功能性微生物多样性分析用引物和使用该引物的多重扩增.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102618632 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102618632 A *CN102618632A* (21)申请号 201210017537.X (22)申请日 2012.01.20 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 东北农业大学 地址 150030 黑龙江省哈尔滨市香坊区木材 街 59 号 (72)发明人 李洪涛 马波 刘华晶 许修宏 徐杰 (54) 发明名称 功能性微生物多样性分析用引物和使用该引 物的多重扩增 (57) 摘要 本发明公开了一种功能性微生物多样性分析 用引物和使用。

2、该引物的多重扩增， 涉及 3 对用于 功能性微生物多样性分析的针对 - 葡萄糖苷水 解酶基因的引物。经 DNAMAN6.0 软件进行序列同 源性比对后分别设计 - 葡萄糖苷水解酶 GH1 家 族的通用简并引物GH1F， GH1R， GH1R-GC， 和-葡 萄糖苷水解酶 GH3 家族细菌、 放线菌的通用简并 引物 GH3BF， GH3BR， GH3BF-GC， 以及 - 葡萄糖 苷水解酶 GH3 家族真菌的通用简并引物 GH3EF， GH3ER， GH3EF-GC， 本发明提供的引物具有很好的 通用性和实用性， 能良好的反应实验对象中参与 降解纤维素的功能性微生物的多样性， 可以适用 于来源于。

3、土壤， 沉积物， 人畜胃肠道等环境样品的 分析。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 1/1 页 2 1.一种功能性微生物多样性分析用引物， 其特征在于， 选择通用简并引物3对 ： GH1F和 GH1R-GC ； GH3BR 和 GH3BF-GC ； GH3ER 和 GH3EF-GC。 2. 根据权利要求 1 所述的功能性微生物多样性分析用引物， 其特征在于， 所述通用简 并引物为 GH1F 和 GH1R-GC。 3. 根据权利要求 1 所述的功能。

4、性微生物多样性分析用引物， 其特征在于， 所述通用简 并引物为 GH3BR 和 GH3BF-GC。 4. 根据权利要求 1 所述的功能性微生物多样性分析用引物， 其特征在于， 所述通用简 并引物为 GH3ER 和 GH3EF-GC。 5. 一种多重扩增检测方法， 其特征在于， 所述方法用于来源土壤， 沉积物， 人畜胃肠道 的环境样品的分析， 该方法包括利用权利要求 1-4 任一项所述的引物进行扩增。 权 利 要 求 书 CN 102618632 A 2 1/6 页 3 功能性微生物多样性分析用引物和使用该引物的多重扩增 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及功能性微生物多样性分析用。

5、引物和使用该引物的 多重扩增， 具体地说， 涉及功能性微生物多样性分析用针对 - 葡萄糖苷水解酶基因的引 物和使用所述引物的多重扩增。 背景技术 0002 - 葡萄糖苷水解酶是微生物降解纤维素反应中的限速酶， 他作用于由葡聚糖内 切酶和葡聚糖外切酶分解纤维素产生的纤维二糖分子和一些更小的寡聚糖分子， 将其水解 生成葡萄糖分子供微生物利用， 因此 - 葡萄糖苷水解酶在自然界碳循环中发挥着重要的 作用。 自然界中能产生-葡萄糖苷水解酶的微生物种类繁多， 不同微生物的-葡萄糖苷 水解酶按其分子结构特征分属为配糖水解酶家族 1(GH1) 和配糖水解酶家族 3(GH3) 两类， 同一家族中的 - 葡聚糖。

6、苷酶基因同源性较高， 这使 - 葡萄糖苷水解酶基因具备了作为 分子标记基因应用于复杂微生态环境中功能性微生物群落多样性的研究。 0003 本研究通过数据库获得不同微生物 - 葡萄糖苷水解酶基因序列， 经 DNAMAN6.0 软件进行序列同源性比对后分别设计 - 葡萄糖苷水解酶 GH1 家族的通用简并引物， 和 - 葡萄糖苷水解酶 GH3 家族细菌、 放线菌的通用简并引物， 以及 - 葡萄糖苷水解酶 GH3 家族真菌的通用简并引物。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服上述技术缺陷， 提供一种功能性微生物多样性分析用引物 和使用该引物的多重扩增， 所述引物能良好的反应实验对象中参与降解纤维素。

