(m-DLL4)氨基酸1-217(域1-3)的融合蛋白不被21M18识别(m-DLL4域1-3：h-DLL4域4-6)。而在鼠类域3的存在下，包含h-DLL4氨基酸1-154(域1-2)的融合蛋白被21M18识别(h-DLL4域1-2：mDLL4域3-6)。C)显示了B的结合数据的概要示意图。顶部显示了DLL4的域结构，左侧列出并示意性显示了DLL4融合蛋白，其中人类蛋白以浅灰色表示，小鼠类蛋白以深灰色表示。以“+”和“-”表示21M18与每种DLL4片段的结合。D)ELISA分析21M18与在选定位置的人类残基被相应鼠类残基取代的DLL4蛋白片段的结合。对在氨基酸位68、69和71(替换缬氨酸、缬氨酸和脯氨酸)或在氨基酸142和144位(替换赖氨酸和丙氨酸)取代的DLL4蛋白片段，21M18显示的结合减弱。E)ELISA分析抗体21M18和21M21与在DSL域内的选定位置的人类残基被相应鼠类残基取代的DLL4蛋白片段的结合。对在氨基酸位161和162(替换苏氨酸和丝氨酸)含有氨基酸取代的人类DLL4蛋白片段，抗体21M21显示受到减弱的结合。在信号转导测定中21M21不影响DLL4的功能(见图6)，这表明不是所有与DSL区结合的抗体都影响DLL4的功能。
图4：重链可变区的序列比对。A)显示了亲本鼠类21M18抗体序列(m-21M18-Vh，顶部)、人类表达框架序列(h-EST-框架，中间)和人源化21M18重链可变区序列(21M18-H7，底部)，保守氨基酸残基标以黑色阴影。所标记的三个CDR显示，人源化21M18抗体中保留有亲本鼠类序列。在21M18H7和21M18H9中，CDR2中卡巴特位(Kabat position)52a的半胱氨酸残基已经被分别改变为丝氨酸和缬氨酸残基而不丧失对DLL4的特异性结合。在4A中所示的框架区内的取代被编号为1-6，对应Vh链中的卡巴特位16、20、27、28、38、48。B)显示了亲本鼠类21M18抗体序列(m-21M18-Vh，顶部)、人类种系Vh序列(h-种系-Vh，中间)和人源化21M18重链可变区序列(21M18-H2，底部)，保守氨基酸残基标以黑色阴影。所标记的三个CDR显示，人源化21M18抗体中保留有亲本鼠类序列。在21M18H7和21M18H9中，CDR2中卡巴特位52a的半胱氨酸残基已经被分别变化为丝氨酸和缬氨酸残基而不丧失对DLL4的特异性结合。将所有重链变体的可变框架区中所保留的五个鼠类残基在它们对应的卡巴特位20、28、38、48和69编号为1～5。
图5：轻链可变区的序列比对。显示了亲本鼠类21M18抗体序列(m-21M18-Vk，顶部)、人类种系序列(h-种系-Vk，底部)和人源化21M18轻链可变区序列(21M18-L2，中间)，保守氨基酸残基标以黑色阴影。所标记的三个CDR显示，人源化抗体21M18中保留有亲本鼠类序列。可变框架区中所保留的两个鼠类残基在它们相应的卡巴特位22和36被编号为1～2。
图6：DLL4抗体阻断Notch信号转导。在存在或不存在抗DLL4的抗体的情况下，将共转染有Hes1-Luc报告基因和Renilla荧光素酶报告基因载体的HeLa细胞与DLL4-Fc蛋白温育。荧光素酶水平降低表明抗体21M14和21M18使DLL4 Notch途径不能活化。
图7：DLL4抗体调节Notch目标基因在结肠肿瘤中的表达。A)对经抗DLL4的抗体21M18或PBS(对照)处理的C8结肠肿瘤进行分离并通过定量RT-PCR测定HES1和ATOH-1的表达。与对照处理的细胞相比的相对基因表达(y轴)表明以抗DLL4的抗体处理降低了HES1的表达并增加了ATOH-1的表达。B)显示了小鼠谱系缺失OMP-C11结肠肿瘤细胞集落中HES1对ATOH1的相对表达比(y轴)。以过表达DLL4的3T3细胞覆盖的C11集落(3T3+DLL4)的HES1/ATOH1表达比高于以3T3细胞覆盖的(3T3)或未经细胞覆盖的(对照)结肠细胞。通过与10μg/mL21M18抗体(21M18)或5μM-分泌酶抑制剂DBZ(5μM GSI)温育可消除这一HES1/ATOH1表达比的增高。
图8：DLL4抗体减缓肿瘤的生长。以解离的UM-C4细胞注射NOD/SCID小鼠，并以抗DLL4的抗体21M18(n＝5)或PBS(n＝10)治疗。与注射PBS的对照(黑色方块)相比，以抗体21M18进行的治疗(菱形)从第23天开始减缓肿瘤的生长，观察到这种减缓在第48天可达54％。
图9：以DLL4抗体治疗减少了体内增殖的肿瘤细胞的数量。对以抗DLL4的抗体21M18或对照Ab(抗体)治疗的C8结肠肿瘤进行分离。用抗Ki67的抗体进行的免疫细胞化学分析表明，与对照相比，在经21M18治疗的肿瘤中，增殖细胞的数量减少。
图10：DLL4抗体与氟尿嘧啶(5-FU)的联合治疗减缓了肿瘤的生长。以解离的UM-C4细胞注射NOD/SCID小鼠，并在存在或不存在5-Fu的情况下以抗DLL4的抗体和/或PBS治疗。A)注射肿瘤细胞后46天，与5-FU(三角，实线)或21M18抗体(菱形，点状线)单独治疗相比、并且与注射PBS的对照(方块，实线)相比，抗体21M18与5-FU的联合治疗(圆形，虚线)更大程度地减缓了肿瘤生长。y轴以mm3标明了肿瘤体积。B)第46天由动物个体获得的肿瘤测量图。每个点代表一只动物。与对照相比，抗体21M18或5-FU的治疗各自减缓了肿瘤大小(mm3)。进而，以抗体21M18与5-FU的联合治疗具有加和效应，将肿瘤大小降低至对照大小的1/5。
图11：DLL4抗体与抗EGFR的抗体的联合治疗减缓了肿瘤的生长。以解离的UM-C4细胞注射NOD/SCDD小鼠，并在存在或不存在抗EGFR的抗体的情况下以抗DLL4的抗体和/或PBS治疗。显示第46天由动物个体获得的肿瘤测量图。每个点代表一只动物。与对照相比，抗体21M18或抗EGFR的抗体的治疗各自减缓了肿瘤大小(mm3)。进而，抗体21M18与抗EGFR的抗体的联合治疗具有加和效应，将肿瘤大小降低至对照大小的1/5。
图12：抗DLL4的mAb(单克隆抗体)21M18与伊立替康协同作用而抑制了结肠肿瘤的生长。以解离的C8细胞注射NOD/SCID小鼠，并在存在或不存在伊立替康的情况下以抗DLL4的抗体和/或对照抗体治疗。A)与对照治疗的动物(黑色方块)相比，以鼠类21M18抗体(圆形)或伊立替康(三角)单独治疗各自减小了肿瘤体积(y轴mm3)。然而，21M18与伊立替康的联合治疗(倒三角)具有协同效应，可在细胞注射后长达55天彻底消除肿瘤生长。B)相比于对照抗体(黑色方块)或对照抗体+伊立替康(三角)，人源化21M18(h21M18)与伊立替康(irtcn)的联合治疗(圆形)具有与鼠类21M18(m21M18)与伊立替康(irtcn)的联合治疗(三角)相似的效率。
图13：抗DLL4的21M18与伊立替康的联合治疗防止了结肠肿瘤的再生长。以解离的C8细胞注射NOD/SCID小鼠，并以伊立替康或者伊立替康与抗DLL4的抗体21M18的联合进行治疗(n＝10，每组)。A)以伊立替康单独治疗减慢了结肠肿瘤生长，但是在第56天(*箭头)停止治疗后，除了两例之外所有的被治疗动物中的肿瘤继续生长。B)相反，伊立替康与抗DLL4的抗体21M18的联合治疗消除了结肠肿瘤的生长，这种消除在所有10只被治疗动物中贯穿治疗过程以及第56天停止治疗之后的5周。每条线代表一只动物个体的生长曲线。
图14：抗DLL4的21M18与伊立替康的联合治疗对已建立的结肠肿瘤的生长的抑制比单独疗法治疗更有效。以解离的C8细胞注射NOD/SCID小鼠，并在存在或不存在伊立替康的情况下以抗DLL4的抗体和/或对照抗体治疗。与对照治疗的动物(黑色方块)相比，单独以21M18抗体(菱形)或伊立替康(三角)治疗各自降低肿瘤体积(y轴，mm3)。然而，21M18加伊立替康的联合治疗(倒三角)对肿瘤生长的抑制比21M18或伊立替康单独治疗更有效。
图15：以抗DLL4的抗体治疗的肿瘤显示致瘤性细胞数量的减少。在图14中所示的实验中，经过对照抗体、伊立替康加对照抗体、单独的抗DLL4的抗体21M18、或抗DLL4的抗体21M18和伊立替康的联合(联合)治疗后，以递减剂量的肿瘤细胞来注射免疫低下小鼠(n＝10，每组)。A)在第81天肿瘤成活比率的结果。将每一治疗组的肿瘤体积(mm3)对所注射的人类肿瘤细胞的数量：900、300、100和50作图。在每种细胞剂量的肿瘤体积图的下方，记录有每种肿瘤细胞剂量的具有可检测肿瘤的动物相对于10只受注射动物的数，经对照治疗的肿瘤细胞在左(实心圆)、经抗DLL4的抗体21M18治疗的肿瘤细胞在左数第二位(空心方块)、经伊立替康治疗的肿瘤细胞在右数第二位(实心三角)，联合治疗的肿瘤细胞在右(空心圆)。B)计算了第81天的干细胞频率。以癌干细胞占经治疗的肿瘤细胞的比例(y轴)作图：将经对照治疗的肿瘤细胞(左)与经抗DLL4治疗的肿瘤细胞(左数第二个)、只经伊立替康治疗的肿瘤细胞(右数第二个)、和联合治疗的肿瘤细胞(右)进行比较，置信区间为95％。与对照组相比，经抗DLL4治疗的组具有统计显著差异(*)；与对照单独组(*)和伊立替康单独组(**)相比，联合组均具有显著差异。
图16：抗DLL4的21M18和伊立替康的联合治疗延缓了肿瘤的复发。以解离的C8细胞注射免疫低下的小鼠，并对约150mm3的已建立肿瘤进行为期32天的联合治疗：伊立替康(45mg/kg，一周给药2次)+抗DLL4的抗体21M18、或伊立替康(45mg/kg，一周给药2次)+对照抗体，之后停止伊立替康治疗。以对照抗体或21M18继续治疗。与对照(圆形)相比，经21M18治疗的动物(三角)中的以肿瘤体积(y轴)计的肿瘤复发被延迟。
图17：抗DLL4的21M18和伊立替康的联合治疗延缓了肿瘤的复发。显示了图16所示实验中的动物个体。显示了伊立替康治疗终止后47天的每只动物的总肿瘤体积(y轴)。
图18：抗DLL4的21M18和抗VEGF的联合减缓了肿瘤的生长。植入C17肿瘤细胞，并在2天后以对照抗体(黑色方块，实线)、21M18(三角，虚线)、抗VEGF(菱形，实线)或两种抗体的联合(圆形，点状线)开始治疗。每种抗体按10mg/kg，一周两次给药，每组10只动物。21M18和抗VEGF均减了缓肿瘤的生长，联合比单独的每种抗体更有效。
具体实施方式
术语“抗体”用以指这样的免疫球蛋白分子，即能够通过该免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合诸如蛋白、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述物质的组合等靶标的免疫球蛋白分子。在某些实施方式中，本发明的抗体包括拮抗剂抗体，该拮抗剂抗体与癌干细胞标记物蛋白特异性结合并干扰例如配体结合、受体二聚化、癌干细胞标记物蛋白的表达和/或癌干细胞标记物蛋白的下游信号转导。在某些实施方式中，所公开的抗体包括激动剂抗体，该激动剂抗体与癌干细胞标记物蛋白特异性结合并促进例如配体结合、受体二聚化和/或通过癌干细胞标记物蛋白进行的信号转导。在某些实施方式中，所公开的抗体不干扰或促进癌干细胞标记物蛋白的生物活性，但是通过例如抗体内化和/或由免疫体系识别来抑制肿瘤生长。本文所使用的术语“抗体”涵盖完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段)、单链Fv(scFv)突变体、多特异性抗体(如由至少两个完整抗体生成的双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白和其它任何包含抗原识别位点的经修饰的免疫球蛋白分子，只要所述抗体显示出所需的生物学活性即可。抗体可以属于免疫球蛋白的5种主要类别(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)中的任意一种类别或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，根据它们的重链恒定区的特征分别称之为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白具有不同的、公知的亚基结构和三维构型。抗体可以是裸露的或者与诸如毒素、放射性同位素等其它分子偶联。
在此所用的术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，还指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段、线性抗体、单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“Fv抗体”是指含有完全抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段，其可以是双链，其中一条重链和一条轻链可变区形成非共价二聚体，也可以是单链(scFv)，其中一条重链和一条轻链可变区通过柔性肽接头共价连接从而使所述两条链以类似二聚体结构联合。在这种构型中，各可变区的互补决定区(CDR)相互作用从而限定该Fv二聚体的抗原结合特异性。作为选择，单个可变区(或者Fv的一半)能够被用来识别和结合抗原，不过亲和力通常较低。
本文所用的“单克隆抗体”是指可高特异性识别并结合单抗原决定簇或表位的同源抗体群。这与多克隆抗体相反，多克隆抗体通常包括抗不同抗原决定簇的不同抗体。术语“单克隆抗体”涵盖完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白和其它任何包含抗原识别位点的经修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”还指通过任意种方式制得的所述抗体，所述方式包括但不限于杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。
本文所用的术语“人源化抗体”是指作为含有最少的非人类序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段的各种形式的非人类(例如鼠类)抗体。通常，人源化抗体是这样的人类免疫球蛋白，其中来自一种或多种抗体链的可变区的抗原决定区(或超变区)中的互补性决定区(CDR)的残基被来自非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的具有所需特异性、亲和力和能力的CDR的残基所置换。在一些情况中，人类免疫球蛋白的可变链框架区(FR)的残基被来自非人类物种的具有所需特异性、亲和力和能力的抗体中的相应残基所置换。通过可变框架区中的额外残基和/或被置换的非人类残基的取代，人源化抗体还可以被进一步修饰，以改进和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。通常，人源化抗体包含至少一个(通常为两个或三个或四个)可变区的几乎全部，所述可变区包含所有或几乎所有与非人类免疫球蛋白对应的CDR区，而所有或几乎所有的FR区是人类免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区或域(Fc)的至少一部分，通常包含的是人类免疫球蛋白的至少一部分。用以生成人源化抗体的方法的实例在美国专利5,225,539中有描述。
本文所用的术语“人类抗体”是指由人类产生的抗体或通过利用本领域已知的任何技术制得的具有与由人类产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体。人类抗体的这一定义包括完整的或全长的抗体、该抗体的片段和/或包含至少一条人类重链和/或轻链多肽的抗体，例如包含鼠类轻链多肽和人类重链多肽的抗体。
“杂交抗体”是这样的免疫球蛋白分子，其中将来自具有不同抗原决定簇区域的抗体的重链轻链对组装在一起，使得两种不同的表位或两种不同的抗原能够被所形成的四聚体所识别和结合。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两种以上物种。通常，轻链和重链这两者的可变区对应于来自于哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔等)的一个物种的抗体的具有所需特异性、亲和力和能力的可变区，而恒定区与来自于另一种物种(通常为人类)的抗体中的序列同源，以避免在该另一种物种中引发免疫应答。
术语“表位”或“抗原决定簇”在本文中可互换使用，并且指抗原的能够被特定抗体识别和特异性结合的部分。当抗原是多肽时，表位既可以由相邻氨基酸形成，也可以由经蛋白的三级折叠而并置的非相邻氨基酸形成。由相邻氨基酸形成的表位在蛋白变性时通常仍得以保持，而由三级折叠形成的表位在蛋白变性时通常会丧失。表位通常包括至少3个(更多情况下常常为至少5个或8个～10个)处于独特空间构象中的氨基酸。
通过其中所测试的免疫球蛋白抑制参比抗体与共同抗原的特异性结合的测定来确定抗体之间的竞争。已知有多种类型的竞争性结合测定法，例如固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶法免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(见Stahli等，Methods in Enzymology 9：242-253(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(见Kirkland等，J.Immunol.137：3614-3619(1986))；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(见Harlow和Lane，″Antibodies，A Laboratory Manual，″Cold Spring HarborPress(1988))；利用I-125标记的固相直接标记RIA(见Morel等，Molec.Immunol.25(1)：7-15(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等，Virology 176：546-552(1990))；和直接标记RIA(Moldenhauer等，Scand.J.Immunol.32：77-82(1990))。通常，所述测定涉及使用结合于固体表面的经纯化抗原或含有该抗原的细胞、未标记的测试免疫球蛋白或经标记的参比免疫球蛋白。通过确定在所述测试免疫球蛋白的存在下结合于固体表面的标记或细胞的量来测量竞争性抑制。通常所述测试免疫球蛋白过量存在。经竞争测定而鉴定的抗体(竞争性抗体)包括所结合的表位与参比抗体相同的抗体和所结合的表位与参比抗体结合的表位充分接近从而发生空间阻碍的抗体。通常，当竞争性抗体过量存在时，它将抑制参比抗体与共同抗原的特异性结合至少50％或75％。
抗体“选择性结合”或“特异性结合”是指抗体更频繁地、更迅速地、更持久地、亲和力更强地或者以上的某些组合而与表位反应或联合(与包括不相关的蛋白在内的替代性物质的反应或联合相比)。“选择性结合”或者“特异性结合”是指例如抗体以至少约0.1mM，但是更常见的是至少约1μM的KD与蛋白结合。“选择性结合”或者“特异性结合”有时是指抗体有时以至少约0.1μM的KD或者更佳的KD与蛋白结合，在其它时候是指以至少约0.01μM的KD或者更佳的KD与蛋白结合。由于不同物种中的同源蛋白之间的序列同一性，特异性结合可以包括识别不止一种物种中的癌干细胞标记物蛋白的抗体的特异性结合。
本文所用的术语“非特异性结合”和“背景结合”当在涉及抗体和蛋白或肽的相互作用中使用时是指不依赖于特定结构的存在的相互作用(即，抗体通常与蛋白结合，而不是与特定的结构如表位结合)。
术语“经分离的”或“经纯化的”是指材料基本上或实质上不含有在天然状态中与该材料通常相伴的成分。纯度和均质性通常采用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱等分析化学技术来确定。本发明所公开的在制剂中所存在的主要种类的蛋白(例如抗体)或核酸经过了充分的纯化。特别是，经分离的核酸与开放阅读框分开，该开放阅读框天然位于该基因的两侧并编码与该基因所编码的蛋白不同的蛋白。经分离的抗体与其它非免疫球蛋白分开，并与具有不同的抗原结合特异性的其它免疫球蛋白分开。所述术语还指核酸或蛋白在一些实施方式中具有至少80％的纯度，在一些实施方式中具有至少85％的纯度，在一些实施方式中具有至少90％的纯度，在一些实施方式中具有至少95％的纯度，而在一些实施方式中具有至少99％的纯度。
本文所用的术语“癌症“和“癌”是指或描述其中细胞群具有细胞生长失调特征的哺乳动物的生理状态。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这样的癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺部的腺癌、肺部的鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌(hepatocellular cancer)、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)和各种类型的头颈部癌症。
术语“增殖病症”和“增殖疾病”是指与诸如癌症等异常细胞增殖有关的病症。
本文所用的“肿瘤”和“瘤”是指由细胞过度生长或增殖引起的任何组织块，其为良性(非癌性)或恶性(癌性)，包括癌前病变。
本文所用的“转移”是指癌症从原初部位扩散或者转移到身体的其它区域且在该新的位置发展有类似癌性病变的过程。“转移性”或“转移”细胞是失去与相邻细胞的粘附接触并通过血流或淋巴从最初患病部位转移而侵入相邻身体结构的细胞。
