技术领域
本发明属于生物技术和肿瘤学领域，尤其是涉及膀胱癌组织中piRNA生物标志物及其表 达量的检测方法。
背景技术：
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，全球，膀胱癌在男性肿瘤中位列第七，在女 性中位列第十七。在我国泌尿系统肿瘤中，膀胱癌无论是发病率还是死亡率均居首位并且发 病率呈逐年升高趋势，大部分患者年龄介于50-60岁之间。膀胱癌90%以上为移行上皮细胞 癌，按病理分期可分为浅表性膀胱癌(早期）和肌层浸润性膀胱癌（进展期）。膀胱癌的发生 发展，可严重影响患者的生存及生活质量，因此寻找敏感特异的可用于早期诊断的生物学标 志物，以期达到利用其开展预防、筛检及诊断，从而改善膀胱癌患者的生存及生活质量。
RNA的研究近年来备受科学界的广泛关注，尤其是一些非编码的小RNA（non-coding RNA，ncRNA）分子，这些ncRNA分子可以调节细胞生长和发育的重要生理过程。ncRNA 调控细胞的生命过程包括转录水平和转录后水平的基因沉默。一般小ncRNA可以分为三类： siRNAs，microRNAs（miRNAs）和PIWI-interacting RNAs（PIWI蛋白相关非编码RNAs， 简称piRNAs）[2]。其中piRNA的研究比较少，piRNA潜在的功能和生物起源与miRNA和 siRNA存在明显不同。piRNA长度约26nt–31nt，可与PIWI蛋白结合形成piRNA复合物（piRC） 而发挥其生物学功能。不同于miRNA，piRNA不是由含茎环结构的前体剪切产生。piRNA 序列的基因组分布表明，piRNA通常成簇出现，并且有很强的正义链或反义链专一性。
对于piRNA的产生机制，目前尚无直接的生物化学证据。但是一个基于生物信息学分析 提出了“乒乓模型”假说。该模型认为：反义链的piRNA前体经过某些未知核酸酶的加工，生 成了5’端具有U（尿嘧啶）偏爱性的初级piRNA，这些piRNA与Aub或Piwi蛋白结合形成 piRC，piRC在piRNA的引导下，通过碱基互补配对的方式识别并结合正义链的piRNA前体， 然后将正义链piRNA前体进行剪切切割，产生次级piRNA的5’端，而后该次级piRNA被某 种核酸酶切割形成3’端，最后生成成熟的正义链piRNA。正义链piRNA与Ago3（PIWI）结 合形成piRC，通过类似的方式识别并切割反义链的piRNA前体。这样就形成了一个piRNA 生物发生循环，正义链与反义链的相互识别，通过piRC的剪切切割，循环产生piRNA。目 前该“乒乓模型”假说，得到了许多学者的广泛认同。
值得注意的是，在2006年7月的Nature杂志上面，两个独立的课题组同期发表了关于 piRNA的文章，Aravin等运用Northern blot的方法证实只有生殖细胞中才存在piRNA，同时 Girard等也证明了这种存在形式。近来，也有不少研究报道了piRNA与人类肿瘤之间的相关 性，但是机制方面的研究较少。如Lu等采用Solexa测序的方法，发现piRNA在人宫颈癌 HeLa细胞中存在，Chen等也发现piRNA存在于人的多种肿瘤细胞中。另外Chen等在piRNA 的研究中发现，piRNA-651与胃癌的临床分期显著相关，同时观察到其在胃癌、结肠癌、肺 癌以及乳腺癌组织中的表达水平显著高于其对应的癌旁组织，提示该piRNA可以作为肿瘤诊 断潜在的生物标志物。
目前对于膀胱组织中piRNA的提取及检测尚缺乏，另现有技术中均没有涉及到膀胱癌组 织及其对应癌旁正常组织中与哪些piRNA相关。
发明内容
解决的技术问题：本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种用于诊断膀胱癌 的piRNA生物标志物及其应用，建立膀胱癌患者组织piRNA的表达谱，揭示组织中piRNA 对膀胱癌诊断的价值，为临床上膀胱癌早期发现提供基础。
技术方案：一种与膀胱癌相关的piRNA生物标志物，所述生物标志物：piRNA共197 个，其中：
上调的106个，如SEQ ID No.1～106所示：piR-52681、piR-48765、piR-36984、piR-52373、 piR-31112、piR-36360、piR-61291、piR-54826、piR-51747、piR-43148、piR-45726、piR-48368、 piR-58119、piR-57089、piR-39017、piR-43887、piR-37525、piR-39614、piR-39018、piR-35831、 piR-39592、piR-33050、piR-34998、piR-38355、piR-56914、piR-34920、piR-37523、piR-45582、 piR-51256、piR-37524、piR-52680、piR-31111、piR-56252、piR-58255、piR-31101、piR-30597、 piR-32079、piR-54098、piR-34984、piR-31108、piR-34000、piR-31961、piR-33650、piR-57293、 piR-33470、piR-36475、piR-47132、piR-45029、piR-58050、piR-36707、piR-60668、piR-34756、 piR-47161、piR-55637、piR-44190、piR-31013、piR-50437、piR-33543、piR-43217、piR-38376、 piR-50657、piR-61404、piR-51364、piR-48118、piR-30327、piR-54136、piR-45459、piR-44085、 piR-52697、piR-49813、piR-57447、piR-39232、piR-57132、piR-39763、piR-45051、piR-33043、 piR-53177、piR-43105、piR-57140、piR-40110、piR-37972、piR-40982、piR-42947、piR-43876、 piR-38354、piR-57141、piR-57567、piR-44956、piR-33368、piR-56037、piR-57143、piR-43107、 piR-33733、piR-57142、piR-57139、piR-34534、piR-56276、piR-32683、piR-55475、piR-34532、 piR-33730、piR-59160、piR-61324、piR-49600、piR-52323、piR-38240；
下调的91个，如SEQ ID No.107～197所示，：piR-60152、piR-34373、piR-30504、piR-34374、 piR-55023、piR-34375、piR-43452、piR-52155、piR-34380、piR-34379、piR-44265、piR-40154、 piR-34420、piR-48578、piR-35688、piR-56066、piR-37243、piR-47995、piR-49208、piR-34377、 piR-56061、piR-34376、piR-38145、piR-58986、piR-30506、piR-37988、piR-33851、piR-39786、 piR-56470、piR-43801、piR-45852、piR-58572、piR-49842、piR-49039、piR-51517、piR-35536、 piR-35924、piR-33814、piR-47258、piR-32538、piR-30436、piR-52398、piR-36439、piR-34177、 piR-52399、piR-35359、piR-31167、piR-56951、piR-42797、piR-40163、piR-31440、piR-32499、 piR-34422、piR-31133、piR-36614、piR-45571、piR-32406、piR-46447、piR-34348、piR-31252、 piR-45112、piR-54110、piR-58451、piR-49939、piR-49552、piR-39004、piR-30769、piR-40571、 piR-50830、piR-45655、piR-42221、piR-35166、piR-35167、piR-39572、piR-39516、piR-38856、 piR-35717、piR-33417、piR-38060、piR-55800、piR-33401、piR-39593、piR-35762、piR-53013、 piR-35899、piR-34726、piR-33466、piR-34194、piR-54213、piR-58463、piR-34366。
