一种蛇毒止血酶.pdf

本发明涉及一种蛇毒止血酶，属于生化医药技术领域。本发明的纯度为98％以上的蛇毒止血酶是从尖吻蝮(Dienagkistrodon acutus)蛇毒中得到。该酶分子量为31000道尔顿，由两个亚基组成；其中α-链由135个氨基酸残基组成，β-链由126个氨基酸残基组成。本发明提供了一种新的蛇毒止血酶，它是从福建产尖吻蝮蛇毒中分离纯化得到的单体，具有见效快、作用强的特点，能应用于临床的各种出血疾病的预防和治疗。

1、  一种蛇毒止血酶，其特征在于：蛇毒止血酶是从我国福建产尖吻蝮蛇毒中分离纯化得到的单体，该酶分子量为31000道尔顿，由两个亚基组成；经氨基酸序列测定，α-链由135个氨基酸残基组成，β-链由126个氨基酸残基组成；蛇毒止血酶氨基酸
序列为；
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               110       120       130  135
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一种蛇毒止血酶
技术领域：
本发明涉及一种蛇毒止血酶，属于生化医药技术领域。
背景技术：
在国外Helleman等(Helleman，W.H.等，1976J.Biol.Chem.，251：1663.)用凝胶层析和亲和层折自巴西矛头蝮(Bothrope jararaca)得到了蛇毒凝血酶(Hemocoagulase、Reptilase)，经测定，该酶分子量为31000道尔顿，为单链，由230个氨基酸组成。V.Klobusitzky(1936)首先发现并研制成止血剂-Reptilase(含2个以上组分)，并申请专利(参见使用说明书)，由瑞士巴塞尔素高大制药厂生产，我国每年进口数百万支Reptilase(我国俗称为“立止血”)，年销值可达2-4亿元(人民币)。
我国萧昌华先生(1990)即从我国特产尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇(湖南产)毒中经阴离子交换、凝胶柱层，再经蛋白纯化仪纯化得到97％以上的尖吻蝮蛇毒凝血酶I、II两个同功酶纯品，已获两项专利(证书号第164674、164675)。尖吻蝮蛇毒凝血酶I已获国家一类新药临床试验批件(批件号：2003L03431)现已进入第二期临床试验阶段；尖吻蝮蛇毒凝血酶II则未进行进一步研究。国内还有些专利报道，但基本属于这两个同功酶类。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种促、凝止血作用显著的高纯度单体止血剂-蛇毒止血酶。
本发明是从我国福建产尖吻吻蝮(Dienagkistrodon acutus)蛇毒中分离纯化得到的单体，经检测，该酶分子量为31000道尔顿，由两个亚组成。经氨基酸序列测定，α-链由135个氨基酸组成，β-链由126个氨基酸组成。蛇毒止血酶氨基酸序列为；
               10        20        30       40        50
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本发明的蛇毒止血酶经如下工艺步骤得到：
1、尖吻蝮蛇毒用Tris-Hcl缓冲液溶解，离心分离，取上清液上柱，经阴离子交换柱层析，用Tris-Hcl缓冲液溶，NaCL直线梯度洗脱，能同时得到5个以上具类凝血酶(Thrombin Like Enzemy)活性组分；
2、经凝胶电泳检测，将其中止血酶组分再经两种以上阴离子交换及凝胶柱层析纯化得精制止血酶溶液，经HPLC色谱及毛细管电泳检测，纯度在98％，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检，本品由两个亚基组成。其得率为6％，1克蛇毒可生产成品1000支以上。
3、将精品止血酶溶液再经脱盐得止血酶原液；
4、将所得的止血酶原液再经配方(加赋型剂、稳定剂)、过滤、分装、冷冻干燥、压盖即得注射用止血酶成品。
5、鉴定止血酶的特征：
(1)蛇毒用Tris-Hcl pH7.5-8.5缓冲液溶解，经阴离子交换剂柱层析，用上述缓冲液，Nacl直线梯度洗脱，能同时得到5个或以上粗分类凝血酶同功酶组分；
(2)将所得到的粗蛇毒止血酶再经不同阴离子及凝胶柱层析纯化，用上述缓冲液，pH7.5-8.5，Nacl 0-1.0M直线梯度洗脱，纯化得精制蛇毒止血酶溶液；
(3)该酶的特征鉴定：
A.经HPLC(正、反相)色谱检测，本品相对含量为98％；
B.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳能见两条亚基蛋白带，其分子量分别为16500道尔顿和14500道尔顿；
C.用4mg/ml浓度人(或牛)纯血纤维蛋白原(或血浆)测定其酶活力，其比活力大于100U/mg；经蛋白测序，为两个亚基，α-亚基(链)由135个氨基酸组成，β-亚基(链)由126个氨基酸组成。
6.与进口止血药-Reptilase(立止血)的比较研究：