术语“癌干细胞”、“肿瘤干细胞”或“实体瘤干细胞”在本文中可以相互交换使用，并指来自实体瘤的这样细胞群：(1)具有广泛的增殖能力；(2)能够进行非对称性细胞分裂，从而生成一种或多种增殖潜力或发育潜力下降的分化的子代；和(3)能够进行对称性细胞分裂而自我再生或自我维持。“癌干细胞”、“肿瘤干细胞”或“实体瘤干细胞”的这些性质使得与大多数不能形成肿瘤的肿瘤细胞相比这些癌干细胞具有在连续移植到免疫低下的小鼠后形成可触诊的肿瘤的能力。癌干细胞经历无序方式的自我再生与分化，从而形成具有能够因发生突变而随时间变化的异常细胞类型的肿瘤。如美国专利No.6,004,528所提出，实体瘤干细胞不同于“癌干系”。在该专利中，“癌干系”被定义为缓慢生长的祖细胞类型，其自身很少发生突变，而且进行对称性细胞分裂而不是进行在细胞环境中出现致瘤性变化所引起的非对称性细胞分裂。这一“癌干系”假说因而提出，作为异常环境的结果，大量出现高度突变、快速增殖的肿瘤细胞，从而导致相对正常的干细胞积累然后发生突变，这导致这些细胞变成肿瘤细胞。美国专利No.6,004,528提出，这种模型可用以促进癌症的诊断。实体瘤干细胞模型根本不同于“癌干系”模型，结果展示出“癌干系”模型所不能提供的应用。第一，实体瘤干细胞不是“突变缺乏的”。美国专利No.6,004,528所述的“突变缺乏的癌干系”可以被看作是癌前病变，而实体瘤干细胞是本身含有从癌前阶段开始到后期阶段癌症整个过程中造成致瘤性的突变的癌细胞。即，实体瘤干细胞(“癌干细胞”)应当包含在与美国专利No.6,004,528所述的“癌干系”明显不同的高度突变的细胞中。第二，导致癌症的基因突变基本上是实体瘤干细胞所固有并且受环境影响。实体瘤干细胞模型预测，分离的实体瘤干细胞在移植后能够形成另外的肿瘤(由此可以解释转移)，而“癌干系”模型预测，经移植的“癌干系”细胞不能形成新的肿瘤，这是因为它们的异常环境具有致瘤性。实际上，解离的、表型分离的人类实体瘤干细胞移植到小鼠(进入到与正常肿瘤环境非常不同的环境)中仍能形成新的肿瘤的能力使本发明明显区别于“癌干系”模型。第三，实体瘤干细胞很可能同时进行对称性细胞分裂和非对称性细胞分裂，使得对称细胞分裂并不是必有的性质。第四，实体瘤干细胞能够快速或缓慢分裂，这取决于很多变数，因此缓慢增殖速度并不是确有的特性。
术语“癌细胞”、“肿瘤细胞”以及文法上的等同表述是指源自肿瘤或癌前病变的细胞总群，其包含非致瘤性细胞(肿瘤细胞群中的大多数)和致瘤性干细胞(癌干细胞)。
本文所用的“致瘤性”是指实体瘤干细胞的功能特征，包括自我再生性(形成另外的致瘤性癌干细胞)和生成所有其它肿瘤细胞(发生分化并因此形成非致瘤性肿瘤细胞)从而使实体瘤干细胞形成肿瘤的增殖性。
本文所用的术语“干细胞癌标记物”、“癌干细胞标记物”、“肿瘤干细胞标记物”或“实体瘤干细胞标记物”是指一条或多条基因、或者所述一条或多条基因所表达的蛋白、多肽或肽，所述一条或多条基因本身的表达水平或与其它基因的组合时的表达水平与致瘤性癌细胞的存在相关联(与非致瘤性细胞相比)。这种相关可涉及所述基因表达的增加或减少(例如，所述基因编码的mRNA或编码的肽的水平的增加的或减少)。
本文所用的术语“活检样品”或“活检组织”是指取自受试对象的组织样品或流体样品，该样品用以确定其是否含有癌组织。在一些实施方式中，获得活检组织或流体是因为怀疑受试对象患有癌症，于是检查所述活检组织或流体是否存在癌症。
本文所用的术语“受试对象”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类灵长动物和啮齿动物等，所述受试对象是特定处理的接受者。在本文中提及人类受试对象时，术语“受试对象”和“患者”通常可以相互交换使用。
“药用”是指已由或可由联邦管理机构或州政府批准或者列于美国药典或其它受普遍认可的药典而用于动物(包括人类)。
“药用盐”是指药学可接受并且具有母体化合物的所需药理学活性的化合物的盐。
“药用赋形剂、载体或佐剂”是指这样的赋形剂、载体或佐剂，即可以与本发明所公开的至少一种抗体一起施用于受试对象、不破坏其药理学活性并且按足以输送治疗量的所述化合物的剂量施用时是无毒的。
“药用载质”是指与本发明所公开的至少一种抗体一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。
“前药”是指需要在体内转化生成治疗有效化合物的该治疗有效化合物的衍生物。前药可以在被转化为治疗有效的母体化合物之后才具有药学活性。
术语“治疗有效量”是指抗体、多肽、多核苷酸、有机小分子或其它药物有效“治疗”受试对象或哺乳动物的疾病或病症的量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量能够减少癌细胞的数量；减少肿瘤大小；抑制或阻止癌细胞浸润到周围器官，包括例如癌扩散到软组织和骨中；抑制并阻止肿瘤转移；抑制并阻止肿瘤生长；一定程度上减轻一种或多种与癌症有关的症状，减少发病率和死亡率；改善生命质量；或这些效果的组合。达到药物防止所存在的癌细胞的生长和/或杀死现存癌细胞的程度，其可以称为细胞抑制性和/或细胞毒性。
本文所用的“提供诊断”或“诊断信息”是指可用于确定患者是否患有疾病或病状和/或将疾病或病状分级为表型类别或在疾病或病状的预后或可能的治疗(可以是普通治疗也可以是特定治疗)反应方面具有意义的任何信息，例如包括癌干细胞的存在与否。类似地，诊断是指提供任何类型的诊断信息，包括但不限于受试对象是否可能具有病状(例如肿瘤)、受试对象的肿瘤是否包含癌干细胞、与肿瘤性质或分级有关的信息例如高风险肿瘤或低风险肿瘤、与预后有关的信息和/或与可用于选择适当治疗的信息。治疗选择可以包括特定化学治疗剂或其它治疗形式如手术或放射的选择或者与是否停止或提供治疗有关的选择。
本文所用的术语“提供预后”、“预后信息”或“预测信息”是指提供与癌症(例如，通过本发明的诊断方法确定的)的存在对受试对象日后的健康(例如，预期的发病或死亡，患上癌症的可能性以及转移的风险)的影响有关的信息，例如包括受试对象的肿瘤中是否存在癌干细胞。
如“进行治疗”或“治疗”或“以治疗”或“缓解”或“以缓解”等术语均指1)治愈、减慢、减轻所诊断的病理病状或病症的症状和/或防止所诊断的病理病状或病症的进展的治疗措施，和2)防止和/或减缓目标病理病状或病症的发展的预防措施或防止措施。因此，需要治疗的患者包括已经具有病症的患者；倾向具有病症的患者；和病症需要防止的患者。如果受试对象显示出一种或多种以下效果则该患者根据本发明的方法成功地得到“治疗”：癌细胞数量的减少或完全消失；肿瘤尺寸的减小；抑制或不再出现癌细胞向周围器官的浸润，包括例如癌在软组织和骨中的扩散；抑制或不再发生肿瘤的转移；抑制或不再出现肿瘤的生长；减轻一种或多种与特定癌症相关的症状；减少发病率和死亡率；改善生命质量；或某些组合效果。
本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指多个核苷酸单元(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或有关的结构变体)通过磷酸二酯键连接构成的聚合物，包括但不限于DNA或RNA。该术语涵盖包括DNA和RNA的任意已知碱基类似物的序列。该术语涵盖DNA和RNA的包括了任何已知碱基类似物的序列。所述碱基类似物包括但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(mannosylqueosine)、5′-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、氧丁核苷(oxybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5氧基乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫代胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。
短语“严格的杂交条件”是指这样的条件：在所述条件下，通常在核酸的复合混合物中，探针将与其目标序列杂交，而不与其它序列杂交。严格条件具有序列依赖性并因环境不同而不同。较长的序列在更高温度下特异性杂交。关于核酸杂交的详尽指南可见于Tijssen，Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes，″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays″(1993)。通常，所选的严格条件为在所定的离子强度pH下比特定序列的热熔化点(Tm)约低5℃～10℃。Tm是(在所定的离子强度、pH和核酸浓度下)当互补于目标物的探针的50％与目标序列平衡杂交的温度(由于目标序列过量存在，所以在Tm，当平衡时探针的50％被占据)。还可以通过加入诸如甲酰胺等去稳定剂来实现严格条件。对于选择性杂交或特异性杂交，阳性信号至少为背景的2倍、优选为背景杂交的10倍。示例性的严格杂交条件如下：50％的甲酰胺、5×SSC和1％SDS、在42℃温育，或者，5×SSC、1％的SDS、在65℃温育，在0.2×SSC中洗涤、并于65℃在1％的SDS中洗涤。
术语“基因”是指包含生成多肽、前体、或RNA(例如rRNA、tRNA)所需的编码序列的核酸(例如DNA)序列。多肽可以由全长编码序列编码，或者由该编码序列的任何部分编码，只要保留有该全长编码序列或片段的所需活性或功能性质(例如，酶活性、配体结合、信号转导、免疫原性等)即可。该术语还涵盖结构基因的编码区和邻近该编码区并距离5′端和3′端任意一端约1kb以上的举例定位从而使该基因相当于全长mRNA长度的序列。定位于编码区的5′端并出现在mRNA上的序列是指5′端非翻译序列。定位于编码区3′端或下游并出现在mRNA上的序列是指3′端非翻译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或基因克隆包含被非编码序列(称为“内含子”或“插入区”或“插入序列”)间断的编码区。内含子是转录到核RNA(hnRNA)中的基因的片段；内含子可以含有诸如增强子等调控元件。内含子被从核转录本或初级转录本除掉或“剪切掉”；因此内含子并没有出现在信使RNA(mRNA)转录本中。mRNA在翻译过程中起到确定新生多肽中的氨基酸序列或顺序的作用。除了含有内含子之外，基因组形式的基因还可以包含位于出现在RNA转录本上的序列的5′端和3′端的序列。这些序列被称为“侧翼”序列或“侧翼”区(这些侧翼序列位于出现在mRNA转录本上的非翻译序列的5′或3′)。5′侧翼区可以含有控制或影响基因转录的诸如启动子和增强子等调控序列。3′侧翼区可以包含指导转录终止、转录后切割和多腺苷酸化的序列。
在涉及细胞、核酸、蛋白或载体时所使用的术语“重组”表示所述细胞、核酸、蛋白或载体已经通过导入异源核酸或蛋白或改变天然核酸或蛋白而被修饰，或者所述细胞来源于经如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞可表达未见于天然(非重组)形式的细胞的基因或可表达过表达或异常表达(例如表达为非天然存在的片段或剪切变体)的天然基因。本文所用术语的“重组核酸”是指这样的核酸，其最初通常通过操纵核酸(例如使用聚合酶和内切酶)在体外形成，并且为通常未见于自然界的形式。采用这种方式可以实现不同序列的可操作连接。因此，线性形式的经分离的核酸或者通过连接通常未连在一起的DNA分子而在体外形成的表达载体都认为是用于本发明用途的重组体。应当理解的是，一旦制得重组核酸并导入宿主细胞或生物体，其将非重组地(即利用宿主细胞的体内细胞机构而不是体外操纵)复制；然而，这样的核酸一旦重组制得，虽然随后进行非重组地复制，但是仍然被认为是用于本发明用途的重组体。类似地，“重组蛋白”是利用重组技术(即通过以上所述的重组核酸的表达)所制得的蛋白。
本文所用的术语“异源基因”是指未处于其天然环境中的基因。例如，异源基因包括来自某一物种的但被导入到另一种物种的基因。异源基因还包括对于生物体而言是天然的但已经以某种方式被改变(例如，突变了的、加入多拷贝的、连接到非天然调控序列的，等等)的基因。异源基因明显不同于内源性基因之处在于异源基因序列通常连接到未发现与染色体中的基因序列天然有关或与自然界未发现的染色体的各部分有关的DNA序列(例如，在通常不表达该基因的基因座表达的基因)。
本文所用的术语“载体”用于指将一条或多条DNA片段从一个细胞转移到另一个细胞的核酸分子。术语“载质”有时与“载体”相互交换使用。载体通常来自于质粒、噬菌体或者植物病毒或动物病毒。
“连接”是指在两条双链核酸片段之间形成二酯键的过程。除非另有说明，否则连接可以使用已知缓冲液和10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)/0.5μg的约等摩尔量的待连接DNA片段的条件完成。核酸的连接可以用来将两个蛋白在框架内连接在一起以生成单一蛋白或融合蛋白。
本文所用的术语“基因表达”是指通过基因的“转录”(例如，通过RNA聚合酶的酶促作用)将基因中所编码的遗传信息转化为RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)，以及对于蛋白编码基因通过mRNA的“翻译”而转化为蛋白的过程。可以在该过程中的很多阶段调节基因表达。“上调”或“活化”是指提高基因表达产物(例如，RNA或蛋白)生成量的调控，而“下调”或“抑制”是指降低生成量的调控。参与上调或下调的分子(例如，转录因子)常常被分别称为“激活物”和“阻遏物”。
术语“多肽”、“肽”、“蛋白”和“蛋白片段”在本文中可以相互交换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一种或多种氨基酸残基是天然存在的相应氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，也适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸酸以及具有与天然存在的氨基酸类似的功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸以及那些经后期修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，例如α碳连接到氢、羧基、氨基和R基团的氨基酸，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。所述类似物可以具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽骨架但仍保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的普通化学结构的结构但是具有与天然存在的氨基酸类似的功能的化合物。
“保守修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。“氨基酸变体”是指氨基酸序列。对于特定的核酸序列，保守修饰变体是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸序列，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况中指基本相同或相关的(例如天然临近的)序列。由于遗传密码的简并性，大多数蛋白都由大量功能相同的核酸编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU编码的氨基酸均是丙氨酸。因此，在由密码子规定为丙氨酸的每一个位置，该密码子可以改变为另一个相应的所述密码子而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异为“沉默变异”，是一种保守修饰变异。此处编码多肽的每一核酸序列也表述核酸的沉默变异。本领域技术人员应当知道，在某些情况下，也可以对核酸中的各密码子(除了一般是甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和一般是色氨酸的唯一密码子的TGG之外)加以修饰以获得功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的沉默变异隐含在关于表达产物的所述序列中，但不隐含在关于实际探针序列的所述序列中。对于氨基酸序列，本领域技术人员应知道，在经编码的序列中改变、增加或缺失单个氨基酸或少量百分比的氨基酸的、对核酸、肽、多肽或蛋白序列的单独取代、缺失或增加是“保守修饰变体”，包括改变的结果导致氨基酸被化学相似的氨基酸取代的情况。提供有功能相似的氨基酸的保守取代的表格在本领域内是周知的。除包括这样的保守修饰变体之外，并没有排除本发明的多态性变体、种间同系物和等位基因。通常，保守取代包括：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰氨(N)、谷氨酰氨(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮胺酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(见，例如Creighton，Proteins(1984))。
本文所用的术语“带表位标签的”是指包含与“表位标签”融合的癌干细胞标记物蛋白或其域序列或部分的嵌合多肽。表位标签多肽包含足够的氨基酸残基以提供由抗体识别的表位，但仍然足够的短使得其不影响癌干细胞标记物蛋白的活性。适宜的表位标签通常具有至少6个氨基酸残基，一般为约8～约50个氨基酸残基，有时为约10～约20个残基。常用的表位标签包括Fc、HA、His和FLAG标签。
本发明提供了用于研究、诊断、表征和治疗癌症的组合物和方法。具体而言，本发明提供了抗实体瘤干细胞标记物的抗体和使用这些抗体来抑制肿瘤生长和治疗人类患者的癌症的方法。在某些实施方式中，本发明的抗体包括拮抗剂抗体，所述拮抗剂抗体可特异性结合癌干细胞标记物蛋白并干扰例如配体结合、受体二聚化、癌干细胞标记物蛋白的表达和/或癌干细胞标记物蛋白的信号转导。在某些实施方式中，所公开的抗体包括激动剂抗体，该激动剂抗体可与癌干细胞标记物蛋白特异性结合并促进例如配体结合、受体二聚化和/或通过癌干细胞标记物蛋白进行的信号转导。在某些实施方式中，所公开的抗体不干扰或促进癌干细胞标记物蛋白的生物活性，但是通过例如抗体内化和/或由免疫体系识别来抑制肿瘤生长。在某些实施方式中，所述抗体可特异性识别多于一种的实体瘤干细标记物蛋白。
本发明提供了与人类DLL4表位特异性结合的一种经分离的抗体，所述人类DLL4表位由人类DLL4N-末端区域(SEQ ID NO：27)和人类DSL(SEQ ID NO：26)组合形成，其中所述抗体影响肿瘤的生长。在某些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在某些实施方式中，所述抗体是嵌合抗体。在某些实施方式中，所述抗体是人源化抗体。在某些实施方式中，所述抗体是人类抗体。本发明进一步提供了包含本发明所公开的抗体和药用载体的药物组合物。
本发明进一步提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本发明所公开的抗体或药物组合物。在某些实施方式中，将所述抗体与细胞毒性部分偶联。在某些实施方式中，所述方法进一步包括施用至少一种适于进行联合疗法的额外治疗剂。在某些实施方式中，所述肿瘤细胞选自乳腺肿瘤、结肠直肠肿瘤、肺肿瘤、前列腺肿瘤、胰腺肿瘤和头颈部肿瘤。
类似于其来源组织，实体瘤由异源细胞群组成。大部分这些细胞缺乏致瘤性，这表明实体瘤的发展和维持也依赖于小群的干细胞(即，致瘤性癌细胞)，这些干细胞具有增殖能力并有效地同时形成其它的肿瘤干细胞(自我再生)和大部分的分化程度更高的、缺乏致瘤潜能的肿瘤细胞(即，非致瘤性癌细胞)。癌干细胞的概念是在发现造血干细胞(HSC)后不久首次引入的，并在急性髓性白血病(AML)中得到实验证实(Park等，1971，JNatl.Cancer Inst.46：411～22；Lapidot等，1994，Nature 367：645～8；Bonnet和Dick，1997，Nat.Med.3：730～7；Hope等，2004，Nat.Immunol.5：738～43)。来自实体瘤的干细胞新近基于它们的细胞表面受体独特的表达模式和对它们在培养物和异种移植物动物模型中自我再生和增殖性质的评价而得到分离。已发现，为了能够形成肿瘤，需要将ESA+CD44+CD24-/低谱系群体富集为未分级的肿瘤细胞的50倍以上(Al-Hajj等，2003，Proc.Nat’l.Acad.Sci.100：3983～8)。从大量非致瘤性肿瘤细胞中分离出致瘤性癌干细胞的能力使得可以使用微阵列分析来鉴定癌干细胞标记物、与非致瘤性肿瘤细胞或正常乳腺上皮相比在癌干细胞中具有差异表达的基因。本发明利用关于这些所鉴定的癌干细胞标记物的认识来诊断和治疗癌症。
本发明的癌干细胞标记物涉及人类DLL4，一种Notch受体配体。Notch信号转导途径是胚性模式形成、后胚性组织维持和干细胞生物学的数个关键调节因素之一。更具体地说，Notch信号转导涉及相邻细胞命运之间的侧抑制过程，并在不对称细胞分裂过程中对细胞命运的决定发挥重要作用。失控的Notch信号转导与大量人类癌症有关，其可以改变肿瘤细胞的发育命运而使它们维持在未分化和增殖状态(Brennan和Brown，2003，Breast Cancer Res.5：69)。因此，致癌作用能够通过盗用控制由干细胞群进行的正常发育和组织修复的稳态机制而进行(Beachy等，2004，Nature 432：324)。
Notch受体首次在果蝇突变体中被鉴定。果蝇Notch的单倍体缺失在翅缘产生缺损，而功能丧失则产生胚性致死的“神经源性”表型，其中表皮细胞的命运被转变为神经组织(Moohr，1919，Genet.4：252；Poulson，1937，PNAS 23：133；Poulson，1940，J.Exp.Zool.83：271)。Notch受体是单次跨膜的跨膜受体，其在大型胞外域中含有大量串联的表皮生长因子(EGF)样重复序列和富含半胱氨酸的Notch/LIN-12重复序列(Wharton等，1985，Cell 43：567；Kidd等，1986，Mol.Cell Biol.6：3094；在Artavanis等.，1999，Science 284：770中有综述)。已经鉴定了四个哺乳动物Notch蛋白(NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和NOTCH4)，这些受体中的突变总是导致发育异常和包括数种癌症在内的人类病理改变(下文中将详述)(Gridley，1997，Mol.Cell Neurosci.9：103；Joutel和Tournier-Lasserve，1998，Semin.Cell Dev.Biol.9：619-25)。