一种与膀胱癌相关的piRNA生物标志物，所述生物标志物为上调的piR-52681和下调的 piR-60152。
所述的piRNA生物标志物在制备膀胱癌检测试剂盒中的应用。
与膀胱癌相关的piRNA生物标志物的检测及表达谱建立方法，包括以下步骤：
（1）使用Trizol试剂（Invitrogen）从膀胱癌患者的癌组织及其对应的癌旁组织中提取总 RNA，通过Array Star的piRNA芯片筛选出候选差异表达的piRNA；
（2）RNA逆转，采用miScript逆转录试剂盒（Qiagen）对RNA提取液进行逆转录反应， 获得cDNA溶液；
（3）PCR检测，运用miScript SYBR Green PCR检测试剂盒对步骤（2）中的cDNA溶 液进行PCR扩增反应，进而完成对候选piRNA的验证，建立膀胱癌piRNA表达谱。
与膀胱癌相关的piRNA生物标志物表达量的检测方法，采用SYBR qRT-PCR的方法检测 膀胱组织中piRNA的表达量：
（1）逆转录：采用miScript逆转录试剂盒（Qiagen）对提取出的总RNA进行逆转录反 应，具体操作依据该试剂盒的说明书进行，首先在0.5mL离心管中加入5μL DEPC双蒸水、 继而加入1μL逆转录混合试剂和4μL RT缓冲液，最后加入10μL0.1μg/μL的总RNA，总反 应体系20μL，该方法的反应条件为：37℃反应1小时，95℃反应5分钟，得到cDNA溶液；
（2）piR-52681实时荧光定量PCR检测：采用miScript SYBR Green PCR检测试剂盒对 步骤（1）中获得的cDNA溶液进行PCR扩增反应，扩增引物为piR-52681扩增上游引物和 PCR检测的小RNA通用的下游引物，再用ABI7900HT Real-Time PCR仪检测，具体操作依 据该试剂盒与荧光定量PCR仪说明书进行，反应体系包括：1μL piR-52681扩增上游引物和1μL PCR检测的小RNA通用的下游引物，5μL SYBR Green PCR反应缓冲液，2μL DEPC双蒸水 以及1μL0.1μg/μL cDNA稀释液，该方法的反应条件：95℃预变性15分钟，94℃变性15秒， 60℃退火30秒，70℃延伸30秒，94℃-70℃的阶段共40个循环；
（3）piR-60152实时荧光定量PCR检测：与步骤（2）中的方法相同，所不同的只是扩 增的上游引物由piR-52681特异性扩增上游引物代替piR-60152，检测得到膀胱癌组织及癌旁 组织中piR-60152的表达水平；
（4）U6实时荧光定量PCR检测：与步骤（2）中的方法相同，所不同的只是扩增的上 游引物有piR-52681特异性扩增上游引物代替U6，检测得到膀胱癌组织及癌旁组织中U6的 表达水平；在本方案中U6作为piR-52681与piR-60152的内参。
有益效果：本发明首次发现piRNA在膀胱癌临床早期鉴别诊断中，可作为一种重要的生 物学检测指标，为今后膀胱癌piRNA的研究提供了理论依据，并为分子水平诊断膀胱癌提供 了新的思路，具有重大的理论意义和潜在的使用价值。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR检测piR-52681在膀胱癌组织及癌旁组织中的表达；
图2为实时荧光定量PCR检测piR-60152在膀胱癌组织及癌旁组织中的表达。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细的说明：本实施例在以本发明技术方案的前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的包含范围不限于下述实施例。下面的实施 例中未注明的条件和方法等均按照常规进行。
实施例1：样本的收集及组织中RNA的提取
收集到19对新发的膀胱癌及其对应癌旁正常组织。组织来源于2010年1月至2012年6 月，且经过医院病理诊断确认，所有研究对象均签署知情同意书。
使用Trizol法提取组织中的总RNA：称取100mg的膀胱癌组织或者癌旁正常组织放于玻 璃研磨器中，继而加入液氮研磨至组织变成干粉状，而后将干粉用刮子转移至1.5mL去RNA 酶的离心管中（管中提前加好1mL Trizol溶液），颠倒混匀10下，室温静置5分钟；每1mL Trizol 中加入0.2mL氯仿，盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5 分钟后12000g离心15分钟；将上层水相转入新的1.5mL去RNA酶的离心管中（上清量约 0.4-0.5mL），加入0.5mL异丙醇，混匀后放于-20℃中1小时，然后12000g离心10分钟；小 心倒掉上清液，留取离心管底部的沉淀，加1mL现配的75%wt的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA 沉淀一次，最后7500g离心5分钟；小心倒掉上清，而后将带有沉淀的离心管置于超净工作 台开风机吹干（约30分钟，此时RNA沉淀变透明）；在离心管中加20μL的DEPC水溶解， 可在55-60℃下孵育10分钟助溶。提取好的总RNA保存于-70℃的超低温冰箱中，或立即用 于逆转录。总RNA质量分析：通过对RNA A230、A260及A280的检测（A260/A280=1.8-2.1, A260/A230>1.80;），以及对总RNA采用琼脂糖凝胶电泳，根据28S rRNA与18S rRNA的比 值分析总RNA的质量。
样本流行病学及临床资料的调查
所有患者的膀胱组织都经过两名病理医生的病理诊断，纳入本研究前未患其它肿瘤，且 未经放射或化学药物治疗。调查内容包括一般人口学特征、临床资料、吸烟史、饮酒史、饮 食、个人史和家族史等。吸烟者定义为每天吸烟超过1支并持续一年以上，累计吸烟量“包年” 按(每日吸烟量/20)×吸烟年数来计算。饮酒者定义为每周至少3次，持续一年以上。
piRNA表达谱用于筛选膀胱癌及其对应癌旁正常组织中差异表达的候选piRNA
随机抽取3对癌及癌旁正常组织，采用人piRNA芯片检测了23677个piRNAs。统计学 分析结果显示：差异表达2倍以上且P值小于0.05的piRNA基因数为197个，其中上调的 106个，下调的91个（表1）。我们列出了差异表达上调、下调最显著的前十个piRNAs（表 2）。
膀胱癌组织及其癌旁正常组织中piRNA表达量的检测方法
采用SYBR qRT-PCR的方法检测膀胱组织中piRNA的表达量
（1）逆转录：采用miScript逆转录试剂盒（Qiagen）对提取出的总RNA进行逆转录反 应，具体操作依据该试剂盒的说明书进行。首先在0.5mL离心管中加入5μL DEPC双蒸水、 继而加入1μL逆转录混合试剂和4μL RT缓冲液，最后加入10μL0.1μg/μL的总RNA，总反 应体系20μL。该方法的反应条件为：37℃反应1小时，95℃反应5分钟，得到cDNA溶液。
