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1、(10)授权公告号 CN 202401075 U (45)授权公告日 2012.08.29 CN 202401075 U *CN202401075U* (21)申请号 201220000408.5 (22)申请日 2012.01.04 C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (73)专利权人 浙江爱易生物医学科技有限公司 地址 316000 浙江省舟山市定海区兴舟大道 157 号 101 室 (72)发明人 任峻 张华忠 (54) 实用新型名称 儿童哮喘基因位点检测试剂盒 (57) 摘要 本实用新型提供了一种检测儿童哮喘基因位 点是否发生突变从而评估儿童罹。
2、患哮喘风险性的 试剂盒， 由包装盒体 1、 衬垫 2、 装有检测两个 SNP 位点的荧光定量PCR反应液的两个试管3、 装有阳 性对照品的一个试管 4、 装有阴性对照品的一个 试管 5 组成， 衬垫上设有容器孔， 分别放置两管荧 光定量 PCR 反应液 3、 阳性对照品 4 和阴性对照品 5。 本实用新型试剂盒运用荧光定量PCR技术实现 了同时检测两个儿童哮喘基因 SNP 位点基因型的 目的， 相对于现有的荧光定量 PCR 试剂盒只检测 一个 SNP 位点， 本实用新型试剂盒将与同一疾病 的两个 SNP 位点检测整合在一个试剂盒内， 使用 更方便而且成本更低， 对儿童罹患哮喘风险性的 评估也更。
3、便捷。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)实用新型专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种儿童哮喘基因位点检测试剂盒， 其特征是由包装盒体 （1） 、 衬垫 （2） 、 装有检测 两个 SNP 位点的荧光定量 PCR 反应液的两个试管 （3） 、 装有阳性对照品的一个试管 （4） 、 装 有阴性对照品的一个试管 （5） 组成， 衬垫 （2） 上设有容器孔， 分别放置两管荧光定量 PCR 反 应液 （3） 、 阳性对照品 （4） 和阴性对照品 （5） 。 权 利 要 求。
4、 书 CN 202401075 U 2 1/4 页 3 儿童哮喘基因位点检测试剂盒 技术领域 0001 本实用新型涉及分子生物学和医学领域， 具体涉及检测儿童哮喘基因位点是否发 生突变的试剂盒， 通过同时检测与儿童哮喘关联的基因 ORMDL3 和 C5 的单核苷酸多态性位 点基因型来评估儿童罹患哮喘风险性。 背景技术 0002 儿童哮喘是儿童最常见的慢性支气管疾病， 以反复发作的呼吸困难、 伴有喘鸣音 出现为主要症状， 多在冬、 春季发病， 初次发病年龄多在学龄前。哮喘反复发作， 对儿童健 康、 学习和生活影响很大， 且部分儿童哮喘可迁延至承认哮喘， 成为终生疾患， 如诊治不及 时， 随病程延。
5、长可产生气道不可逆性狭窄和气道重塑， 因此， 对哮喘的合理防治至关重要。 0003 据证实， 儿童患哮喘有家族性说明该病和遗传因素有关， 因此遗传体质不同的人， 应该采取不同的疾病风险控制策略才能更好的预防哮喘的发生 ； 有效区分喘息性疾病患儿 的病因 （哮喘性和非哮喘性） ， 进行有效早期干预治疗， 将提高治疗的针对性， 避免过度化治 疗。利用现代科学研究成果， 开发一项基于分子遗传基础的儿童哮喘遗传辅助诊断与评估 预测产品会对儿童哮喘的发生起到预警、 个性化防治的作用。 0004 随着 “后基因组时代”的到来， 寻找基因与疾病之间的关系已成为新的研究热 点。由于哮喘的复杂性， 发现并鉴定其。
6、关联基因一直较为艰难。而以基因单核苷酸多态性 （SNPs,Single Nucleotide Polymorphisms） 分型分析为基础的全基因组关联分析 （GWAS, Genome-Wide Association Study） 则为我们提供了新的研究手段。根据研究发现染色体 17q21 内 ORMDL3 基因 SNPs 位点和在炎症反应中起重要作用的编码补体成分 5 （C5） 与儿童 哮喘易感性显著关联， 同时发现该标记与 ORMDL3 基因的转录水平亦关联。 0005 ORMDL3 基因是迄今为止发现的与哮喘关联最有充分证据的基因。ORMDL3 基因属 于新的基因家族 （ORMDL1 。