δ、锯齿状、延迟-2(Delta，Serrated，Lag-2)(DSL)家族的单次跨膜的跨膜配体可活化Notch受体。已知的哺乳动物Notch配体δ样1(Dll1)、δ样3(Dll3)、δ样4(Dll4)、Jagged(锯齿样)1和Jagged 2的特征是DSL域和胞外域中的串联EGF-样重复序列。Notch受体的胞外域与通常在相邻的细胞上的其配体的胞外域相互作用，导致Notch的两种蛋白水解切割：由ADAM蛋白酶介导的细胞外切割和由γ分泌酶介导的跨膜域内的切割。后一种切割生成Notch胞内域(NICD)。NICD随后进入核中并在核中活化作为主要下游效应物的CBF1，无毛抑制基因(Suppressor of Hairless)[Su(H)]，延迟-2(CSL)家族的转录因子，从而增强多毛和分裂增强子[E(spl)]家族的核碱性螺旋-环-螺旋转录因子的转录(Artavanis等，1999，Science 284：770；Brennan和Brown，2003，Breast Cancer Res.5：69；Iso等，2003，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.23：543)。哺乳动物中也可能存在涉及在果蝇中鉴定的胞质蛋白Deltex的可选胞内途径(Martinez等，2002，Curr.Opin.Genet.Dev.12：524-33)，并且这一Deltex依赖性途径可以发挥抑制Wnt目标基因表达的作用(Brennan等，1999，Curr.Biol.9：707-710；Lawrence等，2001，Curr.Biol.11：375-85)。
造血干细胞(HSC)是体内了解最多的干细胞，Notch信号转导同时参与了造血干细胞的正常维持和白血病转化(Kopper和Hajdu，2004，Pathol.Oncol.Res.10：69-73)。HSC是位于成体骨髓中的小孔龛(stomal niche)内的稀有细胞群。这些细胞的特征在于独特的基因表达模式以及持续产生分化度更高的祖细胞以再建整个造血体系的能力。在体外和在长期的重建测试中，HSC和祖细胞中Notch1信号转导的组成型活化可建立同时产生淋巴细胞和骨髓细胞的永生细胞系(Varnum-Finney等，2000，Nat.Med.6：1278-81)，并且Jagged 1的存在可增强人类骨髓细胞群(富集有HSC)的移植(Karanu等，2000，J.Exp.Med.192：1365-72)。最近，已经在体内证明了HSC中存在Notch信号转导，并且表明Notch信号转导涉及对HSC分化的抑制。此外，Wnt介导的HSC自我再生似乎需要Notch信号转导(Duncan等，2005，Nat.Immunol.6：314)。
Notch信号途径还在神经干细胞的维持中发挥核心作用，并与神经干细胞的正常维持以及脑癌均有关系(Kopper和Hajdu，2004，Pathol.Oncol.Res.10：69-73；Purow等，2005，Cancer Res.65：2353-63；Hallahan等，2004，Cancer Res.64：7794-800)。神经干细胞在发育过程中产生哺乳动物神经体系中所有的神经细胞和胶质细胞，并且最近在成体脑中已鉴定到神经干细胞(Gage，2000，Science 287：1433-8)。Notch1；Notch目标基因Hes1、3和5；以及Notch信号转导早老素1(presenilinl)(PS1)的调节子缺失的小鼠表现为胚性神经干细胞数量的下降。另外，在PS1杂合子小鼠的脑中，成体神经干细胞减少(Nakamura等，2000，J.Neurosci.20：283-93；Hitoshi等，2002，Genes Dev.16：846-58)。神经干细胞的减少可能是由于它们过早分化为神经元(Hatakeyama等，2004，Dev.131：5539-50)，这表明Notch信号转导调控神经干细胞分化和自我再生。
多种人类癌症涉及异常的Notch信号转导。在T细胞急性淋巴母细胞性白血病的一个亚类中首次鉴定了人类的NOTCH1基因，所鉴定的NOTCH1基因是导致Notch途径活化的已易位的基因座(Ellisen等，1991，Cell 66：649-61)。小鼠模型中T细胞内Notch1信号转导的组成型活化同样产生T细胞淋巴瘤，这表明其引发作用(Robey等，1996，Cell 87：483-92；Pear等，1996，J.Exp.Med.183：2283-91；Yan等，2001，Blood 98：3793-9；Bellavia等，2000，EMBO J.19：3337-48)。最近已经发现儿童和成人T细胞急性淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤中常常存在产生异常NOTCH1信号转导的NOTCH1点突变、插入和缺失(Pear和Aster，2004，Curr.Opin.Hematol.11：416-33)。
小鼠乳腺癌病毒对乳腺肿瘤中的Notch 1和Notch 4基因座的频繁插入和所产生的经活化的Notch蛋白片段首次暗示乳癌中存在Notch信号转导(Gallahan和Callahan，1987，J.Virol 61：66-74；Brennan和Brown，2003，Breast Cancer Res.5：69；Politi等，2004，Semin.Cancer Biol.14：341-7)。对转基因小鼠的进一步研究已经证实在正常乳腺发育期间Notch在乳管分枝(ductal branching)中的作用，并且乳腺上皮细胞中Notch 4的组成型活化形式抑制表皮分化并导致肿瘤发生(Jhappan等，1992，Genes & Dev.6：345-5；Gallahan等，1996，Cancer Res.56：1775-85；Smith等，1995，CellGrowth Differ.6：563-77；Soriano等，2000，Int.J.Cancer 86：652-9；Uyttendaele等，1998，Dev.Biol 196：204-17；Politi等，2004，Semin.CancerBiol.14：341-7)。目前关于Notch在人类乳癌中的作用的证据限于Notch受体在乳癌中的表达和它们与临床结果之间的相关性(Weijzen等，2002，Nat.Med.8：979-86；Parr等，2004，Int.J.MoI.Med.14：779-86)。另外，已经在宫颈癌(Zagouras等，1995，PNAS 92：6414-8)、肾细胞癌(Rae等，2000，Int.J.Cancer 88：726-32)、头颈部鳞状细胞癌(Leethanakul等，2000，Oncogene19：3220-4)、子宫内膜癌(Suzuki等，2000，Int.J.Oncol.17：1131-9)和神经母细胞瘤(van Limpt等，2000，Med.Pediatr.Oncol.35：554-8)中观察到了Notch途径的过表达，这提示Notch在多种瘤的发展中的潜在作用。有趣的是，Notch信号转导可能在维持结肠的Ape突变体瘤细胞的未分化态中发挥作用(van Es和Clevers，2005，Trends Mol.Med.11：496-502)。
在包括增殖、迁移、平滑肌分化、血管发生和动脉静脉分化在内的血管发育等多个方面中，同样涉及Notch途径(Iso等，2003，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.23：543)。例如，在动脉发育和卵黄囊血管形成中，Notch-1/4和Jagged-1的纯合无效突变以及DLL4的杂合缺失导致严重且易变的缺陷。此外，Dll1缺陷和Notch-2亚效小鼠胚胎出现出血，这可能是由于血管结构的不良发育(Gale等，2004，PNAS，101：15949-54；Krebs等，2000，Genes Dev.14：1343-52；Xue等，1999，Hum.Mel Genet.8：723-30；Hrabe de Angelis等，1997，Nature 386：717-21；McCright等，2001，Dev.128：491-502)。在人类中，JAGGED1的突变与Alagille综合征有关，Alagille综合征是一种包括血管缺陷在内的发育障碍，而NOTCH3的突变是遗传性血管性痴呆(CADASIL)的原因，在遗传性血管性痴呆中，血管内环境稳定有缺陷(Joutel等，1996，Nature 383：707-10)。
对在癌干细胞(与正常乳上皮相比)中表达的DLL4的鉴定表明靶向Notch途径不仅可以消除大多数非致瘤性癌细胞，还可以消除可导致实体瘤形成和复发的致瘤性细胞。此外，由于血管发生在肿瘤形成和维持中的突出作用，通过抗DLL4的抗体靶向Notch途径还能够有效抑制血管发生、使癌缺乏营养并有助于消除癌症。
由此，本发明提供了一种癌干细胞标记物，所述癌干细胞标记物的表达可用于分析，以诊断或监测与癌相关的疾病。在一些实施方式中，癌干细胞标记物的表达例如由编码所述癌干细胞标记物的多核苷酸(例如mRNA)表达来确定。可以通过本领域中技术人员周知的众多方法中任意一种来检测和定量所述多核苷酸。在一些实施方式中，采用例如来自患者活检样品的组织切片进行原位杂交来检测编码癌干细胞标记物的mRNA。在一些实施方式中，将RNA从组织中分离并通过例如Northern印迹、定量RT-PCR或微阵列等进行检测。例如，可以从组织样品中提取总RNA，并可以利用RT-PCR，使用特异性杂交和扩增癌干细胞标记物的引物来检测癌干细胞标记物多核苷酸的表达。
在某些实施方式中，可以通过检测相应的多肽来确定癌干细胞标记物的表达。可以通过本领域中技术人员周知的众多手段中的任意一种来检测和定量所述多肽。在一些实施方式中，例如使用分析生物化学方法例如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)或薄层层析(TLC)来检测癌干细胞标记物多肽。还可以根据标准技术对所分离的多肽进行测序。在一些实施方式中，利用例如组织切片上的免疫荧光或免疫组织化学，以抗癌干细胞标记蛋白而产生的抗体来检测所述蛋白。作为选择，可以使用例如ELISA、FACS、Western印迹、免疫沉淀或蛋白微阵列，以抗癌干细胞标记物的抗体检测表达。例如，可从患者活检样品中分离出癌干细胞，利用FACS以荧光标记的抗体检测癌干细胞标记物蛋白的表达。在另一种方法中，可以利用标记的抗体在典型成像系统中对表达癌干细胞标记的细胞进行体内检测。例如，可以使用顺磁性同位素标记的抗体进行磁共振成像(MRI)。
在本发明的一些实施方式中，诊断测定包括使用例如免疫组织化学、原位杂交或RT-PCR来确定癌干细胞标记物在肿瘤细胞中的表达与否。在另外的实施方式中，诊断测定包括使用例如定量RT-PCR确定癌干细胞标记物的表达水平。在一些实施方式中，诊断测定还包括例如与对照组织例如正常上皮组织比较来确定癌干细胞标记物的表达水平。
然后可用癌干细胞标记物表达的检测来提供预后和选择疗法。预后可以基于癌干细胞标记物指示的任意已知风险表达。而且，癌干细胞标记物的检测可以用以选择适当的疗法，包括例如用抗被检测的癌干细胞标记物蛋白的抗体所进行的治疗。在某些实施方式中，所述抗体特异性结合诸如Notch受体配体DLL4等癌干细胞标记物蛋白的胞外域。
在本发明的范围内，适当的抗体是具有例如以下一种或多种效果的试剂：干扰癌干细胞标记物的表达；通过例如在空间上抑制癌干细胞标记物与其配体、受体或共受体之间的相互作用来干扰癌干细胞信号转导途径的活化；通过例如发挥配体作用或促进内源性配体的结合而活化癌干细胞信号转导途径；或结合癌干细胞标记物并抑制肿瘤细胞增殖。
在某些实施方式中，抗癌干细胞标记物的抗体起到胞外调节癌干细胞标记物蛋白功能的作用。在一些实施方式中，抗癌干细胞标记物的抗体的胞外结合可以通过例如抑制癌干细胞标记物的固有活化(例如激酶活性)和/或通过在空间上抑制例如癌干细胞标记物与其配体、与其受体、与共受体或与胞外基质之间的相互作用来抑制癌干细胞标记物蛋白的信号转导。在一些实施方式中，抗癌干细胞标记物的抗体的胞外结合可以通过例如癌干细胞标记物蛋白的内化或减少癌干细胞标记物的细胞表面运输来下调癌干细胞标记物的细胞表面表达。在一些实施方式中，抗癌干细胞标记物的抗体的胞外结合可以通过例如发挥作为诱饵配体的作用或增加配体结合来促进癌干细胞标记物蛋白的信号转导。
在某些实施方式中，抗癌干细胞标记物的抗体与癌干细胞标记物蛋白结合并具有以下一种或多种效果：抑制肿瘤细胞的增殖，触发肿瘤细胞的细胞死亡、促进肿瘤细胞分化为致瘤性较小的细胞类型或防止肿瘤细胞的转移。在某些实施方式中，抗癌干细胞标记物的抗体通过所偶联的毒素、化疗剂、放射性同位素或其它类似试剂来触发细胞死亡。例如，将抗癌干细胞标记物的抗体与在表达该癌干细胞标记物的肿瘤细胞中通过蛋白内化而被活化的毒素偶联。
在某些实施方式中，抗癌干细胞标记物的抗体通过抗体依赖的细胞毒性(ADCC)介导表达所述癌干细胞标记物蛋白的细胞的细胞死亡。ADCC通过识别抗体的Fc部分的效应细胞而参与细胞的裂解。例如许多淋巴细胞、单核细胞、组织巨噬细胞、粒细胞和嗜酸性粒细胞具有Fc受体并能够介导细胞裂解(Dillman，1994，J.Clin.Oncol.12：1497)。
在某些实施方式中，抗癌干细胞标记物的抗体通过活化补体依赖的细胞毒性(CDC)而触发表达癌干细胞标记物蛋白的细胞的细胞死亡。CDC参与血清补体与抗体的Fc部分的结合以及随后补体蛋白级联的活化，从而导致细胞膜破坏，并最终造成细胞死亡。抗体的生物学活性已知在很大程度上由抗体分子的恒定区或Fc区决定(Uananue和Benacerraf，Textbook of Immunology，第2版，Williams和Wilkins，第218页(1984))。如同属于相同亚类但是来自于不同物种的抗体一样，属于不同类别和亚类的抗体在这方面是不同的。在人类抗体中，IgM是与补体结合最有效的抗体类别，其次是IgG1、IgG3和IgG2，但是IgG4似乎在活化补体级联中非常缺乏(Dillman，1994，J.Clin.Oncol.12：1497；Jefferis等，1998，Immunol.Rev.163：59～76)。根据本发明，可以制备具有所需生物学活性的那些类别抗体。
可以测定抗癌干细胞的任何特定抗体通过补体活化和/或ADCC介导靶细胞裂解的能力。体外培养并标记感兴趣的细胞；将抗体与血清补体或可被抗原抗体复合物活化的免疫细胞一起加到细胞培养物中。通过例如从裂解细胞释放标记而检测靶细胞的细胞裂解。实际上，可以使用患者自己的血清作为补体源和/或免疫细胞源来筛查抗体。然后可以将能够在体外测试中活化补体或介导ADCC的抗体用于该特定患者的治疗。
在某些实施方式中，抗癌干细胞标记物的抗体可触发细胞死亡，从而抑制血管生成。血管生成是这样的过程，即，通过血管生成，由先前存在的血管形成新的血管，并且血管生成是在例如胚胎发育、伤口愈合和排卵响应过程等中正常生长所需的基本过程。大于1mm2～2mm2的实体瘤生长也需要血管生成以补充营养和氧，如果没有血管生成，肿瘤细胞将会死亡。在某些实施方式中，抗癌干细胞标记物的抗体靶向表达该癌干细胞标记物的血管细胞，包括例如内皮细胞、平滑肌细胞或血管组装所需的胞外基质的组分。在某些实施方式中，抗癌干细胞标记物的抗体抑制血管细胞募集、组装、维持或存活所需的生长因子信号转导。
抗癌干细胞标记物的抗体可以用于本文所述的诊断和治疗方法。在某些实施方式中，本发明的抗体可用以检测如患者组织活检样品、胸腔积液或血液样品等生物学样品中的癌干细胞标记物蛋白的表达。可以将组织活检样品制成切片并使用例如免疫荧光或免疫组织化学对蛋白进行检测。此外，可以分离来自样品的个体细胞并通过FACS分析来检测经固定的细胞或活细胞上的蛋白表达。在某些实施方式中，可以在蛋白阵列上使用抗体来检测例如肿瘤细胞上、细胞裂解物中或其它蛋白样品中的癌干细胞标记物的表达。在某些实施方式中，在基于细胞的体外测定或体内动物模型等中，通过使抗体与肿瘤细胞接触而将本发明的抗体用于抑制肿瘤细胞的生长。在某些实施方式中，通过施用治疗有效量的抗癌干细胞标记物的抗体而将所述抗体用于治疗患者的癌症。
可以通过任何本领域中已知的常规方法来制备本发明的抗体。例如，可以通过多次皮下注射或腹膜内注射相关抗原(纯化的肽片段、全长重组蛋白、融合蛋白等)来免疫动物(例如兔、大鼠、小鼠、驴等)从而制备多克隆抗体，所述抗原可任选与稀释在无菌盐水中的匙孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白等偶联和与佐剂(例如完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂)联合以形成稳定的乳液。然后从经如此免疫的动物的血液和腹水等中回收多克隆抗体。让所收集的血液凝结，倾析出血清，通过离心使其澄清并测定抗体滴度。可以根据本领域的标准方法，包括亲和层析、离子交换色谱、凝胶电泳、透析等从血清或腹水中纯化出多克隆抗体。
可以采用例如Kohler和Milstein(1975)，Nature 256：495所描述的杂交瘤法来制备单克隆抗体。采用杂交瘤法，按照如上所述对小鼠、仓鼠或其它适当的宿主动物进行免疫以引发淋巴细胞生成可特异性结合免疫性抗原的抗体。还可以在体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，并使用例如聚乙二醇将其与适当骨髓瘤细胞系融合，从而形成随后可以从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞中选出的杂交瘤细胞。通过免疫沉淀、免疫印迹或体外结合测定(例如放射性免疫测定(RIA)；酶联免疫吸附测定(ELISA))来确定可产生特异性抗所选抗原的单克隆抗体的杂交瘤，随后使用标准方法(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，1986)在培养物中体外繁殖或作为动物腹水肿瘤体内繁殖所述杂交瘤。然后从如以上针对多克隆抗体所描述的培养基或腹水液中纯化单克隆抗体。
作为选择，还可以使用如美国专利4,816,567所描述的重组DNA法来制备单克隆抗体。使用能够特异性扩增编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物，通过例如RT-PCR从成熟B细胞或杂交瘤细胞分离出编码所述单克隆抗体的多核苷酸，并使用常规程序确定它们的序列。然后将所分离的编码重链和轻链的多核苷酸克隆到适当的表达载体中，当将该表达载体转染到诸如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞等不自身生成免疫球蛋白的宿主细胞中时，由该宿主细胞产生单克隆抗体。另外，可以从表达所需物种的CDR的噬菌体展示文库中分离出所述的所需物种的重组单克隆抗体或其片段(McCafferty等，1990，Nature，348：552～554；Clackson等，1991，Nature，352：624～628；和Marks等，1991，J.Mol.Biol，222：581～597)。
可以使用重组DNA技术，以多种不同方式进一步修饰编码单克隆抗体的多核苷酸，以产生替代性抗体。在一些实施方式中，可以将例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定区取代为1)例如人类抗体的恒定区，以产生嵌合抗体或2)非免疫球蛋白多肽，以产生融合抗体。在一些实施方式中，截短或去除所述恒定区以产生单克隆抗体的所需抗体片段。可以使用可变区的定点诱变或高密度诱变来优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。
在本发明的一些实施方式中，所述抗癌干细胞标记物的单克隆抗体是人源化抗体。人源化抗体是在可变区中含有来自非人类(例如鼠类)抗体的最少量序列的抗体。这样的抗体在治疗上用于对人类受试对象施用时减少抗原性和HAMA(人类抗小鼠抗体)应答。在实践中，人源化抗体通常是带有最少量甚至不带有非人类序列的人类抗体。人类抗体是由人类产生的抗体或者是具有对应于由人类产生的抗体的氨基酸序列的抗体。
可以使用本领域已知的各种技术来制备人源化抗体。可以按(Jones等，1986，Nature，321：522～525；Riechmann等，1988，Nature，332：323～327；Verhoeyen等，1988，Science，239：1534～1536)的方法，以具有所需特异性、亲和力和能力的非人类抗体(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠等)的CDR取代人类抗体的CDR来对抗体进行人源化。可以通过人类可变框架区和/或所置换的非人类残基内的额外残基的取代来进一步修饰人源化抗体，以改进和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。
对在制备人源化抗体过程中所用的人类重链和/或轻链可变区的选择，对于降低抗原性是重要的。根据“最佳配合”法，使用已知的人类可变区氨基酸序列的整个文库来筛选啮齿类抗体的可变区的序列。因此在某些实施方式中，将与从中取出CDR的啮齿类抗体的氨基酸序列同源性最高的人类氨基酸序列用作人源化抗体的人类框架区(FR)(Sims等，1993，J.Immunol，151：2296；Chothia等，1987，J.MoI.Biol，196：901)。另一种方法使用源自特定轻链或重链亚群的所有人类抗体的共有序列的特定FR，该方法能够被用于数种不同的人源化抗体(Carter等，1992，PNAS，89；4285；Presta等，1993，J.Immunol，151：2623)。在某些实施方式中，使用组合方法来选取用于人源化抗体生产的人类可变FR。