7、的功能性微 生物的多样性， 可以适用于来源于土壤， 沉积物， 人畜胃肠道等环境样品的分析。 0005 其技术方案为 ： 0006 一种功能性微生物多样性分析用引物， 选择通用简并引物 3 对 ： GH1F 和 GH1R-GC ； GH3BR 和 GH3BF-GC ； GH3ER 和 GH3EF-GC。 0007 进一步优选， 所述通用简并引物为 GH1F 和 GH1R-GC。 0008 进一步优选， 所述通用简并引物为 GH3BR 和 GH3BF-GC。 0009 进一步优选， 所述通用简并引物为 GH3ER 和 GH3EF-GC。 0010 一种多重扩增检测方法所述方法用于来源土壤， 沉积物。

8、， 人畜胃肠道的环境样品 的分析， 该方法包括本发明所述的引物进行扩增。具体方法如下 ： 0011 - 葡萄糖苷水解酶 GH1 家族基因的 PCR 扩增 0012 (1) 引物 ： 选择通用简并引物 GH1F 和 GH1R-GC 0013 (2) 反应体系及反应参数 ： 模板为纯化后的 DNA 0014 说 明 书 CN 102618632 A 3 2/6 页 4 0015 加灭菌的去离子水补充反应体系， 总体积为 50L 0016 (3) 反应条件 ： 0017 0018 35 个循环后 1.5琼脂糖凝胶电泳检测。 0019 - 葡萄糖苷水解酶 GH3 家族 ( 细菌来源 ) 基因的 PCR。

9、 扩增 0020 (1) 引物 ： 选择通用简并引物 GH3BR 和 GH3BF-GC 0021 (2) 反应体系及反应参数 ： 模板为纯化后的 DNA 0022 0023 加灭菌的去离子水补充反应体系， 总体积为 50L 0024 (3) 反应条件 ： 0025 0026 35 个循环后 1.5琼脂糖凝胶电泳检测。 0027 - 葡萄糖苷水解酶 GH3 家族 ( 真菌来源 ) 基因的 PCR 扩增 0028 (1) 引物 ： 选择通用简并引物 GH3ER 和 GH3EF-GC 0029 (2) 反应体系及反应参数 ： 模板为纯化后的 DNA 0030 说 明 书 CN 102618632 A。

10、 4 3/6 页 5 0031 加灭菌的去离子水补充反应体系， 总体积为 50L 0032 (3) 反应条件 ： 0033 0034 35 个循环后 1.5琼脂糖凝胶电泳检测。 0035 样品 DNA 的提取 0036 改进的细菌基因组 DNA 的提取方法 ： 0037 DNA 提取液的配制 ： 100mmol/L Tris-HCl， 100mmol/L EDTA， 100mmol/L 磷酸钠， 1.5mol/LNaCl， 1 CTAB， pH8.0 0038 (1) 称取 3g 新鲜的堆肥样品， 加入 13.5mLDNA 提取液中 ； 0039 (2) 加入 50L 的蛋白酶 K(20mg/。

11、mL)， 于 225r/min 摇床上 37摇动 30min ； 再加 入 1.5mL 的 20 SDS， 65水浴 1.5h， 每隔 10 20min 颠倒混匀一次 ； 0040 (3)室温6,000r/min离心10min， 收集上清转移到50mL离心管中， 沉淀加入4.5mL 提取液和 20的 SDS0.5mL， 涡旋震荡 20s， 65水浴 10min ； 0041 (4) 室温 6,000r/min 离心 10min， 收集上清合并于上次上清。重复上述操作， 收集 上清与前两次上清合并 ； 0042 (5) 上清与等体积的氯仿异戊醇 (24 1 体积比 ) 充分混合， 6,000r/。

12、min 离心 10min， 吸取上层水相转移至另一 50mL 离心管中 ； 0043 (6) 以 0.6 倍体积的异丙醇室温沉淀 1h， 室温 16,000r/min 离心 15min， 收集核酸 沉淀 ； 0044 (7) 用预冷的 70乙醇洗涤沉淀， 用 200L 的 TE 溶解沉淀。 0045 真菌基因组 DNA 的提取 ： 0046 (1) 称 取 0.5g 玻 璃 珠 放 入 1.5mL 的 离 心 管 中， 加 入 0.4g 的 样 品， 加 入 1mlBufferSLX/ 巯基乙醇。在漩涡震荡器上震荡 5min ； 0047 (2) 在 70水浴中放置 10min， 每隔 2 3。