（2）piR-52681实时荧光定量PCR检测：采用miScript SYBR Green PCR检测试剂盒对 （1）中获得的cDNA溶液进行PCR扩增反应，扩增引物为piR-52681扩增上游引物和PCR 检测的小RNA通用的下游引物，再用ABI7900HT Real-Time PCR仪检测，具体操作依据该 试剂盒与荧光定量PCR仪说明书进行。反应体系包括：1μL piR-52681扩增上游引物和1μL PCR检测的小RNA通用的下游引物，5μL SYBR Green PCR反应缓冲液，2μL DEPC双蒸水 以及1μL cDNA稀释液（0.1μg/μL）。该方法的反应条件：95℃预变性15分钟，94℃变性15 秒，60℃退火30秒，70℃延伸30秒，94℃-70℃的阶段共40个循环。
（3）piR-60152实时荧光定量PCR检测：与（2）中的方法基本相同，所不同的只是扩 增的上游引物由piR-52681特异性扩增上游引物代替piR-60152，检测得到膀胱癌组织及癌旁 组织中piR-60152的表达水平。
（4）U6实时荧光定量PCR检测：与（2）中的方法基本相同，所不同的只是扩增的上 游引物有piR-52681特异性扩增上游引物代替U6，检测得到膀胱癌组织及癌旁组织中U6的 表达水平。在本实验中U6作为piR-52681与piR-60152的内参。
分析piR-52681（DQ585569）和piR-60152（DQ594040）对膀胱癌的诊断价值
实例中piRNA的表达是以CT值来表示。CT值代表一种目的piRNA分子达到实验设计 阈值所需要的PCR循环的次数。在目的piR-52681、piR-60152和内参U6扩增效率相同的情 况下，可以直接得到目的piR-52681、piR-60152相当于内参的定量ΔCT=CT目的-CT内参。采用 2-ΔCT表示目的piRNA表达相对于内参U6表达变化的倍数。所有的统计检验均为双侧概率检 验，P<0.05为差异有统计学意义。采用SPSS13.0软件做进一步的统计分析。
统计分析结果发现，piR-52681在膀胱癌组织中的表达显著高于其对应的癌旁正常组织 （癌组织与癌旁正常组织相比：7.58±7.49versus2.91±1.33,P=0.026）（图1）。piR-60152在 膀胱癌组织中的表达显著低于其对应的癌旁正常组织（癌组织与癌旁正常组织相比：3.95±2.05 versus8.82±7.81,P=0.027）（图2）。
表1.膀胱癌及癌旁正常组织中差异piRNA表达谱
续上表
续上表
续上表
续上表
aNCBI数据库
表2.差异表达上调、下调最显著的前十个piRNAs
aNCBI数据库
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了 解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所 做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 与膀胱癌相关的piRNA生物标志物及其应用
<130>
<160> 197
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgctagcctc acgaaactgg aataagcctt 30
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
agcccatgta aggagctgag tccttaaga 29
<210> 36
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
accccttgtg aagcccaaga tcgtcaaaa 29
<210> 37
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
cacaaagatg agtggtgaaa atctgatc 28
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
tggagaagag atcctgatca cggtgctgtc 30
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
gatgtctgtg tggaaagcgg ctgtgca 27
<210> 40
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
agccgagata gcttcctgaa acgtgtgaag ga 32
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
ctgtggagaa gagatcctga tcacggtgct 30
<210> 42
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
caaagatgag tggtgaaaat ctgatc 26
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
ctcacaaaga tgagtggtga aaatctgatc 30
<210> 44
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
tggtgagctg cgacaactgg atgaac 26
<210> 45
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
cggctgttaa ccgaaaggtt ggtggt 26
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
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gtcagggaca tttctgaagc gagcgt 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
tgaagcagag gcaatgaatt acgaag 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
tcgctggttc gaatccggct cggaggac 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
tgtcacgtgt gtggcaagat gctgagctc 29
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
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gttaagatgg cagagcccgg taatcgcata a 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ttcgatgaag agatgatgac gagtctgact 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaggagccac tgtggcgaca gaatgctagc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgaagctgca gaaccaacga ggtggcc 27