进一步理解的是需人源化的抗体(例如啮齿类)必须保持对抗原的高亲和力以及其它有利的生物学性质。为了实现这一目标，可以通过分析来自需人源化的啮齿类抗体的亲本序列和各种备选的人源化序列的方法来制备人源化抗体。本领域的技术人员可获取并熟悉免疫球蛋白的三维模型。计算机程序能够被用于阐释并展示所选的备选抗体序列的可能的三维构象结构。使用这种模型能够分析残基在需人源化的抗体的功能中的可能作用，即对影响备选抗体结合其抗原的能力的残基的分析。以此方式，能够从亲本抗体选择并组合FR残基用于接受的人源化抗体，从而实现所需的抗体特性。通常，为了抗原结合，在人源化抗体中保留来自亲本抗体(例如具有所需抗原结合性的啮齿类抗体)的抗原决定区(或超变区)的CDR中的残基。在某些实施方式中，在人源化抗体中保留来自亲本抗体的至少一个在可变FR中的额外残基。在某些实施方式中，在人源化抗体中可保留来自亲本抗体的多达6个在可变FR中的额外残基。
将来自免疫球蛋白的成熟重链和轻链的可变区的氨基酸分别标为Hx和Lx，其中x是表示根据卡巴特图(scheme of Kabat)(Sequences ofProteins of Immunological Interest，U.S.Department of Health and HumanServices，1987，1991)的氨基酸位置的编号。卡巴特对于每一亚类的抗体都列出了多种氨基酸序列，并且卡巴特对于该亚类中每一个残基位置还列出了形成共有序列的最常见的氨基酸。卡巴特使用指定法给所列序列中的每一个氨基酸指定一个残基号，这一指定残基编号的方法已经成为本领域中的标准。通过参考保守氨基酸来比对所研究的抗体与卡巴特中的一个共有序列，可以将卡巴特图扩展到其列表中所不包含的其它抗体。使用卡巴特编号体系可容易地确定不同抗体中等效位置上的氨基酸。例如，人类抗体的L50位上的氨基酸所占据的位置等效于小鼠抗体的氨基酸L50位。进而，通过使用卡巴特编号体系将一个抗体序列中的每一个氨基酸与另一序列中具有相同卡巴特编号的氨基酸比对，可以单独比对任意两种抗体序列，以例如确定同一性百分比。比对之后，如果将测试抗体区域(例如，重链或轻链的整个成熟可变区)与参比抗体的同一区域相比较，则测试抗体区域与参比抗体区域之间的序列同一性百分比是：测试抗体区域与参比抗体区域中均被相同氨基酸占据的位置数除以两个区域的经比对位置的总数(不计缺口)，再乘以100从而转换为百分比。
下文中的实施例1描述了示例性的抗DLL4的人源化抗体的制备，所述抗体可特异性结合本发明所公开的癌干细胞标记物人类DLL4(21M18 H9L2，ATCC保藏编号PTA-8427和21M18 H7L2，ATCC保藏编号PTA-8425，于2007年5月10日保藏；(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209 USA))。在某些实施方式中，所述人源化抗体包含来自鼠类单克隆抗体21M18的非人类抗原决定区。具体而言，在某些实施方式中，人源化的21M18抗体中保留有来自啮齿类亲本抗体的一种或多种以下重链CDR：CDR1(SEQ ID NO：1)、CDR2(SEQ ID NO：2；SEQID NO：3；或SEQ ID NO：4，其在卡巴特位52a发生改变)和CDR3(SEQ IDNO：5)。在某些实施方式中，人源化的21M18抗体中保留有来自啮齿类亲本抗体的一种或多种以下轻链CDR：CDR1(SEQ ID NO：9)、CDR2(SEQID NO：10)和CDR3(SEQ ID NO：11)。在某些实施方式中，人源化抗体在人类重链或轻链可变区内进一步包含至少一个FR取代。
在某些实施方式中，本发明提供了特异性结合人类DLL4表位的人源化抗体，所述表位由人类DLL4N-末端区域(SEQ ID NO：27)和人类DSL(SEQ ID NO：26)组合形成，其中所述抗体可影响肿瘤生长。在某些实施方式中，所述人源化抗体是完整的IgG抗体。在某些实施方式中，所述人源化抗体是完整的IgG2抗体。在某些实施方式中，所述人源化抗体是抗体片段。在某些实施方式中，所述人源化抗体是Fab片段。
在某些实施方式中，本发明的人源化抗体包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含非人类抗原决定区和人类可变框架区。在某些实施方式中，所述非人类抗原决定区包含啮齿类来源的互补性决定区(CDR)。某些实施方式中，所述非人类抗原决定区包括来自小鼠抗体的CDR。某些实施方式中，所述啮齿类CDR来源于单克隆抗体21M18，其中21M18含有命名为SEQ ID NO：6的重链可变区。在某些实施方式中，其中人源化抗体包含VH区，所述VH区包含(a)CDR1(SEQ ID NO：1)、CDR2(SEQID NO：2；SEQ ID NO：3；或SEQ ID NO：4)和CDR3(SEQ ID NO：5)或者(b)SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
在某些实施方式中，人类重链可变框架区包含被表达的人类序列。在某些实施方式中，所述人类可变框架区中至少一个残基被取代。在某些实施方式中，人类重链可变框架区中至少一个残基位于选自由位置16、20、27、28、38和48(基于卡巴特编号体系)组成的组的位置。在某些实施方式中，基于卡巴特编号体系的位置16、20、27、28、38和48被取代。在某些实施方式中，人类可变框架区中至少一个残基被在含有非人类抗原决定区的抗体中占据相应位置的残基取代。
在某些实施方式中，所述人类重链可变框架区含有IGH(V)1-18。在某些实施方式中，所述人类可变框架区中至少一个残基被取代。在某些实施方式中，人类重链可变框架区中至少一个残基位于选自由20H、28H、38H、48H和69H(基于卡巴特编号体系)组成的组的位置。在某些实施方式中，基于卡巴特编号体系的位置20H、28H、38H、48H和69H被取代。在某些实施方式中，人类可变框架区中至少一个残基被在含有非人类抗原决定区的抗体中占据相应位置的残基取代。
在某些实施方式中，本发明的人源化抗体包含轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含非人类抗原决定区和人类可变框架区。在某些实施方式中，所述非人类抗原决定区包包含啮齿类来源的CDR。在某些实施方式中，所述非人类抗原决定区包含来自小鼠抗体的CDR。在某些实施方式中，所述CDR来源于单克隆抗体21M18，其中21M18含有命名为SEQ ID NO：12的VL区。在某些实施方式中，VL区包含(a)CDR1(SEQ IDNO：9)、CDR2(SEQ ID NO：10)和CDR3(SEQ LD NO：11)或者(b)SEQ IDNO：12的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述人类轻链可变框架区含有IGK(V)4-1。在某些实施方式中，所述人类轻链可变框架区中的至少一个残基被取代。在某些实施方式中，所述人类可变框架区中的至少一个残基位于选自由位置22L和36L(基于卡巴特编号体系)组成的组的位置。在某些实施方式中，基于卡巴特编号体系的位置22L和36L被取代。在某些实施方式中，所述人类可变框架区中的至少一个残基被在含有非人类抗原决定区的抗体中占据相应位置的残基取代。
在某些实施方式中，本发明的抗体是对于与人类DLL4的特异性结合的抗体21M18竞争的抗体，其中抗体21M18包含：(a)具有命名为SEQID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的可变区的重链和(b)具有命名为SEQ ID NO：12的可变区的轻链。在某些实施方式中，所述抗体是人源化抗体或人类抗体。
在某些实施方式中，所述人源化抗体特异性结合人类DLL4表位，所述表位由人类DLL4N-末端区域(SEQ ID NO：27)和人类DSL(SEQ IDNO：26)组合形成，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8至少90％的序列同一性，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：12至少90％的序列同一性。在一些实施方式中，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：6、SEQID NO：7或SEQ ID NO：8至少95％的序列同一性，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：12至少95％的序列同一性。在一些实施方式中，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8至少99％的序列同一性，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：12至少99％的序列同一性。
在某些实施方式中，本发明提供了已分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码特异性结合人类DLL4表位的人源化抗体，所述表位由人类DLL4N-末端区域(SEQ ID NO：27)和人类DSL(SEQ ID NO：26)组合形成，其中所述抗体包含VH区，所述VH区包含编码CDR1(SEQ ID NO：1)、CDR2(SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；或SEQ ID NO：4)和CDR3(SEQID NO：5)的非人类抗原决定区、和编码IGH(V)1-18的人类可变框架区。在某些实施方式中，本发明提供了已分离的多核苷酸分子，所述多核什酸分子编码特异性结合人类DLL4表位的人源化抗体，所述表位由人类DLL4N-末端区域(SEQ ID NO：27)和人类DSL(SEQ ID NO：26)组合形成，其中所述多核苷酸分子选自由(a)和(b)组成的组：(a)是编码SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列的多核苷酸分子；(b)是在严格杂交条件下与(a)的多核苷酸分子的互补链(complement)杂交的多核苷酸分子。在某些实施方式中，本发明提供了已分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码特异性结合人类DLL4表位的人源化抗体，所述表位由人类DLL4N-末端区域(SEQ ID NO：27)和人类DSL(SEQ IDNO：26)组合形成，其中所述多核苷酸分子选自由以下(a)和(b)组成的组：(a)SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15；(b)在严格杂交条件下与(a)的多核苷酸分子的互补链杂交的多核苷酸分子。
在某些实施方式中，本发明提供了已分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码特异性结合人类DLL4表位的人源化抗体，所述表位由人类DLL4N-末端区域(SEQ ID NO：27)和人类DSL(SEQ ID NO：26)组合形成，其中所述抗体包含VL区，所述VL区包含编码CDR1(SEQ ID NO：9)、CDR2(SEQ ID NO：10)和CDR3(SEQ ID NO：11)的非人类抗原决定区、和编码IGK(V)4-1的人类可变框架区。在某些实施方式中，本发明提供了已分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码特异性结合人类DLL4表位的人源化抗体，所述表位由人类DLL4N-末端区域(SEQ ID NO：27)和人类DSL(SEQ ID NO：26)组合形成，其中所述多核苷酸分子选自由以下(a)和(b)组成的组：(a)编码SEQ ID NO：12的氨基酸序列的多核苷酸分子；(b)在严格杂交条件下与(a)的多核苷酸分子的互补链(complement)杂交的多核苷酸分子。在某些实施方式中，本发明提供了已分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码特异性结合人类DLL4表位的人源化抗体，所述表位由人类DLL4N-末端区域(SEQ ID NO：27)和人类DSL(SEQ ID NO：26)组合形成，其中所述多核苷酸分子选自由以下(a)和(b)组成的组：(a)SEQ ID NO：16；(b)在严格杂交条件下与(a)的多核苷酸分子的互补链杂交的多核苷酸分子。
在某些实施方式中，本发明提供了包含本发明的已分离的多核苷酸分子的表达载体。在某些实施方式中，本发明提供了包含含有本发明的已分离的多核苷酸分子的表达载体的宿主细胞。
在某些实施方式中，本发明提供了治疗患者的癌症的方法，所述方法包括对该患者施用治疗有效量的本发明所公开的人源化抗体。在某些实施方式中，所述癌症包括乳癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌或头颈部癌。
在某些实施方式中，本发明提供了包含容器及其中所含的组合物的试剂盒，其中所述组合物包含本发明所公开的人源化抗体，并进一步包含指示该组合物能够被用于治疗癌症的包装说明书(package insert)。
此外，可以使用本领域已知的各种技术来直接制备完整的人类抗体。可以产生经体外免疫的永生化人类B淋巴细胞或从能够生成针对靶抗原的抗体的经免疫个体中分离得到的永生化人类B淋巴细胞(参见，例如Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boemer等，1991，J.Immunol.，147(1)：86～95；和美国专利5,750,373)。而且，可以从其中表达人类抗体的噬菌体文库中选择人类抗体(Vaughan等，1996，Nat.Biotech.，14：309～314；Sheets等，1998，Proc.Nat′l.Acad.Sci.，95：6157～6162；Hoogenboom和Winter，1991，J.Mol.Biol.，227：381；Marks等，1991，J.Mol.Biol.，222：581)。还可以在含有人类免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制得人类抗体，所述人类免疫球蛋白基因座能够在没有内源性免疫球蛋白生成的情况下经免疫生成人类抗体的所有组成成员。该方法在美国专利5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016中有描述。
本发明还涵盖特异性识别癌干细胞标记物的双特异性抗体。双特异性抗体是能够特异性识别并结合至少两种不同表位的抗体。所述不同表位可以处在同一分子(例如，同一癌干细胞标记物多肽)中或者处在不同的分子上，使得例如所述抗体可以特异性识别并结合癌干细胞标记物以及例如1)诸如T细胞受体(例如CD3)或Fc受体(例如CD64、CD32或CD16)等白细胞上的效应分子，或者2)将在下文详述的细胞毒剂。双特异性抗体可以是完整的抗体或抗体片段。
示例性的双特异性抗体可以结合两种不同的表位，其中至少一个表位来自于本发明的多肽。作为选择，可以将免疫球蛋白分子的抗抗原臂与能够和诸如T细胞受体分子(例如，CD2、CD3、CD28或B7)或者IgG的Fc受体等白细胞上的触发分子结合的臂组合，以着眼于表达特定抗原的细胞的细胞防御机制。还可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂导至表达特定抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂和能够结合细胞毒剂或放射性核素螯合剂如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA的臂。制备双特异性抗体的技术在本领域内是常见的(Millstein等，1983，Nature 305：537～539；Brennan等，1985，Science 229：81；Suresh等，1986，Methods inEnzymol.121：120；Traunecker等，1991，EMBO J.10：3655～3659；Shalaby等，1992，J.Exp.Med.175：217～225；Kostelny等，1992，J.Immunol.148：1547～1553；Gruber等，1994，J.Immunol.152：5368；和美国专利5,731,168)。还设想有多于两价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体(Tutt等，J.Immunol.147：60(1991))。
在某些实施方式中，提供了抗体片段以例如提高肿瘤穿透性。已知有多种用于生成抗体片段的技术。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化来获得(例如，Morimoto等，1993，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24：107～117；Brennan等，1985，Science，229：81)。在某些实施方式中，抗体片段通过重组产生。Fab、Fv和scFv抗体片段都可以在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达并分泌，从而可以大量地生成这些片段。还可以从以上所讨论的抗体噬菌体文库中分离出所述抗体片段。抗体片段还可以是例如美国专利5,641,870中所述的线性抗体，并且可以是单特异性抗体或双特异性抗体。本领域技术人员清楚生成抗体片段的其它技术。
根据本发明，有各种技术适用于生成对本发明的多肽具有特异性的单链抗体(参见美国专利No.4,946,778)。另外，也有多种方法适用于构建Fab表达文库(Huse等，Science 246：1275～1281(1989))，以快速有效地鉴定对Notch受体配体DLL4或其衍生物、片段或同系物具有所需特异性的单克隆抗体Fab片段。可以通过本领域技术生成含有对本发明多肽的独特型的抗体片段，所述抗体片段包括但不限于：(a)通过抗体分子的胃蛋白酶消化而生成的F(ab′)2片段；(b)通过还原F(ab′)2片段的二硫桥而产生的Fab片段；(c)通过使用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而产生的Fab片段；和(d)Fv片段。
更理想的是，特别是在抗体片段的情况中，对抗体进行修饰以延长其血清半衰期。这可以通过例如以下方法来实现：通过抗体片段中适当区域的突变而将补救受体结合表位引入到抗体片段中，或者将所述表位引入到肽标签中，然后将肽标签融合到抗体片段的任一端或抗体片段的中间(例如通过DNA或肽合成)。
异源偶联抗体也在本发明的范围之内。异源偶联抗体由两个共价连接的抗体构成。已经提出例如利用这样的抗体将免疫细胞靶向到有害细胞上(美国专利No.4,676,980)。还设想到有，可以使用合成蛋白化学中已知的方法，包括涉及交联剂的方法体外制备所述抗体。例如，可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于该目的的适当试剂的例子包括亚氨基硫醇盐(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁酰亚胺酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
出于本发明的目的，应当理解的是经修饰的抗体可以包含使所述抗体和人类DLL4的多肽相关联的任何类型的可变区。在这方面，所述可变区可以包含或来自于可以被诱导而加强体液应答和产生抗所需的肿瘤相关抗原的免疫球蛋白的任何类型的哺乳动物。这样，经修饰抗体的可变区可以例如来源于人类、鼠类、非人类灵长动物(例如食蟹猴、猕猴等)或狼。在一些实施方式中，经修饰的免疫球蛋白的可变区和恒定区均是人类的可变区和恒定区。在其它实施方式中，相容性抗体(一般来自于非人类来源)的可变区可以改造或特异性定制以改善该分子的结合性能或减少该分子的免疫原性。在这方面，可以通过包含引入的氨基酸序列而使对本发明有用的可变区人源化或以其它方式使该可变区改变。
通过一个或多个CDR的至少部分置换可以同时改变重链和轻链中的可变区，并且如果需要，可以通过部分框架区置换和序列变化来进行所述改变。尽管CDR可以来自于与从中获得框架区的抗体的类别或者甚至是亚类相同的抗体，但是还应该看到，CDR可以来自于不同类别的抗体，优选来自于不同物种的抗体。可能不需要用来自供体可变区的全部CDR来置换所有的CDR以将一个可变区的抗原结合能力转移到另一个可变区。更合适的是，可以只需要转移对维持抗原结合位点活性所必需的那些残基。知道美国专利No.5,585,089、5,693,761和5,693,762中给出的说明后，本领域技术人员完全有能力通过实施常规的实验或通过试错测试法来获得免疫原性降低的功能性抗体。
虽然改变了可变区，但是本领域技术人员应当意识到，本发明的经修饰的抗体将包含这样的抗体或其免疫反应性片段，其中，当与具有近似相同免疫原性、包含天然或未改变的恒定区的抗体相比时，所述抗体中的一个或多个恒定区域的至少一部分已被删除或通过其它方式改变从而提供所需的生物化学特性，如增强的肿瘤定位或缩短的血清半衰期。在一些实施方式中，经修饰的抗体的恒定区包含人类恒定区。对与本发明相容的恒定区所进行的修饰包括在一个或多个域中有一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。即，本文所公开的经修饰的抗体可以包含三个重链恒定区(CH1、CH2或CH3)的一个或多个恒定区和/或轻链恒定区(CL)所进行的改变或修饰。在本发明的一些实施方式中，可以想到经修饰的恒定区中部分缺失或完全缺失一个或多个域。在一些实施方式中，经修饰的抗体包含其中已经去除了整个CH2域的域缺失构建体或变体(ΔCH2构建体)。在一些实施方式中，所省掉的恒定区域将被能够提供通常由缺失恒定区赋予的某些分子柔性的短氨基酸间隔子(例如10个残基)置换。