13、min 混匀一次。3000 5000r/min 室温 离心 5min， 转移 800L 的上清液到一个新的 2mL 的离心管中， 加入 270L 的 buffer SP2 震荡 30S 混合 均匀 ； 0048 (3) 冰浴 5min， 在 13000r/min4离心 5min， 转移上清到一个新的 2mL 的离心管 中， 加 0.7 体积的异丙醇， 充分混匀 ( 来回颠倒离心管 20 次 )， 4 13000r/min 离心 10min 说 明 书 CN 102618632 A 5 4/6 页 6 用来沉淀 DNA ； 0049 (4) 小心弃掉上清， 确定没有将 DNA 沉淀吸出， 用滤纸。

14、将液体吸干， 加 200L ElutionBuffer至离心管中， 震荡10S后加入50L 的HTR Reagent(使用前要摇匀)， 震荡 混匀 10S ； 0050 (5)室温放置2min， 13000r/min离心2min ； 转移上清至一新的1.5mL的离心管中， 加入等体积的 XP2 Buffer， 震荡混匀 10S ； 0051 (6) 将上述离心管中液体的 700L 放置到提供的 HiBind DNA column 中， 室温 10000r/min 离心 1min， 弃掉上清液， 将柱子重新放回收集管中， 重复一次后加 300L XP2 Buffer， 室温 10000r/min。

15、 离心 1min ； 0052 (7) 倒掉上清液， 再将柱子放回新的收集管中， 再用 700L 用无水乙醇稀释过的 SPWWash Buffer， 10000r/min离心1min， 倒掉上清液， 重复再加700L的SPW Wash Buffer 后离心 ； 0053 (8)弃掉液体将柱子放入一个空的收集管中13000r/min室温离心2min， 这一步骤 很重要， 处理不当会影响下游操作 ； 0054 (9) 将柱子放置到新的 1.5mL 的离心管中， 加入 30L 的去离子， 13000r/min 离心 1min 洗脱 DNA， 重复一次。 0055 变性梯度凝胶电泳 0056 采用 8。

16、的聚丙烯酰胺凝胶， 其中尿素浓度 40 70。电泳采用 D-code DGGE 系统 (Bio-Rad)， 电泳缓冲液为 1TAE， 在 130V 固定电压下电泳 17h， 进行硝酸银染色。 0057 条带的克隆序列分析 0058 从 DGGE 胶中选择特异条带切下， 用去离水冲洗净后放入灭菌离心管中， 加 30L 的去离子水， 放于 4冰箱 12-14h ； 0059 用测序引物 ( 不带 GC 夹子 ) 再次扩增， 扩增产物与 pMD18-T 载体连接后转化感受 态细胞， 提取质粒 DNA 后进行双酶切鉴定， 将阳性克隆菌液送测序公司测序。 0060 与现有技术相比， 本发明的有益效果为 。

17、： 0061 本发明提供的引物具有很好的通用性和实用性， 能良好的反应实验对象中参与降 解纤维素的功能性微生物的多样性， 可以适用于来源于土壤， 沉积物， 人畜胃肠道等环境样 品的分析。 附图说明 0062 图 1 是堆肥样品总 DNA 中 -glucosidase 基因 GH1 家族的 PCR 扩增结果图 ； 0063 图 2 是自然堆肥 - 葡萄糖苷水解酶 GH1 家族 DGGE 图谱 ； 0064 图 3 是堆肥样品总 DNA 中 -glucosidase 基因 GH3 家族 ( 细菌 ) 的 PCR 扩增结 果 ； 0065 图 4 是自然堆肥 - 葡萄糖苷水解酶 GH3 家族 ( 细。

18、菌 )DGGE 图谱 ； 0066 图 5 堆肥样品总 DNA 中 -glucosidase 基因 GH3 家族 ( 真菌 ) 的 PCR 扩增结果 ； 0067 图 6 自然堆肥 - 葡萄糖苷水解酶 GH31 家族 ( 真菌 )DGGE 图谱。 具体实施方式 说 明 书 CN 102618632 A 6 5/6 页 7 0068 下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细地说明。 0069 本发明通过数据库获得不同微生物 - 葡萄糖苷水解酶基因序列， 经 DNAMAN6.0 软件进行序列同源性比对后分别设计-葡萄糖苷水解酶GH1家族的通用简并引物(GH1F， GH1R， GH1R-GC)。

19、， 和 - 葡萄糖苷水解酶 GH3 家族细菌、 放线菌的通用简并引物 (GH3BF， GH3BR， GH3BF-GC) 以及 - 葡萄糖苷水解酶 GH3 家族真菌的通用简并引物 (GH3EF， GH3ER， GH3EF-GC)。 0070 - 葡萄糖苷水解酶 GH1 家族基因阳性微生物群落的组成 0071 简并引物扩增 - 葡萄糖苷水解酶基因 (GH-1 家族 ) 得到约 400bp 的目的片段， 反应特异性好。结果显示堆肥样品 DNA 中目的条带扩增效果见图 1。 0072 从图 2 中可以观察到堆肥第 3-12 天 ( 即高温期的前期 ) 条带与堆肥其他时期明 显不同。堆肥第 14-26 。