7、ORMDL2 和 ORMDL3） 的一个成员， 基因位于染色体 17q21 q21 1。有 3 个外显子， 2 个内含子， 141602 位为编码序列， 编码一个由 153 个氨基酸组成的位 于内质网膜的跨膜蛋白， 序列保守性很强。 0006 人类 ORMDL3 基因的表达模式是由通过 RT-PCR 和 Northem 印迹分析得到的。通过 对 16 名成人和胎儿组织样本进行 RT-PCR 表达分析， 发现 ORMDL3 基因家族的 3 个基因在 人体组织中均表达。其中在成人胰腺、 肝脏中表达水平较高， 在肺和胎盘中表达水平较低 ； 在胎儿的肺、 肝脏、 肾脏、 脾脏和胸腺中表达水平较高， 在。
8、大脑、 心脏和骨骼肌中表达水平较 低。 0007 Moffatt 等分析了有哮喘史的家庭组及对照组， 在 994 例儿童哮喘患者和 1243 个 对照中定义了超过 31.7 万个 SNP 位点。而染色体 17q21 上存在多个强烈的、 重复性的与 儿童哮喘发病相关的标记 SNPs， 在 2320 例德国儿童中 （P=0.0003） 和 3301 例英国儿童中 （P=0.0005） 各自独立进行的重复研究中， 同样发现染色体 17q21 表现出与儿童哮喘相关的 SNPrs7216389 始终并且强烈地 （P10-22） 与 ORMDL3 基因的转录水平相关。结果表面遗传变 异所调控的 ORMDL。
9、3 基因的表达水平是儿童哮喘易感性的因素之一。由于哮喘发病的复杂 说 明 书 CN 202401075 U 3 2/4 页 4 性， 相关基因的发现与鉴定一直较为艰难。 可采用高通量测序来进行定点候选基因的克隆， 基因单核苷酸多态性 （SNP） 分型分析和连锁不平衡 （LD） 基因定位可对候选基因进行更深 入的分析， 并且有可能确定其是否为哮喘相关基因。 0008 在 2005 年底发现的 118 个哮喘基因中， C5 基因已被证实与儿童哮喘密切相关， 主 要表现在炎症反应中。引起儿童哮喘的其中一个重要原因是气道炎症气道慢性炎症。不管 哪一种类型的哮喘， 哪一期的哮喘， 都表现为以肥大细胞、 。
10、嗜酸性粒细胞和 T 淋巴细胞为主 的多种炎症细胞在气道的浸润和聚集。 这些细胞互相作用可以分泌出数十种炎症介质和细 胞因子。 这些介质、 细胞因子与炎症细胞互相作用， 构成复杂的网络， 相互作用和影响， 使气 道炎症持续存在。当机体遇到诱发因素时， 这些炎症细胞能够释放多种炎症介质和细胞因 子， 引起气道平滑肌收缩， 黏液分泌增加， 血浆渗出和黏膜水肿。 已知多种细胞， 包括肥大细 胞、 嗜酸性粒细胞、 嗜中性粒细胞、 上皮细胞、 巨噬细胞和内皮细胞都可产生炎症介质。 主要 的介质有 ： 组胺、 前列腺素 (PG)、 白三烯 (LT)、 血小板活化因子 (PAF)、 嗜酸性粒细胞趋化因 子 (。
11、ECF-A)、 嗜中性粒细胞趋化因子 (NCF- A)、 主要碱基蛋白 (MBP)、 嗜酸性粒细胞阳离子 蛋白 (ECP)、 内皮素 -1(ET-1)、 黏附因子 (abhesion molecules, AMs) 等。经研究表明， C5 基因 （编码补体成分 5） 在发生病变后， 就能引起上述炎症细胞、 炎症介质和细胞因子互相参 与， 相互作用形成恶性循环， 引发气道炎症， 最终罹患哮喘。 0009 C5 是形成膜攻击复合体 （MAC） 的第 1 个补体分子。人的 C5 基因定位于第 9 号 染色体长臂 32-34 区， 是由以二硫键相连接的 、 链组成， 分子量 190kDa， 其中 链为。
12、 115kDa， 链为 75kDa。C5 与 C3 和 C4 的结构相类似， 但没有链内硫酯键。靠近 N 端的第 74-75 位精氨酸一亮氨酸键为 C5 转化酶作用的部位。在 C5 转化酶的作用下， C5 链 N 末 端裂解出一个分子量为11kDa的小片段C5a进入液相中， 其余部分为110kDa的大片段C5b， 仍结合在细胞膜表面。亲生的 C5b 在极短时间内能保持与 C6 结合的构象， 可与 C6 非共价 结合形成一牢固的 C5b6 复合物， 并通过与 C3b 的可逆性结合而固定的细胞膜上。但 C5b 生 成后其潜在的生物学活性存在时间非常短促， 若无 C6 结合则迅速衰变为 C5bi。 。