<210> 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgggaagtac gtcctggggt acaagca 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tcctaggact gaatcaccac cccagaagag ca 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agcacatgat gattccagcg tgcgtctgaa 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgcaatggca tgatctcggc tcactgc 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cgtgctgggc ccataaccca gaggtcgatg ga 32
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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tcccacgtgg ctgagactac aggtgcttgc 30
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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tacctgaaga tgaaagggga ctactaccgc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgcagaaagc tctgggtgtg cggcagta 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ttggaggatg aaacaaagga atctgact 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
tgccaccaat gtcgagcagg cgttcatgac 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
tgactgtgct gtcctgattg ttgctgc 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
acaaaaaatt acccgggcgt ggtggcagg 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
tggagatcct ggagctgtac tgtgac 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
tctcaaagtg ctgggattac aggcgtgagc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
tcctaaagtg ctggggttac aggcatgagc 30
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tgctagggtc acctgtaccc caggctggag c 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgatgagacg aagttgacgc tgcatgga 28
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<213> 人工序列
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tggtggatgc gcacactgcc gaagtc 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tagcagctgt atcgggcttc ctcatcctgc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tagggtcacc tgtaccccag gctggagctg c 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tcggaacctg cagacacttg tggagga 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccccccactg ctaaatttga ctggcta 27
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tcccaaagtg ctggaattac aggcgtga 28
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
tacagcacac tgatgggtct tgactc 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
tcacaaagat gagtggtgaa aatctgatc 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
tccatcgtta caatggcctc tttagaccca gc 32
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<400> 88
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
cgatcaagca gccgtgcaga gatgtgcctc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
tggtctcgaa ctcctgacct caggtgatct 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
tcccaaagtg ctgggaatac aggcatgagc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
ctcgaactcc tgacctcagg tgatctgcct 30
<210> 94
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
tggtctcgaa ctcctgacct caggta 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
gagaaagctc acaagaactg ctaactcat 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
tgggctgcgg tggccagggc cgtgagtc 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
catttgcggc cggcgccagg gtggag 26
<210> 99
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
tgggaacctg cagacacttg tggaggag 28
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
gagaaagctc acaagaactg ctaactcaca 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctcctgaagt cagcgagacc acgaaccc 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