除了它们的构型之外，本领域已知的是，恒定区介导数种效应子功能。例如，补体的C1组分与抗体的结合活化补体体系。补体活化对细胞病原体的调理和裂解是重要的。补体活化还刺激炎性反应，并且还能够参与自身免疫超敏性。另外，抗体通过Fc区与细胞结合，其中抗体Fc区上的Fc受体位点结合到细胞上的Fc受体(FcR)。有大量的对不同类别抗体，包括IgG(γ受体)、IgE(η受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)具有特异性的Fc受体。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合会触发许多重要而多样的生物学应答，包括抗体包被颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞对抗体包被靶细胞的裂解(称为抗体依赖的细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎性介体的释放、免疫球蛋白生成的胎盘转移和控制。尽管各种Fc受体和受体位点已有一定程度的研究，但是对它们的定位、结构和功能还有很多未知之处。
虽然并不限制本发明的范围，但是据信包含如本文所述的经修饰的恒定区的抗体能够提供改变了的效应子功能，这反过来又影响了所施用抗体的生物学特性。例如，恒定区域的缺失或失活(通过点突变或其它方式)可以减少循环中的经修饰的抗体与Fc受体的结合，由此加强肿瘤的定位。在另外的情况中，与本发明吻合的是，恒定区修饰调节了补体结合并由此降低血清半衰期和偶联的细胞毒素的非特异性联合。另外，可以使用恒定区的其它修饰来消除二硫键或寡糖部分，从而使得可提高抗原特异性或抗体柔性，因此可以加强定位。类似地，可以使用本领域技术人员熟知的生物化学或分子工程技术来容易地实现根据本发明对恒定区所进行的修饰。
应当注意的是，经修饰的抗体可以被改造而将CH3域直接融合到相应的经修饰的抗体的铰链区。在另外的构建体中，可能希望在铰链区和经修饰的CH2和/或CH3域之间提供肽间隔子。例如，可以表达相容性构建体，其中CH2域已经缺失，并且余下的CH3域(修饰或未修饰的)通过5～20个氨基酸间隔子而被连接到铰链区上。可以增加这样的间隔子例如以确保恒定域的调控元件保持自由且是可接近的或者使铰链区保持柔性。然而，应当注意的是，在某些情况中，能够证实氨基酸间隔子具有免疫原性并能够诱发抗所述构建体的不需要的免疫应答。因此，加到所述构建体的任何间隔子应当相对无免疫原性，或者如果可以保持经修饰的抗体的所需生物化学性质，甚至可以完全省掉间隔子。
除了缺失整个恒定区域之外，应当理解的是，可以通过部分缺失或少量或者甚至是单个氨基酸的取代来提供本发明的抗体。例如，CH2域的所选区域中的单氨基酸突变可能足以显著降低Fc结合并由此加强肿瘤的定位。类似地，可能希望简单地缺失一个或多个恒定区域的可控制待调节的效应子功能(例如补体CLQ结合)的那一部分。恒定区的这种部分缺失可以改善抗体的所选特性(血清半衰期)同时保留与该恒定区域关联的其它所需功能的完整性。而且，如上文间接提到的，可以通过能够改善所得构建体特性的一个或多个氨基酸的突变或取代来修饰所公开的抗体的恒定区。在这方面，有可能可以破坏由保守的结合位点提供的活性(例如Fc结合)，同时基本保持经修饰的抗体的构型和免疫原性特性。某些实施方式可以包含添加一个或多个氨基酸到恒定区，以增强所需特性如效应子的功能，或者提供更多的细胞毒素或碳水化合物吸附。在这样的实施方式中，可能希望插入或复制来自所选恒定区域的特异性序列。
本发明还包括基本与本文提出的嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体或它们的抗体片段同源的变体和等效物。这些变体或等效物可以含有例如保守取代突变，即一个或多个氨基酸被相似的氨基酸取代。例如，保守取代是指一个氨基酸被同一大类内的另一个氨基酸取代，例如一个酸性氨基酸被另一个酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸被另一个碱性氨基酸取代，或者一个中性氨基酸被另一个中性氨基酸取代。保守氨基酸取代的目的在本领域内是公知的。
本发明还涉及包含偶联到细胞毒剂的抗体的免疫偶联物。细胞毒剂包括化疗剂、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)、放射活性同位素(即，放射性偶联物)等。可用于产生所述免疫偶联物的化疗剂包括例如氨甲喋呤、阿霉素、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其它嵌入剂。可用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链、篦麻毒素A链、相思豆毒素A链、莫迪素A链、α-帚曲菌素(α-sarcin)、油桐蛋白(Aleurites fordii protein)、石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂(momordica charantiainhibitor)、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂(sapaonaria officinalisinhibitor)、白树毒蛋白、丝裂蛋白(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素、和单端孢霉烯族化合物(tricothecene)。在一些实施方式中，可以使用多种周知的螯合剂或指引标签中的任一种将所述抗体与放射性同位素偶联，放射性同位素例如有90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re。在其它实施方式中，本发明所公开的组合物可以包含与药物、前药或如干扰素等淋巴因子偶联的抗体。可以使用以下物质制备抗体与细胞毒剂的偶联物：各种双官能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-2-(吡啶二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基四氢噻吩(IT，iminothiolane)、亚胺酯的双官能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯HCL)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-二氮鎓衍生物(如双-(对二氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如亚甲苯基2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。还可以使用抗体和一种或多种小分子毒素的偶联物，所述小分子毒素例如为刺孢霉素、美登醇(maytansinoid)、单端胞菌毒素(trichothene)和CC1065以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物。在一些实施方式中，可以将经修饰的抗体与其它免疫活性配体(例如抗体或其片段)复合，其中所得到的分子可以同时结合瘤细胞和如T细胞等效应细胞。
无论获得多么有用的量，都可以以众多偶联形式(即，免疫偶联物)或未偶联形式中的任意一种使用本发明的抗体。作为选择，本发明的抗体可以以非偶联形式或“裸露”形式使用以利用受试对象的天然防御机制，包括补体依赖的细胞毒性(CDC)和抗体依赖的细胞毒性(ADCC)来消除恶性细胞。选择使用偶联或未偶联的修饰抗体将取决于癌症的类型和所处的阶段、辅助治疗(例如化学疗法或外部辐射)的使用和患者的状况。应当理解的是，本领域技术人员根据本文的教导能够容易地作出这样的选择。
可以通过本领域任意已知方法测定本发明的抗体的免疫特异性结合。可以使用的免疫测定法包括但不限于使用诸如BIAcore分析法、FACS分析法、免疫荧光法、免疫细胞化学法、Western印迹法、放射性免疫测定法、ELISA、“夹心”免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应法、凝胶扩散沉淀素反应法、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体固定测定法、免疫放射分析测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法等技术的竞争性和非竞争性测定体系。这样的测定法是本领域内的常规和公知方法(见例如Ausubel等编，1994，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York，在此通过参考的方式将其全部引入本文)。
在一些实施方式中，使用ELISA来确定抗癌干细胞标记物的抗体的免疫特异性。ELISA测定法包括制备抗原、用抗原包被96孔微量滴定板的板孔，向板孔中加入偶联到可检测化合物如酶促底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的抗癌干细胞标记物的抗体，温育一段时间并检测抗原的存在。在一些实施方式中，抗癌干细胞标记物的抗体不与可检测化合物偶联，而是替代性地向板孔中加入与能够识别该抗癌干细胞标记物的抗体的第二偶联抗体。在一些实施方式中，不用抗原包被板孔，而是可以用抗癌干细胞标记物的抗体包被板孔并在向经包被的板孔中加入抗原后加入与可检测化合物偶联的第二抗体。本领域技术人员应当知道，可改变参数而加强被检测的信号以及本领域已知的其它ELISA变化(见例如Ausubel等编，1994，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York，于11.2.1)。
可以通过竞争性结合测定法来确定抗体与癌干细胞标记物抗原的结合亲和力以及抗体-抗原相互作用的解离速率。竞争性结合测定法的一个例子是放射性免疫测定法，该方法包括在未标记抗原的量不断增加的情况下，将经标记的抗原(例如3H或125I)或其片段或变体与感兴趣的抗体温育，然后检测结合到经标记的抗原的抗体。可以通过scatchard作图分析由数据确定抗癌干细胞标记物的抗体的亲和力和结合解离速率。在一些实施方式中，使用BIAcore动力学分析来确定抗癌干细胞标记物的抗体的结合和解离速率。BIAcore动力学分析包括分析抗体与表面上固定有癌干细胞标记物抗原的芯片的结合和解离。
在某些实施方式中，本发明涵盖经分离的多核苷酸，该多核苷酸编码含有抗人类DLL4的抗体或其片段的多肽。因此，术语“编码多肽的多核苷酸”涵盖仅包含该多肽的编码序列的多核苷酸和包含额外的编码序列和/或非编码序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以为RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链或单链，如果是单链，其可以是编码链或非编码链(反义链)。
本发明还涉及以上所述编码例如片段、类似物和衍生物的多核苷酸的变体。多核苷酸的变体可以是该多核苷酸天然存在的等位基因变体或该多核苷酸的非天然存在的变体。在某些实施方式中，多核苷酸可以具有这样的编码序列，该编码序列是所公开的多肽的编码序列的天然存在的等位基因变体。如本领域已知的，等位基因变体是多核苷酸序列的具有例如一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加但是没有实质改变所编码多肽的功能的替代性形式。
在某些实施方式中，多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，该编码序列在同一阅读框中融合于有助于例如在宿主细胞中表达和分泌多肽的多核苷酸(例如用作控制多肽从细胞中转运的分泌序列的前导序列)。具有前导序列的多肽是一种前体蛋白，所具有的前导序列可被宿主细胞切除以形成成熟形式的多肽。多核苷酸还可以编码这样的前体蛋白，该前体蛋白是成熟蛋白加上额外的5′氨基酸残基。具有前体序列的成熟蛋白是一种前体蛋白，并且是该蛋白的非活性形式。切除前体序列后，留下的即是具有活性的成熟蛋白。
在某些实施方式中，多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，该编码序列在同一阅读框中融合于可以用于例如纯化所编码多肽的标记序列。例如，在细菌宿主的情况中，该标记序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标签以纯化与该标记融合的成熟多肽，或者，当使用哺乳动物宿主(例如COS-7细胞)时，该标记序列可以是源自于流感血凝素蛋白的血凝素(HA)标签。
在某些实施方式中，本发明提供了已分离的核酸分子，该核酸分子所具有的核苷酸序列与编码含有抗人类DLL4的抗体或其片段的多肽的多核苷酸具有至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同性、至少95％的同一性，在一些实施方式中，具有至少96％、97％、98％或99％的同一性。
具有与对照核苷酸序列的“同一性”为例如至少95％的核苷酸序列的多核苷酸是指，除了多核苷酸序列可包含至多5个点突变/100个对照核苷酸序列的核苷酸之外，多核苷酸的核苷酸序列与对照序列是相同的。换言之，为了获得具有与对照核苷酸序列的同一性为至少95％的核苷酸序列的多核苷酸，对照序列中至多有5％的核苷酸可以缺失或被另外的核苷酸取代，或者占对照序列中总核苷酸的至多5％的数量的核苷酸可以插入到对照序列中。对照序列的这些突变可以发生在对照核苷酸序列的氨基末端位置或羧基末端位置，或者这些末端位置之间的任意位置，或者单个地散布在对照序列的核苷酸之中，或者以一个或多个相邻的组存在在对照序列中。
作为一种实际情况，可以使用已知的计算机程序如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，用于Unix的第8个版本，GeneticsComputer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)，常规确定任何特定核酸分子是否与对照序列具有至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性，在一些实施方式中，是否具有至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。Bestfit使用Smith和Waterman(Advances in Applied Mathematics 2：482489(1981))内局部同源性算法来找到两条序列之间的最佳同源性片段。当使用Bestfit或其它任意的序列比对程序来确定一条特定的序列是否与本发明的对照序列具有例如95％的同一性时，可设置参数从而能够在全长的对照核苷酸序列上计算同一性百分比并允许有占对照序列的核苷酸总数的至多5％的同源性缺口。
多核苷酸变体可以在编码区和/或非编码区中含有变化。在一些实施方式中，多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加或缺失但不改变所编码多肽的性质或活性的变化。在一些实施方式中，利用遗传密码子的简并性由沉默取代产生核苷酸变体。可以根据各种理由，例如优化用于特定宿主的密码子表达(将人类mRNA中的密码子改变为细菌宿主如大肠杆菌偏好的密码子)来产生多核苷酸变体。
本发明的多肽可以是包含抗人类DLL4的抗体或其片段的重组多肽、天然多肽或合成多肽。本领域中应当知道的是，可以改变本发明的一些氨基酸序列而不明显影响蛋白的结构或功能。因此，本发明还包括显示出基本活性的多肽变体或者包含抗人类DLL4蛋白的抗体或其片段的区域的多肽变体。这样的突变体包括缺失、插入、倒位、重复和典型取代(typesubstitution)。
多肽和类似物可以被进一步修饰以含有额外的化学部分(蛋白的非常见部分)。这些衍生部分可以改善蛋白的溶解度、生物学半衰期或吸收性。所述部分还可以减少或消除蛋白等的任意所需的副作用。有关这些部分的综述可以在REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第20版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(2000)找到。
本文所述的分离的多肽可以通过本领域已知的任意适当的方法制备。所述方法包括从蛋白直接合成法到构建编码经分离的多肽序列的DNA序列并将这些序列表达在适当的经转化宿主中表达。在一些实施方式中，利用重组技术通过分离或合成编码感兴趣的野生型蛋白的DNA序列来构建DNA序列。可选的是，可以通过定点诱变来诱变所述序列以提供该序列的功能类似物。见例如Zoeller等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 81：5662～5066(1984)和美国专利No.4,588,585。
在一些实施方式中，使用寡核苷酸合成仪通过化学合成来构建编码感兴趣的多肽的DNA序列。可以基于所需多肽的氨基酸序列并选择用来产生感兴趣的重组多肽的宿主细胞偏好的那些密码子来设计这样的寡核苷酸。可以应用标准方法来合成编码感兴趣的分离的多肽的分离的多核苷酸序列。例如，可以使用完整的氨基酸序列来构建回译的基因(back-translated gene)。另外，可以合成含有用于编码分离的特定多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，可以合成用于编码所需多肽的各部分的数条短的寡核苷酸然后进行连接。各条寡核苷酸通常含有用于互补组装的5′或3′突出末端。
一旦组装(通过合成、定点诱变或其它方法)，编码感兴趣的分离的特定多肽的多核苷酸序列将被插入到表达载体中，并被可操纵地连接到适用于使所述蛋白在所需宿主中表达的表达控制序列。可以通过核苷酸测序、限制图谱、生物活性多肽在适当的宿主中的表达来证实组装的正确性。如本领域所公知的，为了在宿主中获得转染基因的高表达水平，该基因必须可操纵地连接到在所选表达宿主中具有功能的转录和翻译表达控制序列。
使用重组表达载体来扩增和表达编码癌干细胞标记物多肽融合体的DNA。重组表达载体是可复制DNA构建体，其具有编码癌干细胞标记物多肽融合体或生物等效类似物的合成DNA片段或cDNA来源的DNA片段，所述融合体或生物等效类似物可操纵地连接到来自于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的适当的转录或翻译调控元件。转录单位一般包括以下物质的组装体：(1)在基因表达中具有调控作用的一个或多个基因元件，例如转录启动子或增强子，(2)可转录成mRNA并翻译成蛋白的结构序列或编码序列，和(3)适当的转录和翻译启始和终止序列，如上文所详细描述的序列。这些调控元件可以包括控制转录的操纵子序列。可以额外引入在宿主中复制的能力(一般由复制起点提供)和便于识别转化体的选择基因。当各DNA区在功能上相互关联时，将它们可操纵地进行连接。例如，在其作为参与多肽分泌的前体表达时，信号肽的DNA序列(分泌性前导序列)被可操纵地连接到多肽的DNA；在启动子控制序列转录时，启动子被可操纵地连接到编码序列；或者在核糖结合位点被定位以允许翻译时，核糖结合位点被可操纵地连接到编码序列。通常，可操纵地连接意味着是相邻的，并且在分泌性前导序列的情况中意味着相邻的且位于阅读框内。拟用在酵母表达体系中的结构元件包括能够使得宿主细胞进行所翻译的蛋白的胞外分泌的前导序列。作为选择，在表达无前导序列或转运序列的重组蛋白的情况下，所述结构元件可以包括N-末端甲硫氨酸残基。该残基随后可以任选从所表达的重组蛋白上切除以提供最终的产物。
表达控制序列和表达载体的选择取决于宿主的选择。可以采用多种不同的表达宿主和/或载体组合。用于真核宿主的有用表达载体包括例如含有来自SV40、牛乳头状瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。用于细菌宿主的有用表达载体包括已知的细菌质粒(如来自大肠杆菌的质粒，包括pCR 1、pBR322、pMB9及其衍生物)、更大范围宿主质粒(如M13)和丝状单链DNA噬菌体。
适用于表达癌干细胞标记物蛋白的宿主细胞包括受适当启动子控制的原核生物、酵母、昆虫或高级真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或芽孢杆菌(bacilli)。高级真核细胞包括如下文所述的哺乳动物来源的已确立的细胞系。也可以采用无细胞翻译体系。细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主适用的克隆和表达载体如Pouwels等所述(Cloning Vectors：A Laboratory Manual，Elsevier，N.Y.，1985)，在此通过参考的方式将其相关的公开内容引入本文。
还可以有利地采用各种哺乳动物或昆虫细胞培养体系来表达重组蛋白。可以在哺乳动物细胞中表达重组蛋白，因为这样的蛋白一般能够被正确地折叠、适当的修饰并具有完整的功能。适当的哺乳动物宿主细胞系的例子包括如Gluzman(Cell 23：175，1981)所述的猴肾细胞的COS-7细胞系和能够表达适当载体的其它细胞系，包括例如L细胞、C 127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可以包含连接到待表达基因的非转录元件如复制起点、适当的启动子和增强子、和其它5′或3′侧翼非转录序列以及5′或3′非翻译序列，如必需的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪切供体和受体位点以及转录终止序列。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白的杆状病毒体系见Luckow和Summers的综述(Bio/Technology 6：47(1988))。