13、C5b 只形 成 MAC 参与细胞溶解效应， 而 C5a 却具有广泛的生物学活性。概括起来有以下几方面 ：（1） 过敏毒素作用 ： C5a 是具有过敏毒素作用的补体裂解片段中作用最强的介质， 较 C3a 强 20 倍， 较 C4a 强 2500 倍。此外， C5a 还可不依赖于肥大细胞释放组胺， 即通过直接作用于血管 内皮细胞而增加血管的通透性。 （2） 趋化作用 ： 高浓度的 C5a 是中性粒细胞、 嗜酸性粒细胞 和单核细胞的趋化剂， 可刺激这些细胞沿着浓度定向移动。值得注意的是， 被血清羧肽酶 N 切C5aC端精氨酸残基而形成的去精C5a虽丧失了使肥大细胞分泌组胺的能力， 但仍具有较 强的。
14、趋化活性， 是补体活化后产生趋化作用的主要因素。 （3） 促代谢作用 ： 高浓度的 C5a 可 刺激中性粒细胞和单核细胞的氧化代谢， 提高其 cGMP 的水平， 有利于促进溶酶体与细胞膜 的融合， 释放溶酶体酶。此外， C5a 还可刺激中性粒细胞粘附及增强其产生超氧化物。 （4） 免疫调节作用 ： 近年体外研究表明， C5a 对免疫应答有明显增强作用， 如可诱导单核细胞分 泌 IL-1、 IL-6、 IL-8 及 TNF- 等细胞因子， 促进抗原及同种异体抗原诱导的 T 细胞增殖及 B 细胞产生抗体等。C5a 的上述生物学活性的利于增强机体的防御机能， 但由其导致的炎症 反应也可造成对机体的损。
15、伤。 发明内容 说 明 书 CN 202401075 U 4 3/4 页 5 0010 本实用新型针对目的是提供一种采用荧光定量 PCR 技术同时检测两个儿童哮喘 基因SNP位点的试剂盒。 该试剂盒由包装盒体、 衬垫、 装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR 反应液的两个试管、 装有阳性对照品的一个试管、 装有阴性对照品的一个试管组成， 衬垫上 设有容器孔， 分别放置两管荧光定量 PCR 反应液、 阳性对照品和阴性对照品。 0011 其中荧光定量 PCR 反应液的成分包含 ： PCR 缓冲液、 MgCl2、 dNTPs、 SNP 位点检测用 上游引物、 SNP 位点检测用下游引物、 SNP 位。
16、点基因型一荧光探针、 SNP 位点基因型二荧光探 针、 Taq DNA 聚合酶。 0012 其中， 0013 ORMDL3 上的 SNP 位点检测引物和探针为 ： 0014 上游引物序列 ： 5 - AGGCAACCCTGGAAA -3 0015 下游引物序列 ： 5 - TGATCAATCAGGGCC -3 0016 基因型一荧光探针序列 ： 5 -FAM CAAACAcGCATGGA TAMRA -3 0017 基因型二荧光探针序列 ： 5 -VIC- CAAACAtGCATGGA TAMRA -3 0018 C5 上的 SNP 位点检测引物和探针为 ： 0019 上游引物序列 ： 5 -。
17、 CTGCTGTCTGTTCTCCT -3 0020 下游引物序列 ： 5 - CTTCATCCCGACTTCTG -3 0021 基因型一荧光探针序列 ： 5 -FAM GACGATaTAATAGA - TAMRA -3 0022 基因型二荧光探针序列 ： 5 -VIC GACGATgTAATAGA TAMRA -3 0023 对照品分为阳性对照品和阴性对照品， 阴性对照品为无菌双蒸水样品， 阳性对照 品为口腔粘膜细胞 DNA 样品。 0024 本试剂盒保存于 -20， 尽量减少反复冻融。 0025 本实用新型试剂盒使用方法 ： 0026 每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。 0027 扩增。
18、检测在荧光定量 PCR 仪上进行， 分为 6 个反应管， 每一个 SNP 位点检测使用 3 个反应管， 其中 1 个反应管为被检测样品， 阳性对照和阴性对照各使用 1 个反应管， 每管中 总体积 10l， 其中 8l PCR 反应液， 2l 检测样品 （基因组 DNA、 阳性对照或阴性对照） 。 反应条件为 50、 2 分钟， 95、 10 分钟， 再进行 60 个循环的 95、 30 秒， 60、 1 分钟。反 应完成后在荧光定量 PCR 仪上进行终点荧光读取， 根据得到的二维荧光图和实时扩增曲线 读取被检测样品的 SNP 位点基因型。 0028 本实用新型提供的该试剂盒主要用于检测儿童哮喘。