tgtgtgctaa atgtgttcgt gacagg 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ttggaacaac cactgagcta cggaga 26
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<212> DNA
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tgatcaagca gccgtgcaga gatgtgcctc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 105
tgcctttgct gatctgacag gaggcagagc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 106
taccatcttg gctcactgca acctccgcct 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ttcaagccag gaaagcactg tagctccccc a 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaccaatgat gagacagtgt ttatgaa 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 109
accaatgatg agacagtgtt tatgaa 26
<210> 110
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 110
gaccaatgat gagacagtgt ttatgaaa 28
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 111
tggcccctta cccttccaga gatgaagccc 30
<210> 112
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 112
gaccaatgat gagacagtgt ttatgaac 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 113
tccccaaaac aagcacagta gcctgcacag t 31
<210> 114
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 114
tgcctgatga tctgagatgg aacggt 26
<210> 115
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 115
gaccaatgat gagtattctg gggtgtctga a 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 116
gaccaatgat gagtattctg gggtgtctga 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 117
tcctcacacc gcacggcagg cacaga 26
<210> 118
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 118
tataccgaga cattccattg cccagggac 29
<210> 119
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 119
gacctatgat gatgactggt ggcgtatgag t 31
<210> 120
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 120
tgagatgctg atggggatct atgaacggat c 31
<210> 121
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 121
gctgttatgc atctaccggc gcccaccctc 30
<210> 122
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 122
tgggcaaggc agccagacag gcagtga 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 123
taactgaact taaaagaaaa gccaggga 28
<210> 124
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 124
tgactaatta gactgggaaa caagggc 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 125
tgaggtgtaa gcactgtatc aagacaggt 29
<210> 126
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaccaatgat gagattggag ggtgtctgaa t 31
<210> 127
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
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tgggcaagaa gcactgtctg caaggcc 27
<210> 128
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 128
gaccaatgat gagattggag ggtgtctgaa 30
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<211> 31
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<213> 人工序列
<400> 129
taccaatgat gagattggag ggtgtctgaa t 31
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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tgtggcctgc aaaggaaggt aagtaggtgg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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accaatgatg agattggagg gtgtctgaat 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 132
tacagctccc gtgtctggga agaagc 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 133
ctgcactgta gcctgggtga ccagagtga 29
<210> 134
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 134