可以根据任意适当的方法纯化由经转化宿主产生的蛋白。这样的标准方法包括色谱法(例如离子交换色谱法、亲和色谱法和分级柱色谱法)、离心、差异溶解度法或用于蛋白纯化的任意其它标准方法。可以将诸如六组氨酸、麦芽糖结合域、流感被膜序列(influenza coat sequence)和谷胱甘肽-S-转移酶等亲合标签连接到蛋白上以易于通过适当亲和柱进行过柱纯化。还可以使用蛋白水解、核磁共振和x射线晶体法等技术对所分离的蛋白进行物理表征。
例如，首先可以使用可商购获得的蛋白浓缩过滤器例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元来浓缩来自将重组蛋白分泌到培养基中的体系的上清液。在浓缩步骤之后，可以将浓缩液加到适当的纯化基质中。作为选择，可以采用阴离子交换树脂，例如聚有悬附的二乙基氨基乙基(DEAE)基团的基质或基材。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或在蛋白纯化中常用的其它类型。作为选择，可以采用阳离子交换步骤。适当的阳离子交换剂包括含有磺基丙基或羧甲基的各种不溶性基质。最后，可以采用使用疏水性反相高效液相色谱(RP-HPLC)介质(例如具有悬附的甲基或其它脂肪族基团的硅胶)的一个或多个反相高效液相色谱步骤来进一步纯化癌干细胞蛋白-Fc组合物。也可以采用某些或所有前述纯化步骤的各种组合来提供同源性重组蛋白。
可以例如通过从细胞沉淀中的初始提取，然后进行一个或多个浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤来分离细菌培养物中生成的重组蛋白。可以用高效液相色谱(HPLC)来进行最后的纯化步骤。可以通过任何常规方法来破碎表达重组蛋白所用的微生物细胞，所述方法包括循环冻融法、超声法、机械破碎法或使用细胞裂解剂的方法。
本发明提供了抑制表达癌干细胞标记物的致瘤性细胞的生长的方法，该方法使用抗本文所述的癌干细胞标记物的抗体。在某些实施方式中，所述抑制表达癌干细胞标记物的致瘤性细胞的生长的方法包括在体外使所述细胞与抗癌干细胞标记物的抗体接触。例如，将表达癌干细胞标记物的永生化细胞系或癌细胞系在培养基中培养，该培养基添加有抗所表达的癌干细胞标记物的抗体以抑制细胞的生长。在一些实施方式中，从例如组织活检样品、胸腔积液或血液样品等患者样品中分离出含有肿瘤干细胞的肿瘤细胞，并将其培养在培养基中，该培养基添加有抗癌干细胞标记物的抗体以抑制细胞的生长。
在一些实施方式中，抑制表达癌干细胞标记物的致瘤性细胞的生长的方法包括在体内使所述细胞与抗癌干细胞标记物的抗体接触。在某些实施方式中，在动物模型中使致瘤性细胞与抗癌干细胞标记物的抗体接触。例如，使表达癌干细胞标记物的异种移植体在免疫低下的小鼠(例如NOD/SCID小鼠)中生长，该小鼠被施用抗癌干细胞标记物的抗体以抑制肿瘤的生长。在一些实施方式中，从例如组织活检样品、胸腔积液或血液样品等患者样品中分离出表达癌干细胞标记物的癌干细胞，并将其注射到免疫低下的小鼠中，然后对该小鼠施用抗癌干细胞标记物的抗体以抑制肿瘤细胞的生长。在一些实施方式中，在将致瘤性细胞导入动物中的同时或之后的短时间内施用抗癌干细胞标记物的抗体以防止肿瘤的生长。在一些实施方式中，在致瘤性细胞已生长到一定尺寸之后将抗癌干细胞标记物的抗体作为治疗物施用。
本发明还提供了包含靶向癌干细胞标记物的抗体的药物组合物。所述药物组合物可以用于抑制肿瘤细胞生长和治疗人类患者的癌症。
通过将本发明的纯化抗体与药用载质(例如载体、赋形剂)组合来制备用于保存和使用的制剂(Remington，The Science and Practice ofPharmacy(第20版)Mack Publishing，2000)。适当的药用载质包括但不限于非毒性缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；诸如氯化钠等盐；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量多肽(例如小于约10个氨基酸残基)；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、麦芽糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和非离子表面活性剂，如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。
可以以众多方式中的任意方式施用本发明的药物组合物以用于局部治疗或全身治疗。施用可以是局部施用(例如粘膜施用，包括阴道输送和直肠输送)，如采用透皮贴剂，软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液剂和粉剂的施用；肺部施用(例如通过粉末或气溶胶的吸入或吹入，包括使用喷雾器的施用；气管内、鼻内、表皮和透皮施用)；口服施用；或胃肠外施用，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内的注射或输注；或颅内(例如鞘内或脑室内)施用。
所述治疗制剂可以是单位剂量形式。所述制剂包括用于口服、肠胃外施用、直肠施用或通过吸入施用的片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、在水中或非水性介质中的溶液剂或悬浮剂、或者栓剂。在诸如片剂等固体组合物中，可以将主要活性组分与药物载体混合。常规压片成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸氢二钙或树胶，以及其它稀释剂(例如水)，以形成含有本发明化合物或其非毒性药用盐的均相混合物的固体前制剂组合物。然后将所述固体前制剂组合物再分为上述类型的单位剂量形式。可以对所述新型组合物的片剂、丸剂等进行包衣，或者进行其它方式的混配而提供具有长效优点的剂量形式。例如，所述片剂或丸剂可以包含由外部组分包被的内部组合物。而且，所述两种组分可以由肠溶层隔开，该肠溶层起到耐崩解并使内部组分能够完好地通过胃部或者延缓释放的作用。有各种材料可以用于所述肠溶层或包衣，这样的材料包括众多聚合物酸和聚合物酸的混合物，这样的材料例如为虫胶、十六烷基醇和醋酸纤维素。
药物制剂包括与脂质体复合的本发明抗体(Epstein等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688；Hwang等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4030；和美国专利4,485,045和4,544,545)。美国专利5,013,556中公开了具有延长的循环时间的脂质体。有些脂质体可以通过使用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物的反相蒸发来制备。脂质体可以通过具有确定的孔径的过滤器挤出而获得具有所需直径的脂质体。
所述抗体还可以包封在微胶囊中。这样的微胶囊可通过例如凝聚技术或界面聚合来制备，例如分别为在胶质药物输送体系(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗滴乳状液中的羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，如在Remington，TheScience and Practice of Pharmacy(第20版)Mack Publishing(2000)中所述。
此外，可以制备缓释制剂。缓释制剂的适当例子包括含有所述抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质为成型品形式(例如膜或微胶囊)。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸-2-羟基乙基酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、非降解性乙烯-乙酸乙烯酯、降解性乳酸-乙醇酸共聚物(如LUPRON DEPOT TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)、蔗糖乙酸异丁酸酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸)。
在一些实施方式中，治疗包括联合施用本发明抗体和化疗剂或多种不同化疗剂的混合物。以抗体进行的治疗可以在施用化疗药物之前、同时或之后进行。本发明想到的化疗药物包括本领域已知并且可以商购获得的化学物质或药物，例如多柔比星、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、塞替派、白消安、细胞毒素(Cytoxin)、红豆杉醇、氨甲蝶呤、顺铂、美法仑、长春碱和卡铂。联合施用可以包括共施用和依次施用，所述共施用可以是单种药物制剂的施用，也可以是使用分开的制剂的施用，所述依次施用可以是以任意顺序的施用，但通常是在一定的时间内依次施用，以使所有的活性剂能够同时发挥它们的生物学活性。所述化疗剂的制剂和给药方案可以根据制造商的说明书使用，或者由熟练从业者根据经验确定。所述化学疗法的制剂和给药方案在ChemotherapyService Ed.，M.C.Perry，Williams和Wilkins，Baltimore，Md.(1992)中也有描述。
在本发明的某些实施方式中，所述治疗涉及联合施用本发明的抗体和第二治疗剂。这里所用的“第二治疗剂”包括但不限于化学治疗剂、放射疗法、细胞因子和抗其它肿瘤相关抗原的抗体。
在另外的实施方式中，治疗包括本发明抗体和放射疗法的联合施用。以抗体进行的治疗可以在实施放射疗法之前、同时或之后进行。可以根据熟练从业者确定使用所述放射疗法的任何给药方案。
在另外的实施方式中，治疗可以包括本发明的抗体和抗其他肿瘤相关抗原的其它抗体的联合施用，所述其它抗体包括但不限于与EGF受体(EGFR)(![]()
)、erbB2受体(HER2)(![]()
)和血管内皮生长因子(VEGF)(![]()
)结合的抗体。而且，治疗可以包括一种或多种细胞因子的施用，该治疗可以伴随癌细胞的手术去除或治疗医生认为必要的其它任何治疗。
对于疾病的治疗，本发明抗体的适当剂量取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重性和进程、疾病的响应性、施用该抗体的目的是治疗性目的还是预防性目的、先前的疗法、患者的临床病史等，所有这些都依赖于治疗医生的判断。抗体可以施用一次，也可以在持续数天至数月的系列治疗中施用，或施用直至实现痊愈或者达到疾病状态的消减(例如肿瘤尺寸的减小)。优化给药方案可以根据患者体内的药物累积的测量结果来计算，并且可以根据个别抗体的相对效力的不同而改变。主治医生可以容易地确定最优剂量、给药方法和重复频率。剂量通常为0.01μg/kg体重～100mg/kg体重，并且可以每天、每周、每月或每年施用一次或多次。治疗医生可以根据所测量的药物在体液或组织中的滞留时间和浓度来估算给药的重复频率。
本发明提供了包含本文所述的抗体并可以用以实施本文所述方法的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒包含位于一个或多个容器中的抗癌干细胞标记物的至少一种纯化抗体。在一些实施方式中，所述试剂盒包含进行检测测定必需的和/或足以进行该检测测定的所有组分，包括所有的对照、进行测定的说明以及用于结果分析和展示的任何必需软件。本领域技术人员应当容易地知道，本发明公开的抗体可以容易地加入到本领域公知的已确立的试剂盒形式之一中。
本发明所公开的实施方式可以通过参考以下实施例得到进一步的说明，所述实施例详细地描述了本发明所公开的抗体的制备以及本发明所公开的抗体的使用方法。本领域技术人员可清楚地知道，可以在不背离本公开内容范围的情况下对材料和方法进行诸多改变。相同的附图标记在整个附图中都尽可能地用以表示相同或相似的部分。本文和所附权利要求书中所用的单数形式“一”、“或者”和“该”包括所指对象的复数形式，但上下文清楚指出的除外。因此，例如，提及“一种抗体”时，是指包括所述抗体的复数形式或者一种或多种抗体及其等效物，这种等效物是本领域技术人员已知的。此外，除非另有说明，否则本说明书中所用的表示成分、反应条件、纯度、多肽和多核苷酸长度等等的量的所有数字均以词“大约”或“约”修饰。因此，本说明书和权利要求书中所述的数值参数是可以根据本发明的所需性质而变化的近似值。
实施例
实施例1 单克隆DLL4抗体和人源化DLL4抗体的制备
抗原制备
制备人类DLL4的胞外域的重组多肽片段作为抗体制备用抗原。使用标准重组DNA技术来分离编码DLL4的第1～522号氨基酸(SEQ IDNO：25)的多核苷酸。该多核苷酸以框架内N-末端连接到人类Fc标签或组氨酸标签上，并克隆到转运质粒载体中，以在昆虫细胞中进行杆状病毒介导的表达。使用标准的转染、感染和细胞培养程序来制得表达相应DLL4多肽的重组昆虫细胞(O′Reilley等，Baculovirus expression vectors：A Laboratory Manual，Oxford：Oxford University Press(1994))。
使用切割预测软件SignalP 3.0来模拟人类DLL4的内源性信号序列的切割，但是实际的体内切割点可能由于任一方向的氨基酸偶联而不同。DLL4的预测切割位于第1～26号氨基酸之间，因此DLL4抗原蛋白包含约第27号氨基酸～第522号氨基酸。使用蛋白A和Ni++螯合亲和色谱法从昆虫细胞条件培养基中纯化出抗原蛋白。随后将经纯化的抗原蛋白用PBS(pH＝7)进行透析、浓缩至约1mg/ml，并无菌过滤成免疫用制剂。
免疫
使用标准技术以经纯化的DLL4抗原蛋白(Antibody Solutions；Mountain View，CA)免疫小鼠(n＝3)。在初次免疫后约70天，采用ELISA和FACS分析来筛查个体小鼠的血液对抗原的识别(如下详述)。选择抗体滴度最高的两只动物进行最后的抗原加强免疫，之后分离出脾细胞用于杂交瘤制备。将杂交瘤细胞在96孔板中按1个细胞/孔铺板，通过ELISA和FACS分析将每个板孔的上清液针对抗原蛋白进行筛查。选择数个抗体滴度高的杂交瘤并在静态培养用瓶中扩大培养。使用蛋白A或蛋白G琼脂糖色谱法从杂交瘤上清液纯化出抗体。经纯化的单克隆抗体用FACS再次检测并进行同种型分析以选择IgG和IgM抗体。
FACS分析
为了选择由杂交瘤克隆生成的识别天然细胞表面DLL4蛋白的单克隆抗体，采用了FACs分析。以编码DLL4的全长cDNA克隆和转染标记物GFP的表达载体共转染HEK293细胞。转染后24～48小时，收集悬液中的细胞并在冰上与抗DLL4的抗体或用以检测背景抗体结合的对照IgG温育。洗涤细胞，用偶联有荧光发色团的抗小鼠的二抗检测一抗。然后通过FACS分选经标记的细胞，以鉴定特异性识别天然细胞表面DLL4蛋白的细胞表面表达的抗DLL4的抗体。单克隆抗体21M14和21M18识别经转染细胞上的DLL4(图1)。产生鼠类单克隆抗体21M18的杂交瘤细胞系已于2007年9月28日保藏在美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)(ATCC)，保藏编号为PTA-8670。
接下来利用流式细胞术确定了抗DLL4的抗体干扰DLL4和Notch之间相互作用的能力。将以DLL4 cDNA稳定转导的HEK 293细胞与Notch1-EGF10-15-Fc+抗DLL4的抗体、Notch1-EGF1O-15-Fc+对照抗体、对照蛋白-Fc+抗DLL4的抗体或对照蛋白-Fc+对照抗体温育。通过PE-偶联的山羊抗Fc抗体和流式细胞术检测了Fc融合蛋白与表达DLL4的细胞的结合。这样通过荧光强度的降低确定了抗DLL4的抗体对Notch与DLL4的结合的抑制能力。如图2A所示，以鼠类抗体21M14和21M18观察到了Notch结合的抑制，而21M12则没有。此外，鼠类抗体21M18特异性结合人类DLL4(但不特异性地结合鼠类DLL4)，并且阻断人类DLL4(而非鼠类DLL4)与表达Notch1的细胞的结合(图2B)。这些数据表明，在异种移植物实验中，21M18靶向肿瘤细胞上表达的人类DLL4而非脉管系统上所表达的鼠类DLL4。
表位作图
为了鉴定能够识别DLL4胞外域的特定区域的抗体，进行了表位作图。使用标准重组DNA技术，制备了在编码融合于Fc蛋白的DLL4胞外域的嵌套系列缺失片段的多核苷酸上游包含CMV启动子的哺乳动物表达质粒载体。同样使用标准重组DNA技术，制备了编码融合于Fc蛋白的作为人类和鼠类DLL4的嵌合体的DLL4片段的其它构建体。还设计了另一系列的包括特定氨基酸取代的DLL4-fc融合蛋白。在瞬时转染的HEK 293细胞中表达这些重组融合蛋白，并在转染后24小时～48小时从中收集条件培养基以用于ELISA。DLL4融合蛋白片段被捕集在包被有抗人类Fc抗体的板上。随后使抗DLL4的抗体与被结合的DLL4片段相互作用，并通过随后与HRP偶联的抗小鼠抗体的温育和检测HRP活性来测定结合(图3A)。如图3所示，鼠类单克隆抗体21M14和21M18识别DLL4的第1～217号氨基酸内所含的表位。这一区域含有存在于数种Notch配体中的名为“DSL(δ/锯齿状/延迟-2(Delta/Serrate/lag-2))”域的基序(Tax等，1994，Nature 368：150-4)。此外，通过western印迹分析检验了抗DLL4的mAb与DLL4融合蛋白片段的结合(图3B)。这一工作表明，在氨基酸155-217中的DSL域存在时，21M18与氨基酸1-154中的DLL4发生人类特异性结合。这表明了这一N-末端序列对DLL4功能的重要性，这种重要性是此前未意识到的。以图示形式对这一工作进行了归纳(图3C)，分别以“+”或“-”表示21M18的结合或未结合。通过检验21M18与一系列DLL4蛋白片段(DLL4域1-6)的结合进一步表征了21M18的结合，所述一系列DLL4蛋白片段含有以相应鼠类氨基酸交换人类DLL4氨基酸的特定氨基酸取代。通过ELISA筛查了这些融合蛋白对21M18的结合。鉴定表明数个位置对21M18结合是重要的(如图3D所示)。对在氨基酸位68、69和71(替代缬氨酸、缬氨酸和脯氨酸)或氨基酸位142和144(替代赖氨酸和丙氨酸)有取代的DLL4蛋白片段，21M18表现出结合减弱。相反，一个独特的抗体21M21结合DSL区中所含的表位(图3E)，但如图6所示，这一抗体并不影响DLL4的功能，这表明与DSL结合的抗体不意味着是功能性抗体。
嵌合抗体
鉴定特异性识别DLL4的单克隆抗体后，修饰这些抗体以克服在使用啮齿类抗体作为治疗剂时的人类抗小鼠抗体(HAMA)免疫应答。在某些实施方式中，通过RT-PCR从杂交瘤细胞分离所选单克降抗体的重链和轻链的可变区，并将该可变区分别框架内连接到哺乳动物表达载体中的人类IgG1重链和κ轻链恒定区。作为选择，使用诸如TCAE 5.3等人类Ig表达载体，该载体含有在同一质粒上的人类IgG1重链和κ轻链恒定区基因(Preston等，1998，Infection & Immunity 66：4137～42)。然后将编码嵌合重链和轻链的表达载体共转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞以制备嵌合抗体。通过ELISA和FACS比较嵌合抗体与亲本鼠类抗体的免疫反应性和亲和力。
人源化抗体
在某些实施方式中，制备了抗DLL4的人源化抗体。使用简并PCR从杂交瘤株中分离鼠类单克隆抗体21M18的可变域并测序，这一过程基本如Larrick，J.M.等(1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.160：1250)以及Jones，S.T.和Bendig，M.M.(1991，Bio/Technology 9：88)所述。随后选取可能与亲本21M18抗体氨基酸序列的结构性相似的人类重链和轻链可变框架区作为用于人源化的人类框架区。为了鉴定备选的人类框架区，使用BLAST对Genbank中存储的人类序列进行搜索，比较所预测的由21M18的VH和VL鼠类可变域编码的蛋白质序列和由所表达的人类cDNA编码的人类抗体序列。利用这种方法，选择所表达的人类cDNA序列(例如genbank AY393019，DC295533)在设计重链框架中作进一步分析。
对备选的人源化框架重链和亲本鼠类单克隆抗体21M18重链之间的氨基酸差异的可能重要性进行了评估，对每一个位置上的差异是否有助于抗体21M18的正确折叠做出判断。通过研究其它抗体片段的已经解析的晶体结构(例如Trakhanov等，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，1999，55：122-28中所述的fab 2E8的结构)来指导这一分析。使用包括Jmol、快速PDB和Pymol在内的计算机软件对结构进行模拟。需要考虑的有，在给定位置上的氨基酸对β折叠框架的堆积的潜在影响、重链可变域和轻链可变域之间的相互作用、氨基酸侧链暴露于溶剂的程度、以及氨基酸影响CDR环定位的可能性。根据这一分析，化学合成了与人类IgG2恒定区框架内融合的五个备选VH链。所述备选重链包括：i)在合成框架区内含有根据对21M18结合功能的可能影响的分析而选定的取代的功能性人类框架和ii)亲本鼠类抗体21M18 CDR(SEQ ID NO：1、2和5)。
相似的是，鉴定了所选的人类框架IGK(V)4-1轻链和亲本鼠类单克隆抗体21M18轻链之间的氨基酸差异，随后对每一个位置上的差异是否有助于抗体21M18的正确折叠做出判断。根据这一分析，化学合成了五个备选VL链。第一个备选轻链包括：i)完整的IGK(V)4-1人类框架和ii)亲本鼠类抗体21M18 CDR(SEQ ID NO：9、10和11)。其它四个备选轻链包括：i)框架区中保留有数量递增的21M18的鼠类残基的IGK(V)4-1人类框架区和ii)亲本鼠类抗体21M18 CDR(SEQ ID NO：9、10和11)。