将上述发明的蛇毒止血酶与进口的止血剂-Reptilase(立止血)进行比较研究。
取正常家兔16只(雌、雄各半)，分为4组，每组4只，1、3组为蛇毒止血酶，剂量分别是1、3U/kg体重剂量；2、4组分别用Reptilase 1、3U/kg体重剂量作比较试验。在用药后分别于10、20分钟、1、4、7、12、24小时由兔耳静脉取血测定全血凝血时间。
实验结果表明：本发明得到的蛇毒止血酶见效快(5-10分钟即有显著的促凝、止血效应，Reptilase则在20分时才有显著作用)，且促凝作用显著强于Reptilase。
再经正常大鼠创伤性出血的止血作用及家兔血小板减少兔创伤出血的止血作用试验，结果表明0.7U/kg体重剂量即有显著的止血作用与Reptilase的作用无显著差异，表明本发明所得的蛇毒止血酶具有与Reptilase相同的临床止血功能。
在本发明的操作过程中，相分所得蛇毒止血酶和再纯化的溶液用水是超纯净水，溶解蛇毒的缓冲液是0.05M Tris-Hcl缓冲液；粗分所用阴离子是DEAE-Sephadex A-50，粗分所用Nacl梯度为0-0.8；纯化过程中：三次以上柱层析所用填料为Q-sepharose、Superdex^TM 75、Sephadex 75；三次以上柱层析所用Nacl梯度为0-0.8M；全工序操作过程在10±2℃的GMP环境中进行。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种新的蛇毒止血酶，它是从福建产尖吻蝮蛇毒中分离纯化得到的单体，且具有见效快、作用强的特点，能应用于临床的各种出血疾病的预防和治疗。
具体实施方式：
以下叙述本发明的实施例，本发明的实施例对于本发明只有说明作用而没有限制作用。实施例中所用蛇毒为发明内容所述。
实施例一，080818批蛇毒止血酶的生产：
将DEAE-Sephadex A-50-120(Fluka Bichemika 84957)30g用0.05M pH8.0Tris-Hcl缓冲液浸泡12小时以上(换1-2次缓冲液)，装柱(3×110cm²)，再用上述缓冲液平衡；同时称取2g福建产尖吻蝮蛇毒溶于上述缓液6ml中，溶解后经5000转/分离心10分钟，取上清液上柱。
将上述缓冲液注入储存瓶及梯度瓶各1000ml，于储存瓶中加入Nacl 48g并绞拌溶解后连通梯度洗脱瓶，进行Nacl 0-0.8M直线梯度洗脱并用紫外自动记录仪监测，洗脱液用自动部分收集器收集，每管6--8ml，每小时6-8管。按紫外自动检测仪所录图谱，经紫外分光光度计于280nm测定光吸收值，以管数为横座标，光吸收值为枞座标作图，，按峰将收集液合并得各粗分组分。
对各粗分组分进行凝血酶样活力测定，对具有凝血酶活力较高的组分再经聚丙烯酰胺电泳以确定其止血酶组分，并用超滤器脱盐并浓缩至20ml。然后再经Q-Sephrose柱(3×100cm²)层析，用Nacl 0-0.8M直线梯度洗脱并收集，按上法得所要的止血酶组分。按上法浓缩至20ml，再经Superdex Sephadex柱层分离，最后得纯品20mg(以浓缩液或冻干粉保存)。
实例二，080826批蛇毒止血酶的生产：
将上例用DEAE-Sephadex A-50经再生后装柱(3.5×110cm²)，用0.06M pH8.2Tris-Hcl缓冲液平衡6小时。同时称取福建产尖吻蝮蛇毒2.5g溶于8ml上述缓冲液中，再经5000转/分离心10分钟，取上清液上柱。
将上述缓液于储存瓶和梯度瓶各加上述缓液1200ml，储存瓶则加入Nacl 52.8g，摇匀后连通梯度瓶，进行Nacl 0-0.8M直线梯度洗脱并用紫外自记录仪监测，洗脱液用自动部分收集，每管6-8ml，每小时6-8管。按紫外自动检测仪所录图谱，经紫外分光光度计于280nm测定光吸收值，以管数为横座标，光吸收值为枞座标作图，，按峰将收集液合并得各粗分组分。
对各粗分组分进行凝血酶样活力测定，对具有凝血酶活力较高的组分再经聚丙烯酰胺电泳以确定其止血酶组分，并用超滤器脱盐并浓缩至20ml。然后再经Q-Sephrose柱(3×100cm²)层析，用Nacl 0-0.8M直线梯度洗脱并收集，按上法得所要的止血酶组分。按上法浓缩至20ml，再经Superdex Sephadex柱层分离，最后得纯品20mg(以浓缩液或冻干粉保存)。对各粗分组分进行凝血酶样活力测定，对具有凝血酶活力较高的组分再经聚丙烯酰胺电泳以确定其止血酶组分，并用超滤器脱盐并浓缩至20ml。然后再经Q-Sephrose柱(3×100cm²)层析，用Nacl 0-0.8M直线梯度洗脱并收集，按上法得所要的止血酶组分。按上法浓缩至20ml，再经Superdex、Sephadex柱层分离，最后得纯品26mg(以浓缩液或冻干粉保存)。
本批产品经HPLC(正、反相)检测，其纯度为98.6％，经毛细管电泳检测，其纯度为99.2％；经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳见分子量为16500和14500的两条色带，未见任何杂带；经酶活力测定其比活力为110U/mg。
最后经配方(按每支1U加赋型剂和稳定剂配制)、超滤分装冻干压盖得注射用蛇毒止血酶成品(每支1U)3100支。
一种蛇毒止血酶_ST25.txt
