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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610126631.7 (22)申请日 2016.03.07 C12N 1/14(2006.01) C12P 7/48(2006.01) C12R 1/685(2006.01) (71)申请人 江苏国信协联能源有限公司 地址 214203 江苏省无锡市宜兴市经济开发 区热电路 1 号 申请人 江南大学 (72)发明人 胡志杰 陈坚 石贵阳 蒋小东 蒋建秋 孙福新 傅静 高超 蒋敏 (74)专利代理机构 江苏英特东华律师事务所 32229 代理人 邵鋆 (54) 发明名称 一种生产柠檬酸的黑曲霉的控制培养方法 (57) 摘要 本发明公。
2、开了一种生产柠檬酸的黑曲霉的控 制培养方法， 针对现有技术中使用小麦麸皮培养 基时的工作量大， 操作不方便， 该方法不适用于大 批量生产等不足 ； 通过改用玉米芯颗粒作为培养 基成分的大麸曲， 并革新培养方式， 从而降低了淘 汰率， 节约了成本， 又提高工作效率， 同时操作简 便， 更重要的是提高了产能。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 CN 105543113 A 2016.05.04 CN 105543113 A 1.一种生产柠檬酸的黑曲霉的控制培养方法， 其特征在于包括以下步骤： （1） 经过分离纯化获得黑曲。
3、霉单菌落； （2） 单菌落接种于试管斜面培养获得一代菌种； （3） 一代菌种孢子接种茄子瓶培养基获得二代孢子； （4） 二代菌种孢子接种到大麸曲培养基获得成熟的生产用孢子， 培养过程通入无菌空 气进行通风培养； 所述大麸曲培养基成分为玉米芯颗粒， 培养基： 水=1:1.52.0， 培养温度 为2629， 培养时间为910天。 2.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 （1） 中培养温度为3537， 培养时 间为3538h。 3.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中培养温度为3336， 培养时 间为56天。 4.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤。
4、 （3） 中培养温度为3336， 培养时 间为78天。 5.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 （4） 中培养温度为2629， 培养时 间为910天。 6.如权利要求1-5任一项所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 （4） 中无菌空气湿度控制 在2540%， 进气流量为1015L/min。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105543113 A 2 一种生产柠檬酸的黑曲霉的控制培养方法 技术领域 0001 本发明涉及微生物培养领域， 具体涉及一种生产柠檬酸的黑曲霉的控制培养方 法。 背景技术 0002 柠檬酸是一种重要且产量较大的有机酸， 黑曲霉是生产柠檬酸的重要菌种,是一 种。
5、常见的真菌， 主要以孢子进行繁殖， 因此培养孢子是生产中的关键步骤。 0003 柠檬酸发酵普遍采用黑曲霉二级发酵方式， 即首先培养成熟的种子， 然后成熟的 种子液转接发酵培养。 传统种子培养过程是采用黑曲霉孢子接种方式， 需要大量成熟的黑 曲霉孢子， 黑曲霉孢子制备过程比较复杂。 一批成熟的黑曲霉孢子需要经过平板筛选， 斜面 培养， 茄子瓶培养， 最后麸曲桶培养等逐级扩大培养过程； 制备过程繁琐， 活性筛选复杂， 工 作量大， 制备周期需要30d以上。 同时， 采用孢子接种方式培养种子工艺， 仅孢子萌发需要至 少12h， 因而成熟种子培养时间较长。 0004 目前制备黑曲霉麸曲的培养基主要采用。
6、单一的小麦麸皮， 其培养基水分大约控制 在65-70wt%左右， pH值大约在6.3-6.5之间。 然而， 使用这样的麸皮培养基在灭菌过程中， 存 在培养基易结块、 灭菌效果不够高的问题。 该方法工作量大， 操作不方便， 随着柠檬酸产量 的日渐扩大， 该方法不适用于大批量生产。 0005 因此， 需要寻找一种既减少工作量， 操作简便， 又能适应柠檬酸增产的黑曲霉孢子 扩大培养的方法。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供克服上述问题， 提供一种工作量小、 孢子淘汰率低并且种 子罐培养的稳定性高的黑曲霉孢子扩大培养的方法。 0007 为了达到上述目的， 本发明所采用的技术方案为： 一种生产柠。