通过向哺乳动物细胞中共转染来测试每种备选的变体人源化重链和轻链的功能性。将上述五种备选的人源化21M18重链中的每一种与鼠类21M18轻链cDNA共转染到HEK 293细胞中，并通过ELISA测试条件培养基的DLL4抗原结合活性。选择显示最强结合的21M18重链变体。这一变体-“21M18 H2”-除了含有鼠类CDR之外，还在Vh框架内的6个框架位置含有取代，所述6个框架位置是卡巴特位16、20、27、28、38和48(图4A)。随后将21M18 H2人源化重链与五种备选的人源化轻链中的每一种共转染到HEK 293细胞中，并通过ELISA再次测试条件培养基的抗原结合。发现一个单独的轻链变体-“21M18 L2”-比其它备选轻链显示出更好的结合，其在卡巴特位22和36保留有鼠类残基(图5)。
接下来，改变了CDR2 H2(SEQ ID NO：2)中单独的半胱氨酸残基。具体而言，将卡巴特位52a的半胱氨酸残基修饰为丝氨酸(变体H7；SEQID NO：3)残基或缬氨酸(变体H9；SEQ ID NO：4)残基，从而合成H2的两条重链变体。将这些重链与L2共转染到HEK 293细胞中，并再次测试条件培养基。两个变体(21M1 8 H7L2和21M1 8 H9L2)通过ELISA均显示特异性抗原结合。因而21M18重链CDR2包括SEQ ID NO：2、3，或4，其中卡巴特位52a的残基包括半胱氨酸残基、丝氨酸残基或缬氨酸残基。
在某些实施方式中，制备了抗DLL4的人源化抗体。使用简并PCR从杂交瘤株中分离了鼠类单克隆抗体21M18的可变域并测序，这一过程基本如Larrick，J.M.等(1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.160：1250)以及Jones，S.T.和Bendig，M.M.(1991，Bio/Technology 9：88)所述。随后选取与亲本21M18抗体氨基酸序列最相似的人类重链和轻链可变框架区作为用于人源化的人类框架区。为了鉴定所述最相似的人类框架区，使用BLAST对Genbank中存储的人类基因组序列进行搜索，比较所预测的由21M18的VH和VL鼠类可变域编码的蛋白质序列和由人类基因组编码的Ig可变域。利用这种方法，选择IGH(V)I-18作为人类重链框架区并选择IGK(V)4-1作为人类轻链框架区。
对所选的人类框架IGH(V)I-18重链和亲本鼠类单克隆抗体21M18重链之间的氨基酸差异进行了鉴定，随后对每一个位置上的差异是否有助于抗体21M18的正确折叠做出判断。通过研究其它抗体片段的已经解析的晶体结构(例如Trakhanov等，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，1999，55：122-28中所述的fab 2E8的结构)来对指导这一分析。使用包括Jmol、快速PDB和Pymol在内的计算机软件对结构进行模拟。需要考虑的有：在给定位置上的氨基酸对β折叠框架的堆积的潜在影响、重链可变域和轻链可变域之间的相互作用、氨基酸侧链暴露于溶剂的程度、以及氨基酸影响CDR环定位的可能性。根据这一分析，化学合成了与人类IgG2恒定区框架内融合的五个备选VH链。第一条备选重链包括：i)完整的IGH(V)1-18人类框架和ii)亲本鼠类抗体21M18 CDR(SEQ ID NO：1、2和5)。另外四条备选重链包括i)框架区中保留有数量递增的21M18鼠类残基的IGH(V)1-18人类框架区和ii)亲本鼠类抗体21M18 CDR(SEQ IDNO：1、2和5)。
相似的是，鉴定了所选的人类框架IGK(V)4-1轻链和亲本鼠类单克隆抗体21M18轻链之间的氨基酸差异，随后对每一个位置上的差异是否有助于抗体21M18的正确折叠做出判断。根据这一分析，化学合成了五条备选VL链。第一条备选轻链包括：i)完整的IGK(V)4-1人类框架和ii)亲本鼠类抗体21M18 CDR(SEQ ID NO：9、10和11)。另外四条备选轻链包括：i)框架区中保留有数量递增的21M18鼠类残基的IGK(V)4-1人类框架区和ii)亲本鼠类抗体21M18 CDR(SEQ ID NO：9、10和11)。
通过向哺乳动物细胞中共转染来测试每种备选变体人源化重链和轻链的功能性。将上述五种备选人源化21M18重链中的每一种与鼠类21M18轻链cDNA共转染到HEK 293细胞中，并随后通过ELISA测试条件培养基的DLL4抗原结合活性。选择显示最强结合的21M18重链变体。这一变体-“21M18 H2”-除了含有鼠类CDR之外，还在5个框架位置含有鼠类残基，所述5个框架位置是卡巴特位20、28、38、48和69(图4)。随后将21M18 H2人源化重链与五种备选人源化轻链中的每一种共转染到HEK 293细胞中，并通过ELISA再次测试条件培养基的抗原结合。测试发现一个单独的轻链变体-“21M18 L2”-比其它备选轻链显示了更好的结合，其在卡巴特位22和36保留有鼠类残基(图5)。
接下来，改变了CDR2 H2(SEQ ID NO：2)中单独的半胱氨酸残基。具体而言，将卡巴特位52a的半胱氨酸残基修饰为丝氨酸(变体H7；SEQID NO：3)残基或缬氨酸(变体H9；SEQ ID NO：4)残基，从而合成H2的两条重链变体。将这些重链与L2共转染到HEK 293细胞中，并再次测试条件培养基。ELISA显示两个变体(21M1 8 H7L2和21M1 8 H9L2)均特异性结合抗原。因而21M18重链CDR2包括SEQ ID NO：2、3，或4，其中卡巴特位52a的残基包括半胱氨酸残基、丝氨酸残基或缬氨酸残基。
随后进一步表征了人源化抗体21M18。具体而言，使用Biacore来确定由蛋白A色谱法纯化的人源化抗体21M18的结合亲和力。经测定，对于21M18变体H2L2，亲和力为约0.33nM。
人源化抗体21M18被保藏在ATCC(2007年5月10日保藏，21M18H9L2的ATCC保藏编号为PTA-8427，而21M18 H7L2的ATCC保藏编号为PTA-8425)。
人类抗体
在一些实施方式中，使用噬菌体展示技术来分离可特异性识别DLL4的胞外域的人类抗体。利用含有人类抗体可变域的合成抗体文库，根据上述DLL4抗原的特异性、高亲和力识别进行筛查。通过独特的侧翼限制性位点来特地交换该文库中的CDR盒以优化抗体。随后将经优化的人类可变区克隆到含有人类IgG1重链和κ轻链的Ig表达载体中，以用于在哺乳动物CHO细胞中表达人类抗体。
实施例2：评价抗DLL4的抗体的体外测定
本实施例描述了代表性的体外测定，该体外测定用于测试抗DLL4而生成的抗体对细胞增殖、Notch途径活化和细胞毒性的活性。
增殖测定
使用Taqman分析来定量不同癌细胞系的DLL4的表达。在96孔组织培养微型板中，以104个细胞/孔的密度将鉴定为表达DLL4的细胞系铺板，并让其展开24小时。随后在含有2％FCS的新鲜DMEM中再将细胞培养12小时，此时将抗DLL4的抗体与对照抗体在存在10μmol/LBrdU的情况下加到培养基。BrdU标记后，去除培养基，于室温下将细胞在乙醇中固定30分钟，并与过氧化物酶偶联的抗BrdU的单克隆抗体(BMG 6H8克隆，Fab片段)反应90分钟。使底物在含有四甲基联苯胺的溶液中显色，在15分钟后以25μl的1mol/L H2SO4终止。以自动ELISA读板仪(UV Microplate Reader；Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA)使用450nm的滤波器测量颜色反应。所有实验都重复进行3次。通过与对照抗体比较来确定抗DLL4的抗体抑制细胞增殖的能力。
途径活化测定
在某些实施方式中，在体外确定了抗DLL4的抗体阻断Notch信号转导途径的活化的能力。将补充有抗生素和10％FCS的DMEM中培养的Hela细胞以：1)用以测定在对DLL4配体的响应中的Notch信号转导水平(Jarriault等，1995，Nature 377：355-8)的在萤火虫荧光素酶报告基因的上游含有Hes1启动子的Hes1-Luc报告载体，和2)作为转染效率内参对照的海肾荧光素酶报告基因(Promega；Madison，WI)进行共转染。然后将经转染的细胞加入经10μg/ml DLL4-Fc蛋白过夜包被的培养板。接下来将抗DLL4的抗体加入该细胞培养基。转染后48小时，使用双荧光素酶测定试剂盒(Promega；Madison，WI)测量荧光素酶水平，其中将萤火虫荧光素酶活性标准化为海肾荧光素酶活性。由此确定了抗体对DLL4诱导的Notch途径活化的抑制能力。以抗DLL4的鼠类抗体21M14和21M18观察到对Notch途径活化的DLL4活化的抑制(图6)。相反，虽然抗DLL4的抗体21M21可结合DLL4的DS1域(图3E)，但21M21并不抑制Notch结合(图6)。
在某些实施方式中，测定了抗DLL4的抗体调控下游基因活化的能力。从经鼠类抗体21M18治疗(下文详述)的动物分离C8结肠肿瘤细胞，并通过RT-PCR测定Notch途径基因HES1和ATOH-1的表达。用RNeasy纤维组织试剂盒(RNeasy Fibrous Tissue kit，Qiagen，Valencia，CA)按照制造商的使用说明从肿瘤组织中分离总RNA。以260nm/280nm的比来对RNA样品定量。通过在以溴化乙锭(EtBr)染色的变性琼脂糖凝胶上电泳一份RNA等分样品来确定RNA的完整性。使用FluorChem照相机来使凝胶上的28s rRNA对18s rRNA的比例可视化(由AphaEasa FC软件呈递)。将RNA样品洗脱在无RNase的水中并储存于-80℃。以含有3′-TAMRA FAM(6-羧基荧光素)报告染料和3′-TAMRA(6-羧基-四甲基罗丹明)的双荧光非扩展探针(nonextendable probe)进行实时RT-PCR。将100μg总RNA用于实时PCR，终体积为25μL，其中含逆转录酶、I×Tagman缓冲液(Applied Biosystems，Foster City，CA)和引物/探针混合物。反应在ABI 7900 HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)中进行：在48℃30分钟、在95℃10分钟、以及40个循环(95℃15秒和60℃1分钟)。使用SDS2.3软件(Applied Biosystems)分析结果。所有的引物和探针组均获自Applied Biosystems(Foster City，CA)。将目标基因的表达水平对看家基因Gus B的表达水平标准化并以相对量表示。与对照治疗的肿瘤相比，使用抗DLL4的鼠类抗体21M18的治疗降低了HES1的表达并增加了ATOH-1的表达(图7A)。
在一些实施方式中，使用已知能体外保持致瘤性细胞的培养条件建立了小鼠谱系缺失OMP-C11肿瘤细胞集落。在10μg/mL鼠类21M18或5μMγ-分泌酶抑制剂(GSI；即DBZ)的存在/不存在下，以不具有人类DLL4的3T3细胞(3T3)或包括细胞表面上过表达的人类DLL4的3T3细胞(DLL4)来覆盖这些肿瘤细胞集落。其中还包括了未覆盖的对照。虽然3T3-DLL4细胞诱导HES1并抑制ATOH1基因表达(以HES1∶ATOH1的比例表示)，但是单独的21M18或GSI抑制了DLL4诱导的Notch目标基因改变。
补体依赖的细胞毒性测定
在某些实施方式中，将表达DLL4的癌细胞系或从患者样品中分离到的癌干细胞作为异种移植物在免疫低下的小鼠中传代(如下文所详述)，使用这种癌细胞系或癌干细胞测量由抗DLL4的抗体介导的补体依赖的细胞毒性(CDC)。将细胞以106个细胞/ml悬浮在200μl的补充有抗生素和5％FBS的RPMI 1640培养基中。然后将经悬浮的细胞与200μl含有抗DLL4的抗体或对照抗体的血清或热灭活血清混合，设3个重复。将细胞混合物于37℃在5％CO2中温育1～4小时。然后收集经处理的细胞，并将其重悬于稀释在培养基中的100μl FITC-标记的膜联蛋白V中并在室温温育10分钟。添加稀释在HBSS中的100μl碘化丙啶溶液(25μg/ml)，并在室温下温育5分钟。收集细胞，在培养基中悬浮，并以流式细胞术进行分析。FITC染色细胞的流式细胞术提供了总细胞计数，而将死细胞吸收的碘化丙啶(作为占总细胞数的百分比)用于测量在血清和抗DLL4的抗体(与热灭活血清和对照抗体相比)存在下的细胞死亡。由此确定抗DLL4的抗体介导补体依赖的细胞毒性的能力。
抗体依赖的细胞胞毒测定
在某些实施方式中，将表达DLL4的癌细胞系或从患者样品中分离到的癌干细胞作为异种移植物在免疫低下的小鼠中传代(如下文所详述)，使用这种癌细胞系或癌干细胞测量由抗DLL4的抗体介导的抗体依赖的细胞胞毒(ADCC)。将细胞以106个细胞/ml悬浮在200μl的补充有抗生素和5％FBS的无酚红RPMI 1640培养基中。通过Ficoll-Paque密度梯度离心从肝素化的外周血中分离出外周血单核细胞(PBMC)，以用作效应细胞。然后在至少一种DLL4的抗体或对照抗体存在的情况下，将靶细胞(T)与PBMC效应细胞(E)以25∶1，10∶1和5∶1的E/T比在96孔板中混合。对照包括在抗体的存在下单独温育靶细胞和单独温育效应细胞。将细胞混合物于37℃在5％CO2中温育1～6小时。然后用比色测定法(CytoTox96 Non-radioactive Cytotoxicity Assay；Promega；Madison，WI)测量被释放的乳酸脱氢酶(LDH，一种细胞裂解时释放的稳定的胞质酶)。用标准96孔板读板仪在490nm处采集吸光率数据并进行背景校正。根据下式计算特异细胞毒性的百分比：％细胞毒性＝100×(实验LDH释放-效应子自发LDH释放-靶自发LDH释放)/(靶最大LDH释放-靶自发LDH释放)。由此确定抗DLL4的抗体介导抗体依赖的细胞胞毒的能力。
实施例3：使用抗DLL4的抗体防止肿瘤体内生长
本实施例描述了应用抗DLL4的抗体防止异种移植物模型内的肿瘤生长。在某些实施方式中，制备来自患者样品(例如实体瘤活检样品或胸腔积液)的已作为异种移植物在小鼠中传代的肿瘤细胞，以再传代到实验动物中。在无菌条件下取出肿瘤组织，切成小块，用无菌刀片完全切碎，并通过酶消化和机械破碎获得单细胞悬液。具体地说，将胸腔积液细胞或所得肿瘤块与超纯胶原酶III于培养基中混合(200～250单位胶原酶/mL)并在37℃温育1～4小时，每15～20分钟通过10mL移液器上下吸打。通过40μM尼龙网过滤经消化的细胞，用含有2％热灭活小牛血清(HICS)和25mM HEPES的Hank′s缓冲的盐溶液(HBSS)(pH 7.4)洗涤。然后将解离的肿瘤细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫中以引发肿瘤生长。
在某些实施方式中，在注射到实验动物之前，首先根据细胞表面标记物将所解离的肿瘤细胞分选为致瘤性细胞和非致瘤性细胞。具体地说，用含有2％热灭活小牛血清(HICS)的HEPES缓冲的盐溶液(HBSS)洗涤按上述解离的肿瘤细胞2次，并以106个细胞/100μl重新悬浮。添加抗体，在冰上温育细胞20分钟，然后用HBSS/2％HICS洗涤两次。抗体包括抗ESA(Miltenyi Biotec，Aubern，CA)、抗CD44、抗CD24和种系标记物抗CD2、抗CD3、抗CD10、抗CD16、抗CD18、抗CD31、抗CD64和抗CD140b(统称为Lin；BD Biosciences，San Jose，CA)。将抗体直接偶联到荧光发色团上以对表达这些标记物的细胞进行阳性或阴性选择。通过选择抗H2Kd+和鼠类CD45+细胞而排除小鼠细胞，并通过使用存活力染料(viability dye)DAPI排除死细胞。在FACS Aria(BD Biosciences，San Jose，CA)上进行流式细胞分析。利用侧向散射图和正向散射图排除细胞团块。然后将所分离的ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-致瘤性细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中以引发肿瘤生长。
在某些实施方式中，分析了抗DLL4的抗体减缓UM-C4结肠肿瘤细胞生长的能力。将解离的UM-C4细胞(10,000个细胞/只动物)皮下注射到6～8周龄的NOD/SCID小鼠的右侧胁腹区。肿瘤细胞注射后第一天，用10mg/kg的抗DLL4的鼠类抗体21M18(n＝5)或PBS(n＝10)对动物进行腹膜内注射(i.p.)，实验期间每周两次。每周监测肿瘤的生长，直至检测到生长，此时间点之后在为期共8周的时间内每周对肿瘤生长进行两次测量。与注射PBS的对照相比，用抗体21M18治疗，肿瘤生长减缓54％(图8)。
随后测定了抗DLL4的抗体影响体内增殖的能力。以鼠类抗体21M18或对照抗体治疗动物，从经治疗的动物中分离C8结肠肿瘤并通过免疫细胞化学确定细胞增殖标记物Ki67的表达。具体而言，将经福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤切成4μm厚度的切片。将切片在二甲苯中脱石蜡并在蒸馏水中再水合。根据标准方法进行免疫组化学分析。简单来说，在除焦室(Decoking chamber)中将切片浸入水浴中的柠檬酸盐缓冲液(pH 6)中20分钟从而获取抗原。将载玻片冷却约45分钟并以PBS漂洗。加入一抗前，将切片与过氧化氢(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)在室温温育10分钟，从而去除内源性过氧化物酶。向每一个切片加入以1∶50稀释在豪斯稀释缓冲液(horse dilution buffer)(含1％NHS，1％BSA，0.1％Tx-100，0.05％NaN3的PBS)中的兔抗人类Ki67(Vector Laboratories Inc.，Burlingame，CA)并在4℃温育1小时或过夜。将载玻片在洗涤缓冲液(含10％的明胶，10％的Tx-100的PBS)中漂洗3次，每次5分钟。向载玻片添加偶联有HRP的抗兔的二抗溶液(Immpress预稀释抗兔抗体，Vector Laboratories Inc.，Burlingame，CA)并温育30分钟。以洗涤缓冲液充分洗涤之后，加入载体新星红(Vector Nova Red，Vector Laboratories Inc.，Burlingame，CA)。以水漂洗载玻片，以苏木精(hematoxilin)复染并以永久性封片介质(Vectamount，Vector Laboratories Inc.，Burlingame，CA)封片。与对照治疗的肿瘤相比，以抗DLL4的鼠类抗体21M18的治疗减少了表达Ki67的细胞数量(图9)。
实施例4：在联合疗法中使用抗DLL4的抗体预防和治疗肿瘤的体内生长
DLL4抗体与氟尿嘧啶的联合
在某些实施方式中，分析了抗DLL4的抗体与化学疗法的联合减缓UM-C4结肠肿瘤细胞的体内生长的能力。将解离的UM-C4细胞(10,000个细胞/只动物)皮下注射到6～8周龄的NOD/SCID小鼠的右侧胁腹区。肿瘤细胞注射后第一天，以10mg/kg的抗DLL4的鼠类抗体21M18或PBS对动物进行腹膜内注射(i.p.)，实验期间每周注射两次；或者在注射所述抗体或PBS的同时以抗代谢物化疗剂氟尿嘧啶(5-FU)共同治疗，每周施用1次。每周监测肿瘤的生长，直至检测到生长，此时间点之后在为期共8周的时间内每周对肿瘤生长进行两次测量。抗DLL4的鼠类抗体21M18与5-FU的联合治疗比任一种单独治疗更大程度地减缓了肿瘤的生长(图10)。
DLL4抗体与EGFR抗体或VEGF抗体的联合
在某些实施方式中，在与抗EGF受体(EGFR)的抗体联合中测试了抗DLL4的抗体影响体内肿瘤成活率(tumor take frequency)的能力。将解离的UM-C4细胞(10,000个细胞/只动物)皮下注射到6～8周龄的NOD/SCID小鼠的右侧胁腹区。肿瘤细胞注射后第一天，以10mg/kg对动物(n＝10)腹膜内注射(i.p.)抗DLL4的鼠类抗体21M18、抗EGFR的抗体、抗DLL4抗体与抗EGFR抗体的联合、或PBS。在所有以抗DLL4抗体治疗的或抗EGFR抗体治疗的动物中、和10只对照动物中的9只中均检测到肿瘤。相反，10只以抗DLL4的抗体与抗EGFR抗体进行联合治疗的动物中只有2只在治疗数周后具有可检测的肿瘤(图11)。此外，抗DLL4的鼠类抗体21M18与抗EGFR的抗体的联合治疗对任一种单独治疗而言均降低了肿瘤发生率(图11)。
在某些实施方式中，在与抗EGF受体(EGFR)的抗体联合中测试了抗DLL4的抗体影响体内肿瘤成活率的能力。将C17肿瘤细胞植入小鼠(n＝10/组)并在2天后以对照抗体、鼠类21M18、抗VEGF抗体或两种抗体的联合开始治疗。每种抗体给药剂量为10mg/kg，一周给2次。21M18和抗VEGF抗体均减缓了肿瘤的生长，联合比任一种单独抗体更有效(图18)。
DLL4抗体与伊立替康联合
在某些实施方式中，测试了抗DLL4的抗体与化学治疗剂伊立替康的联合。在一些实施方式中，将解离的OMP-C8肿瘤细胞(10,000个细胞/只动物)皮下注射到6～8周龄的NOD/SCID小鼠的右侧胁腹区。肿瘤细胞注射后第一天，以10mg/kg的抗DLL4的鼠类抗体21M18或对照抗体对动物进行腹膜内注射(i.p.)，实验期间每周注射两次；或者在注射抗体的同时以化学治疗剂伊立替康共同治疗，剂量为7.5mg/kg，每周施用1次。每周监测肿瘤的生长直至检测到生长，此时间点之后每周对肿瘤生长进行两次测量。抗DLL4的鼠类抗体21M18与伊立替康联合治疗比任一种单独治疗更大程度地减缓肿瘤生长(图12A)。而且，虽然单独以7.5mg/kg伊立替康每周治疗停止之后在大多数动物中肿瘤继续生长或加速生长，但每周两次10mg/kg的抗DLL4的21M18与每周一次7.5mg/kg的伊立替康的联合在第56天治疗停止之后的超过5周的时间内进一步阻止了结肠肿瘤的生长(图13)。
在某些实施方式中，以与伊立替康联合的方式检验抗DLL4的人源化抗体H7L2 21M18。在一些实施方式中，将解离的C8肿瘤细胞(10,000个细胞/只动物)皮下注射到6～8周龄的NOD/SCID小鼠的右侧胁腹区。肿瘤细胞注射后第一天，以10mg/kg的抗DLL4的人源化21M18抗体、鼠类抗体21M18、或对照抗体对动物进行腹膜内注射(i.p.)，实验期间每周注射两次；或者在注射抗体的同时以化学治疗剂伊立替康共同治疗，剂量为7.5mg/kg，每周施用1次。每周监测肿瘤的生长直至检测到生长，此时间点之后每周对肿瘤生长进行两次测量。抗DLL4的人源化抗体21M18和伊立替康的联合治疗显示的抗肿瘤生长效果与鼠类21M18的相似(图12B)。