taggtacaac ggattccggc gggcagagc 29
<210> 135
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 135
tggggtcctg cacagatggg acgtggctt 29
<210> 136
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 136
tcccttcccg acttgatgaa ggcagagtag c 31
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 137
tctgagaagc cacaccaacc tcgttccggg ga 32
<210> 138
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 138
tgtgagatgg agcaagatga aggccacatg t 31
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 139
tgatgatcct gagatgagac caaactg 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 140
tgaggccccg ggttcgatcc ccggca 26
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 141
tgccagggaa acagtctcaa ttttacactt 30
<210> 142
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 142
gcggtgtgac gagactcgcg tgggaagaa 29
<210> 143
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 143
ggcacagagc aggctaggtc tgccgcga 28
<210> 144
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 144
ctgagaagcc acaccaacct cgttccgggg at 32
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 145
tgaagttggg gccgagcaag aaagtgcga 29
<210> 146
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 146
caggctaatg ggaaacggag caaccacatg 30
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 147
acagcagcca gggatagcga aggtgg 26
<210> 148
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 148
tgcgcaggaa gactgagatg aggacc 26
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 149
gtaggatgaa aacactgggg ctgaaatgc 29
<210> 150
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 150
gaagatggag cagttgctag agacgatggt 30
<210> 151
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 151
tgcgcaggaa gactgagatg aggacccta 29
<210> 152
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 152
gccatctgag gtgtcgacag agaaagaga 29
<210> 153
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 153
agctgaaaaa ggagaaaggg tcactgag 28
<210> 154
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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tggtaggaat ggatgatgat gctgcagagg 30
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
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tccagggaga aaaataaaag gaagccatag a 31
<210> 156
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
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tatagagaaa gaaataaggg gacccggg 28
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 157
aggggaaaca caggaagtgt ttaaggcatg c 31
<210> 158
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
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caggagagta ggatgaaaac actggggctt t 31
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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gacctcaagg gaatgtagag aagcctcagg 30
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<213> 人工序列
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agcgcaggaa gactgagatg aggaccc 27
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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tcttgaggga cgctagaggt agtagatgtg t 31
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<213> 人工序列
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gacatgcata gagggaagac caggtgaaga 30
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tccaagaaat actgggagtg ctggaccc 28
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