20、天 ( 即高温期的后期及降温期 ) 条带图谱变化不大， 同高温期的前 期条带图谱差别明显。在高温堆肥处理农业固体废弃物过程中， 高温期前期多糖和淀粉类 等易分解物质降解迅速， 而这一时期纤维素分解缓慢， 随着堆肥进程的发展易分解的有机 质分解殆尽后纤维素类物质开始大量为微生物所分解利用。 这解释了本研究中堆肥高温期 - 葡萄糖苷水解酶 GH1 家族条带的变化趋势， 即高温期后期及降温期条带的指示菌与纤 维素类物质分解有关联。堆肥第 31 天堆体进入腐熟期， 之前出现的条带消失且没有新条带 出现， 指示尽管该时期仍为纤维素类物质快速分解期， 但没有或很少有 - 葡萄糖苷水解 酶 GH1 家族条带。

21、指示菌参与， 这在 PCR 结果中已有体现。 0073 - 葡萄糖苷水解酶 GH3 家族基因阳性微生物群落的组成 0074 简并引物扩增 - 葡萄糖苷水解酶基因 (GH-3 家族原核微生物来源 ) 得到约 370bp的目的片段， 反应特异性好。 结果显示堆肥第20， 22， 26， 31天样品DNA中目的条带扩 增效果不明显见图 3。 0075 从图 4 中可以观察到堆肥的不同时期即高温期前期和高温期后期及降温腐熟期 图谱条带 区别明显， 结合PCR结果可知在纤维素物质快速降解的时期(即高温期中后期和 降温腐熟期 )， 具有 - 葡萄糖苷水解酶基因 GH-3 家族的原核微生物没有或有很少种类和。

22、 数量的细菌参与纤维素物质的分解。 0076 简并引物扩增 - 葡萄糖苷水解酶基因 (GH-3 家族真核微生物来源 ) 得到约 500bp的目的片段， 反应特异性好。 结果显示堆肥第20， 22， 26， 31天样品DNA中目的条带扩 增特异性好见图 5。 0077 从图 6 中可以观察到堆肥的高温期末期和降温腐熟期条带变化不大， 降温腐熟期 条带多样性略有增加， 这与一般好氧堆肥进程中真菌菌群的动态变化是一致的， 即高温期 数量降低， 降温腐熟期数量及种类增加。表明具有 - 葡萄糖苷水解酶基因 GH-3 家族的真 菌在堆肥的高温期后期和降温期参与纤维素的分解， 并取代细菌在堆肥的低温阶段即第。

23、二 中温期发挥重要的功能。 0078 附 ： 本发明所涉及的引物序列 ： 0079 GH-3-E 家族 0080 上游引物 GH3EF(750bp) 0081 5 3 ： ggtggtcgcRRYtggga 0082 5 3 ： ggtggtcgc(ag)(ag)(ct)tggga 说 明 书 CN 102618632 A 7 6/6 页 8 0083 下游引物 GH3ER(1210bp) 0084 5 3 ： ccaggcatcggWcatRtc 0085 5 3 ： ccaggcatcgg(ta)cat(ag)tc 0086 对应序列 ： ga(tc)atg(at)ccgatgcctgg 。

24、0087 GH-3-B 家族 0088 上游引物 GH3BF 0089 5 3 ： ttcggcgaaga(tc)cc 0090 5 3 ： ttcggcgaagaYcc 0091 上游引物 GH3BFGC 0092 5 3 ： CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGttcggcgaagaYcc 下 游 引 物 GH3BR 0093 5 3 ： acgcctt(ct)(ga)(at)a(ag)cc 0094 5 3 ： acgccttYRWaRcc 0095 GH-1 家族 0096 上游 GH1F 0097 5 3 ： cctaccagat(tc)ga(a。

25、g)gg 16bp 63 0098 5 3 ： cctaccagatYgaRgg 16bp 63 0099 下游 GH1R 0100 5 3 ： gaggaag(ag)tccca(ag)tg 16bp 64 0101 5 3 ： gaggaagRtcccaRtg 16bp 64 0102 下游 GH1RGC 0103 5 3 ： CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGgaggaagRtcccaRtg。 说 明 书 CN 102618632 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102618632 A 9 2/2 页 10 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102618632 A 10 。