在一些实施方式中，将抗DLL4的鼠类21M18与伊立替康治疗联合用于治疗已建立的结肠肿瘤。将解离的C8细胞(10,000个细胞/只动物)皮下注射到6～8周龄的NOD/SCID小鼠的右侧胁腹区。当所注射的细胞生成约60mm3的肿瘤时，开始治疗。以10mg/kg的抗DLL4的鼠类抗体21M18或对照对动物进行腹膜内注射(i.p.)，实验期间每周注射两次；或者在注射抗体的同时以化学治疗剂伊立替康共同治疗，剂量为7.5mg/kg，每周施用1次。抗DLL4的鼠类抗体21M18与伊立替康联合治疗与任意一种单独治疗相比更大程度地减缓了已建立的结肠肿瘤的生长(图14)。
在一些实施方式中，在联合疗法之后，以抗体治疗来延缓肿瘤的复发。将解离的C8细胞(10,000个细胞/只动物)皮下注射到6～8周龄的NOD/SCID小鼠的右侧胁腹区。当所注射的细胞生成约150mm3的肿瘤时，开始治疗。对动物腹膜内(i.p.)联合施用抗DLL4的鼠类抗体21M18或对照抗体(10mg/kg，每周两次)和伊立替康(7.5mg/kg，每周1次)，总共为期32天。随后中断联合治疗，在余下的实验中以DLL4抗体21M18或对照抗体进行抗体治疗。与对照治疗的动物相比，联合疗法后以抗DLL4的抗体21M18治疗显著延缓了肿瘤生长的再发生(图16)。还显示了伊立替康治疗终止后47天的各个肿瘤的体积(图17)。
伊立替康增强了DLL4抗体对癌干细胞频率的降低
在某些实施方式中，使用限制性稀释分析确定了抗DLL4的抗体21M18单独或抗DLL4的抗体21M18与伊立替康联合降低癌干细胞频率的能力。以对照抗体或DLL4鼠类抗体21M18、伊立替康或DLL4鼠类抗体21M18与伊立替康的联合按上述方式治疗小鼠，在治疗38天后从小鼠中分离C8结肠肿瘤。以下述方式处理所分离的肿瘤(n＝3/实验组)。取出肿瘤，以无菌刀片切碎。为了获得单细胞悬液，将肿瘤悬液与消化溶液混合并在37℃温育1小时，所述消化溶液在MEBM培养基(Cambrex，East Rutherford，NJ)中含有胶原酶/透明质酸酶∶分散酶(1∶1∶8，10×)和1∶100稀释的脱氧核糖核酸酶I(Worthington，Lakewood，NJ)。离心细胞并在1mL的ACK培养基(溶于蒸馏水的0.15M NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mMNa2EDTA)中重悬，于冰上放置2分钟以去除血红细胞。离心细胞并以1×107细胞/ml的浓度在FACS缓冲液中重悬，随后在冰上与生物素化的小鼠抗体(α-小鼠CD45-生物素1∶200稀释液和大鼠α-小鼠H2Kd-生物素1∶100稀释液，BioLegend，San Diego，CA)温育30分钟，然后加入链霉抗生物素蛋白(strepavadin)磁珠(Invitrogen，Carlsbad，CA)以去除小鼠细胞。收集悬液中余下的人类细胞，计数并稀释为进一步应用所需的浓度。随后将人类细胞的系列稀释液回注到免疫低下小鼠中。具体而言，在小鼠的右侧胁腹区注射900、300、100或50个所分离的人类肿瘤细胞(n＝10，每组)。每周测评两次肿瘤体积。
在第81天研究结束时，与注射经对照或伊立替康单独治疗的肿瘤细胞的组相比，在所有注射经DLL4抗体21M18治疗的肿瘤细胞的组中具有可检测肿瘤的小鼠的百分比降低，并在注射经DLL4 21M18-伊立替康治疗的肿瘤细胞的组中这一百分比进一步降低(图15A)。利用这些肿瘤发生频率，通过L-CalcTM软件(下载自http://www.stemcell.com/search/default.asp)以泊松统计计算了干细胞频率。简要而言，根据泊松分布统计，如果37％的动物没有出现肿瘤，则在已知数量的注射细胞中恰好存在1个干细胞。以伊立替康单独治疗肿瘤使癌干细胞的数量从对照处理的肿瘤中的1∶93增加到1∶82。相反，抗DLL4的抗体使癌干细胞频率从对照治疗的肿瘤中的1∶93降低到DLL4抗体治疗的肿瘤中的1∶238，和DLL4 21M18-伊立替康联合治疗肿瘤细胞中的1∶573(图15B)。
实施例5：使用抗DLL4的抗体对肿瘤进行体内治疗
本实施例描述了抗DLL4的人源化抗体21M18治疗异种移植物模型中的癌症的应用。在某些实施方式中，制备了来自患者样品(实体瘤活检样品或胸腔积液)的已作为异种移植物在小鼠中传代的肿瘤细胞，以再传代到实验动物中。取出肿瘤组织，切成小块，用无菌刀片完全切碎，并通过酶促消化和机械破碎获得单细胞悬液。然后将解离的肿瘤细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫(对于乳腺肿瘤)、注射到胁腹(对于非乳腺肿瘤)中以引发肿瘤生长。作为选择，按上文所详细描述的方法分离ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-致瘤性肿瘤细胞并进行注射。
注射肿瘤细胞后，监测动物的肿瘤生长。一旦肿瘤达到约100mm3的平均尺寸，即开始抗体治疗。在总共6周内，按每周2～5次，使每只动物接受100μg抗DLL4的人源化抗体21M18或对照抗体的腹膜内注射。在这6周过程中，每周评价肿瘤尺寸两次。由此确定DLL4人源化抗体与对照抗体相比进一步防止肿瘤生长或减小肿瘤尺寸的能力。
在抗体治疗终点，收获肿瘤以进行进一步分析。在一些实施方式中，通过免疫荧光法分析一部分肿瘤以评价抗体对肿瘤的穿透和肿瘤反应。以抗DLL4的抗体或对照抗体治疗小鼠，将从所治疗的小鼠获得的每种肿瘤的一部分在液氮中鲜冻，包埋在O.C.T.中，并在低温恒温器上以10μm切片切到载玻片上。在一些实施方式中，将每种肿瘤的一部分用福尔马林固定、石蜡包埋并在超薄切片机上以10μm切片切到载玻片上。对切片进行后固定并与生色团标记的特异性识别所注射抗体的抗体温育，以检测肿瘤活检样品中存在的抗DLL4受体的抗体或对照抗体。另外，可以使用检测不同肿瘤和肿瘤募集的细胞类型(例如抗VE连环蛋白(CD144)或抗PECAM-1(CD31)抗体以检测血管内皮细胞、抗平滑肌α-肌动蛋白抗体以检测血管平滑肌细胞、抗Ki67抗体以检测增殖细胞、TUNEL测定以检测垂死细胞、抗胞内域(ICD)Notch片段抗体以检测Notch信号转导)来评价抗体治疗对例如血管生成、肿瘤生长和肿瘤形态的影响。
在某些实施方式中，还评价了抗DLL4的人源化抗体治疗对肿瘤细胞基因表达的影响。从分别获自DLL4抗体治疗的小鼠和对照抗体治疗的小鼠的肿瘤的一部分中提取总RNA，并用于定量RT-PCR。分析DLL4、Notch受体、Notch信号转导途径的组分以及所加入的先前鉴定到的癌干细胞标记物(例如CD44)相对于作为内参的看家基因GAPDH的表达水平。由此确定DLL4抗体治疗对肿瘤细胞基因表达所引起的变化。
另外，评价了抗DLL4的抗体治疗对肿瘤中的癌干细胞的存在的影响。将来自DLL4抗体治疗的小鼠和对照抗体治疗的小鼠的肿瘤样品切成小块，用无菌刀片完全切碎，并通过酶消化和机械破碎获得单细胞悬液。然后按上文所详细描述的方法，根据ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-表面细胞标记物表达，采用FACS分析，分析所解离的肿瘤细胞是否存在致瘤性癌干细胞。
然后可以评价抗DLL4的抗体治疗后根据ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-表达所分离的细胞的致瘤性。将分离自DLL4抗体治疗的小鼠和对照抗体治疗的小鼠的ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-癌干细胞再皮下注射到NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫中。然后根据始终形成肿瘤所需的被注射细胞的数量，确定癌干细胞的致瘤性。
实施例6：使用抗DLL4的人源化抗体治疗人类癌症
本实施例描述了使用抗DLL4的人源化抗体来靶向肿瘤而治疗癌症的方法，所述肿瘤包含其中已经检测到Notch受体或Notch受体配体表达的癌干细胞和/或肿瘤细胞。首先，可以从肿瘤活检样品确定存在癌干细胞标记物表达。在无菌条件下从诊断患有癌症的患者的活检样品取出肿瘤细胞。在一些实施方式中，将组织活检样品在液氮中鲜冻，包埋在O.C.T.中并在低温恒温器上以10μm切片切到载玻片上。在一些实施方式中，将组织活检样品用福尔马林固定、石蜡包埋，并在超薄切片机上以10μm切片切到载玻片上。将切片与抗DLL4的抗体温育，以检测蛋白表达。
还可以确定癌干细胞的存在。将组织活检样品切成小块，用无菌刀片完全切碎，并对细胞进行酶消化和机械破碎，以获得单细胞悬液。然后将所解离的肿瘤细胞与抗ESA、抗CD44、抗CD24、抗Lin和抗DLL4的抗体温育，以检测癌干细胞，并通过上文所详细描述的流式细胞术确定ESA+，CD44+，CD24-/低，Lin-，DLL4+肿瘤干细胞的存在。
用抗DLL4的人源化抗体治疗其肿瘤经诊断为表达Notch受体或Notch受体配体的癌症患者。在某些实施方式中，纯化上述制得的抗DLL4的人源化抗体并用适当的用于注射的药用载质配制。在一些实施方式中，在至少10周内，每月至少一次使用DLL4抗体治疗患者。在一些实施方式中，在至少约14周内，每周至少一次使用DLL4抗体治疗患者。抗体的每次施用量应当是药学有效剂量。在一些实施方式中，施用约2mg/ml～约100mg/ml的抗DLL4的抗体。在一些实施方式中，施用约5mg/ml～约40mg/ml的抗DLL4的抗体。可以在标准放射治疗方案或使用一种或多种化疗剂(例如奥沙利铂、氟尿嘧啶、亚叶酸或链佐星)的化疗方案之前、同时或之后施用所述抗体。例如根据肿瘤消退、新肿瘤发生减少、肿瘤抗原表达降低、癌干细胞数量减少或评估疾病预后的其它手段，对患者进行监测，以确定这样的治疗是否已经产生抗肿瘤反应。
从本文所公开的发明的说明和实践考虑，本发明的其它实施方式对于本领域技术人员而言是显而易见的。所述说明和实施例应当视为仅为示例目的，本发明的实际范围和实质由所附权利要求书给出。将本文所引用的所有公报、专利和专利申请通过引用方式全部并入本公开内容中。
序列表
SEQ ID NO：1(重链CDR1)
TAYYIH
SEQ ID NO：2(重链CDR2，H2)
YISCYNGATNYNQKFKG
SEQ ID NO：3(重链CDR2 H7)
YISSYNGATNYNQKFKG
SEQ ID NO：4(重链CDR2 H9)
YISVYNGATNYNQKFKG
SEQ ID NO：5(重链CDR3)
RDYDYDVGMDY
SEQ ID NO：6(重链可变区，H2)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWKQAPGQGLEWIGYISCYNGATNYNQ
KFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：7(重链可变区，H7)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYISSYNGATNYN
QKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：8(重链可变区，H9)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYISVYNGATNYN
QKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：9(轻链CDR1)
RASESVDNYGISFMK
SEQ ID NO：10(轻链CDR2)
AASNQGS
SEQ ID NO：11(轻链CDR3)
QQS KEVPWTFGG
SEQ ID NO：12(轻链可变区)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCRASESVDNYGISFMKWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVP
DRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPWTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：13(重链、H2、可变区的核苷酸序列)
ATGGACTGGACCTGGAGCATCCTGTTCCTGGTGGCTGCTGCTACAGGAGCTCACTCCCAG
GTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCTAGCGTGAAGATCAG
CTGCAAGGCTAGCGGATACTCCTTTACAGCTTACTACATCCACTGGGTGAAGCAGGCCCC
TGGACAAGGGCTGGAGTGGATCGGATATATCAGCTGTTACAACGGAGCTACAAACTACA
ACCAGAAGTTCAAGGGCAGGGTCACCTTCACAACAGACACAAGCACAAGCACAGCCTAC
ATGGAGCTGAGGAGCCTGAGAAGCGACGACACAGCCGTGTACTACTGTGCTAGGGACTA
CGACTACGACGTGGGGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCAGCTCA
SEQ ID NO：14(重链、H7、可变区的核苷酸序列)
ATGGACTGGACCTGGAGCATCCTGTTCCTGGTGGCTGCTGCTACAGGAGCTCACTCCCAG
GTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCTAGCGTGAAGATCAG
CTGCAAGGCTAGCGGATACTCCTTTACAGCTTACTACATCCACTGGGTGAAGCAGGCCCC
TGGACAAGGGCTGGAGTGGATCGGATATATCAGCTCCTACAACGGAGCTACAAACTACA
ACCAGAAGTTCAAGGGCAGGGTCACCTTCACAACAGACACAAGCACAAGCACAGCCTAC
ATGGAGCTGAGGAGCCTGAGAAGCGACGACACAGCCGTGTACTACTGTGCTAGGGACTA
CGACTACGACGTGGGGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCAGCTCA
SEQ ID NO：15(重链、H9的核苷酸序列)
ATGGACTGGACCTGGAGCATCCTGTTCCTGGTGGCTGCTGCTACAGGAGCTCACTCCCAG
GTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCTAGCGTGAAGATCAG
CTGCAAGGCTAGCGGATACTCCTTTACAGCTTACTACATCCACTGGGTGAAGCAGGCCCC
TGGACAAGGGCTGGAGTGGATCGGATATATCAGCGTCTACAACGGAGCTACAAACTACA
ACCAGAAGTTCAAGGGCAGGGTCACCTTCACAACAGACACAAGCACAAGCACAGCCTAC
ATGGAGCTGAGGAGCCTGAGAAGCGACGACACAGCCGTGTACTACTGTGCTAGGGACTA
CGACTACGACGTGGGGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCAGCTCA
SEQ ID NO：16(轻链的核苷酸序列)
ATGGTGCTCCAGACCCAGGTCTTCATTTCCCTGCTGCTCTGGATCAGCGGAGCCTACGGG
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCTGACTCCCTGGCTGTGTCCCTGGGCGAGAGGGCCACC
ATCTCCTGCAGAGCCAGCGAATCCGTCGATAATTATGGCATTTCCTTTATGAAGTGGTTCC
AGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACGCTGCATCCAACCAAGGGTCCG
GGGTCCCTGACAGGTTCTCCGGCAGCGGGTCCGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA
GCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCTGTCTATTACTGTCAGCAAAGCAAGGAGGTGCCTTGGA
CATTCGGAGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCCCCCTCCGTCTTC
ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAAGCGGCACTGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGA
ATAACTTCTATCCCCGGGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAAAGC
GGCAACTCCCAGGAGAGCGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAG
CAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCCGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAG
TCACCCATCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGTTGA
SEQ ID NO：17(重链CDR1的核苷酸序列)
ACAGCTTACTACATCCAC
SEQ ID NO：18(重链CDR2、H2的核苷酸序列)
ATATCAGCTGTTACAACGGAGCTACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGC
SEQ ID NO：19(重链CDR2、H7的核苷酸序列)
ATATCAGCTCCTACAACGGAGCTACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGC
SEQ ID NO：20(重链CDR2、H9的核苷酸序列)
ATATCAGCGTCTACAACGGAGCTACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGC
SEQ ID NO：21(重链CDR3的核苷酸序列)
AGGGACTACGACTACGACGTGGGGATGGACTAC
SEQ ID NO：22(轻链CDR1的核苷酸序列)
AGAGCCAGCGAATCCGTCGATAATTATGGCATTTCCTTTATGAAG
SEQ ID NO：23(轻链CDR2的核苷酸序列)
GCTGCATCCAACCAAGGGTCC
SEQ ID NO：24(轻链CDR3的核苷酸序列)
CAGCAAAGCAAGGAGGTGCCTTGGACATTCGGAGGA
SEQ ID NO：25(人类DLL4抗原)
MAAASRSASGWALLLLVALWQQRAAGSGVFQLQLQEFINERGVLASGRPCEPGCRTFFRVC
LKHFQAVVSPGPCTFGTVSTPVLGTNSFAVRDDSSGGGRNPLQLPFNFTWGTFSLIIEAWHAP
GDDLRPEALPPDALISKIAIQGSLAVGQNWLLDEQTSTLTRLRYSYRVICSDNYYGDNCSRLC
KKRNDHFGHYVCQPDGNLSCLPGWTGEYCQQPICLSGCHEQNGYCSKPAECLCRPGWQGRL
CNECIPHNGCRHGTCSTPWQCTCDEGWGGLFCDQDLNYCTHHSPCKNGATCSNSGQRSYTC
TCRPGYTCVDCELELSECDSNPCRNGGSCKDQEDGYHCLCPPGYYGLHCEHSTLSCADSPCF
NGGSCRERNQGANYACECPPNFTGSNCEKKVDRCTSNPCANGGQCLNRGPSRMCRCRPGFT
GTYCELHVSDCARNPCAHGGTCHDLENGLMCTCPAGFSGPRCEVRTSIDACASSPCFNRATC
YTDLSTDTFVCNCPYGFVGSRCEFPVG
SEQ ID NO：26(人类DLL4 DSL区域)
WLLDEQTSTLTRLRYSYRVICSDNYYGDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDGNLSCLPGWTGE
YC
SEQ ID NO：27(人类DLL4 N-末端区域)
MAAASRSASGWALLLLVALWQQRAAGSGVFQLQLQEFINERGVLASGRPCEPGCRTFFRVC
LKHFQAVVSPGPCTFGTVSTPVLGTNSFAVRDDSSGGGRNPLQLPFNFTWPGTFSLIIEAWHA
PGDDLRPEALPPDALISKIAIQGSLAVGQN
PCT/RO/134表
申请人或代理人档案号FCI09US0603C 国际申请号PCTUS2007/020889
关于微生物保藏的说明
(细则13之二)
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PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)