19、基因 SNP 位点， 从而告知被检 者患病风险数值， 提前预防和控制， 指导医师选择正确的临床治疗方案， 有利于患者进行针 对性治疗。 0029 本实用新型的特点是 ： 该试剂盒运用荧光定量 PCR 技术实现了同时检测两个儿童 哮喘基因 SNP 位点基因型的目的， 相对于现有的荧光定量 PCR 试剂盒只检测一个 SNP 位点， 本实用新型试剂盒将同一疾病的所有 SNP 位点检测整合在一个试剂盒内， 使用更方便而且 成本更低， 对罹患儿童哮喘风险性的评估也更便捷。 附图说明 0030 图 1 为本实用新型的结构示意图。 说 明 书 CN 202401075 U 5 4/4 页 6 具体实施方式 。
20、0031 本实用新型结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解， 这些实施例仅用于 说明目的， 而不用于限制本实用新型范围。 0032 实施例 1 0033 参见图 1， 本实用新型试剂盒由包装盒体 1、 衬垫 2、 装有检测两个 SNP 位点的荧光 定量 PCR 反应液的两个试管 3、 装有阳性对照品的一个试管 4、 装有阴性对照品的一个试管 5 组成， 衬垫上设有容器孔、 分别放置两管荧光定量 PCR 反应液 3、 阳性对照品 4 和阴性对照 品 5。 0034 其中荧光定量 PCR 反应液的成分包含 ： PCR 缓冲液、 MgCl2、 dNTPs、 SNP 位点检测用 上游引物、 SNP。
21、 位点检测用下游引物、 SNP 位点基因型一荧光探针、 SNP 位点基因型二荧光探 针、 Taq DNA 聚合酶。 0035 本试剂盒保存于 -20， 尽量减少反复冻融。 0036 实施例 2 0037 1 材料 ： 0038 血样总 DNA 提取试剂盒购于美国 Qiagen 公司， Taq DNA 聚合酶、 dNTPs 等 PCR 相关 试剂购于美国 Promega 公司， 7900 型荧光定量 PCR 仪为美国 ABI 公司产品。 0039 2 引物及探针 ： 0040 ORMDL3 上的 SNP 位点检测引物和探针为 ： 0041 上游引物序列 ： 5 - AGGCAACCCTGGAAA。
22、 -3 0042 下游引物序列 ： 5 - TGATCAATCAGGGCC -3 0043 基因型一荧光探针序列 ： 5 -FAM CAAACAcGCATGGA TAMRA -3 0044 基因型二荧光探针序列 ： 5 -VIC- CAAACAtGCATGGA TAMRA -3 0045 C5 上的 SNP 位点检测引物和探针为 ： 0046 上游引物序列 ： 5 - CTGCTGTCTGTTCTCCT -3 0047 下游引物序列 ： 5 - CTTCATCCCGACTTCTG -3 0048 基因型一荧光探针序列 ： 5 -FAM GACGATaTAATAGA - TAMRA -3 004。
23、9 基因型二荧光探针序列 ： 5 -VIC GACGATgTAATAGA TAMRA -3 0050 3 样本检测 ： 0051 选取 30 例血液样本， 其中已确定患儿童哮喘的为 18 例。样本用血样总 DNA 提取 试剂盒提取总 DNA。每一例检测为 12 个反应管， 每管中总体积 10l， 其中 8l PCR 反应 液， 每一个 SNP 位点检测使用 3 个反应管， 1 个反应管中加入 2l 被检测 DNA， 另外 2 个反 应管中加入 2l 阳性对照和阴性对照， 在 ABI7900 荧光定量 PCR 仪上进行扩增。反应条件 为 50、 2 分钟， 95、 10 分钟， 再进行 60 个循环的 95、 30 秒， 60、 1 分钟。反应完成后 在荧光定量 PCR 仪上进行终点荧光读取。 说 明 书 CN 202401075 U 6 1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 202401075 U 7 。