7、檬酸的黑曲霉的控制培养方法， 其特征在于包括以下步骤： （1） 经过分离纯化获得黑曲霉单菌落； （2） 单菌落接种于试管斜面培养获得一代菌种； （3） 一代菌种孢子接种茄子瓶培养基获得二代孢子； （4） 二代菌种孢子接种到大麸曲培养基获得成熟的生产用孢子， 培养过程通入无菌空 气进行通风培养； 所述大麸曲培养基成分为玉米芯颗粒， 培养基： 水=1:1.52.0， 培养温度 为2629， 培养时间为910天。 0008 优选地， 所述步骤 （1） 中培养温度为3537， 培养时间为3538h。 0009 优选地， 所述步骤 （2） 中培养温度为3336， 培养时间为56天。 0010 优选地， 。
8、所述步骤 （3） 中培养温度为3336， 培养时间为78天。 0011 优选地， 所述步骤 （4） 中培养温度为2629， 培养时间为910天。 0012 进一步地， 所述步骤 （4） 中无菌空气湿度控制在2540%， 进气流量为1015L/min。 说明书 1/3 页 3 CN 105543113 A 3 0013 采用本发明的技术方案操作更为简便， 淘汰率低， 既节约成本， 又提高工作效率， 更重要的是提高了产能。 具体实施方式 0014 下面通过具体实施例对本发明作出详细描述， 以使本领域技术人员可以更好地理 解本发明， 从而对本发明要求保护的范围作出清楚的限定。 0015 本发明提供了。
9、一种生产柠檬酸的黑曲霉的控制培养方法， 下面具体对本发明的技 术方案做进一步的阐述。 0016 实施例1 1、 大麸曲培养基制备 大麸曲培养基成分为玉米芯颗粒， 已脱干水分， 称量2000g大麸曲倒入麸曲桶中， 根据 大麸曲： 水=1:1.8的比例添加去离子水， 灭菌后备用。 0017 2孢子的培养 （1） 一代菌种培养 采用中国工业微生物菌种保藏管理中心 （CICC） 保藏的黑霉CICC40021菌种作为培养的 菌种， 刮取一环将本公司保藏的黑曲霉菌种于100mL无菌水中， 振荡20min,使用脱脂棉过滤 孢子液， 使用无菌水将孢子液稀释至104， 然后吸取100 L涂布平板， 培养温度为3。
10、5， 培养 时间为36h。 挑选长势良好的单菌落接种于试管斜面培养基， 培养温度为35， 培养时间为6 天。 0018 （2） 二代菌种培养 将刮取12环成熟的一代菌种孢子， 接种至茄子瓶培养基， 将孢子均匀涂布于固体培养 基表面。 培养温度为35， 培养时间为7天。 0019 （3） 大麸曲孢子培养 将成熟的二代菌种的茄子瓶中加入100mL的无菌水， 将孢子洗脱下来形成孢子液， 再将 孢子液全部倒入步骤1中已制备好的麸曲桶中， 摇匀后上架培养， 进气流量为10L/min， 培养 温度为28， 培养时间为9天。 0020 培养过程中需要进行翻曲， 培养第2天至第4天， 每4h翻曲一次； 培养第。
11、一天及第 5天起， 每天8h翻曲一次。 0021 3孢子淘汰率计算 每天将培养结束的大麸曲孢子进行镜检， 检查是否染杂菌， 染菌的孢子立即淘汰， 总计 一个月生产总数和淘汰总数， 淘汰率=100%， 一个月的淘汰率结果如表1所示。 0022 4孢子接种量 培养结束之后， 将8L无菌水倒入麸曲桶中， 摇匀后获得孢子悬浮液， 该孢子悬浮液直接 用于种子罐接种。 0023 生产种子罐接种量需要约31012个孢子， 而麸曲桶中悬浮液的孢子总数约为78 1011个孢子， 需要接种4桶孢子悬浮液。 0024 对比例 1、 麸皮培养基的制备 说明书 2/3 页 4 CN 105543113 A 4 麸皮培养。
12、基的成为为小麦麸皮， 小麦麸皮先经过淘洗， 然后脱水， 水分控制在40%； 称取 50g制备好的麸皮放置在1L的三角瓶中， 包扎灭菌， 冷却后接种。 0025 2孢子的培养 按照实施例1中步骤 （1） 和 （2） 进行相同的操作。 获得成熟的二代菌种， 刮取1环成熟的 二代菌种孢子接种至制备好的麸皮培养基中进行培养， 培养温度为35， 培养时间为7天。 培养过程中前三天每天翻曲2次， 每12小时一次。 0026 3孢子淘汰率计算 按照实施例1中的步骤3的方法进行淘汰率的计算， 一个月的淘汰率结果如表1所示。 0027 4孢子接种量 培养结束之后， 将300mL无菌水倒入麸曲瓶中， 摇匀后获得孢子悬浮液， 每瓶孢子总数 约为121010个孢子,接种量为150瓶。 0028 表1 通过表1可以看出大麸曲培养比麸皮培养操作更为简便， 淘汰率低， 既节约成本， 又提 高工作效率， 更重要的是提高了产能。 说明书 3/3 页 5 CN 105543113 A 5 。