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院昆明动物研究所
<120>一种蛇毒止血酶
<130>1
<160>2
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>135
<212>PRT
<213>Dienagkistrodon acutus
<400>1
Asp Phe Asn Cys Pro Pro Gly Trp Ser Ala Tyr Asp Gln Tyr Cys
Tyr
1               5                   10                  15
Gln Val Ile Lys Glu Pro Lys Asn Trp Asp Asp Ala Glu Arg Phe
Cys
            20                  25                  30
Thr Glu Gln Ala Asp Gly Gly His Leu Val Ser Ile Glu Ser Lys
Gly
        35                  40                  45
Glu Arg Asp Phe Val Ala Gln Leu Val Ser Gln Ser Ile Glu Ser
Val
    50                  55                  60
一种蛇毒止血酶_ST25.txt
Glu Asp His Val Trp Thr Gly Leu Arg Val Gln Asn Lys Glu Lys
Gln
65                  70                  75
80
Cys Ser Thr Glu Trp Ser Asp Gly Ser Ser Val Ser Tyr Glu Asn
Leu
                85                  90                  95
Leu Glu Leu Tyr Met Arg Lys Cys Gly Ala Leu Asp Arg Asp Thr
Gly
            100                 105                 110
Phe His Lys Trp Ile Asn Leu Gly Cys Ile Gln Leu Asn Pro Phe
Val
        115                 120                 125
Cys Lys Phe Pro Pro Gln Cys
    130                 135
<210>2
<211>126
<212>PRT
<213>Dienagkistrodon acutus
<400>2
Gly Phe Cys Cys Pro Leu Arg Trp Ser Ser Tyr Glu Gly His Cys
Tyr
1               5                   10                  15
一种蛇毒止血酶_ST25.txt
Leu Val Val Lys Glu Lys Lys Thr Trp Asp Asp Ala Glu Lys Phe
Cys
            20                  25                  30
Thr Glu Gln Arg Lys Gly Gly His Leu Val Ser Val His Ser Arg
Glu
        35                  40                  45
Glu Ala Asp Phe Leu Val His Leu Ala Tyr Pro Ile Leu Asp Leu
Ser
    50                  55                  60
Leu Ile Trp Met Gly Leu Ser Asn Met Trp Asn Asp Cys Lys Arg
Glu
65                  70                  75
80
Trp Ser Asp Gly Thr Lys Leu Asp Phe Lys Ser Trp Ala Lys Thr
Ser
                85                  90                  95
Asp Cys Leu Ile Gly Lys Thr Asp Gly Asp Asn Gln Trp Leu Asn
Leu
            100                 105                 110
Asp Cys Ser Lys Lys His Tyr Phe Val Cys Lys Phe Lys Leu
        115                 120                 125