技术领域
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一组基于芝麻全基因 组序列开发的SSR核心引物组及其应用。
背景技术
芝麻是我国重要食用油料作物之一，具较高的应用价值和营养价值。传统芝 麻香油和现今冷轧芝麻烹饪油及各种芝麻食品，是人们生活中必不可少和不可替 代的特色食品。芝麻富含芝麻素、芝麻酚、芝麻酚林等功能成分，具有抗病毒、 杀菌、抗癌等多种功能，被广泛应用于医药和临床。
基于DNA多态性的分子标记正逐渐成为分析生物遗传多样性、亲缘关系和 鉴定重要基因的有力工具，在作物遗传分析中应用较多分子标记的主要有RAPD、 ISSR、AFLP等，而这些标记均是基于无基因组序列信息开发的标记技术，尽管 有一定的实用性，但是标记随机性强、稳定性差。SSR技术具有共显性、重复性 好等优点，是进行遗传多样性分析和遗传图谱构建等研究的首选标记。基因组中 一般都有大量的SSR位点，如果将基因组的所有SSR位点对供试种质一一进行 分析，需要耗费大量的人力和物力。为提高SSR技术的检测效率，玉米、小麦 等作物采用核心引物进行相关研究，取得了理想的效果。核心引物指均匀覆盖染 色体全基因组、多态性高、稳定性强、重复性好、可作为初步研究优先选用的一 套引物。基于全基因组开发SSR核心引物组已经成功应用于西瓜、谷子、棉花 等作物的品种遗传关系检测，利用核心引物组检测供试材料的遗传关系和品种亲 缘关系具有快速、简便、准确性高的优点。
发明内容
本发明的目的在于提供基于芝麻全基因组序列开发的SSR核心引物组。
本发明的另一个目的在于提供上述SSR核心引物组在芝麻品种资源遗传多 样性分析、芝麻品种遗传系谱分析和芝麻品种鉴定的应用。
本发明的再一个目的是提供利用上述SSR核心引物组进行芝麻品种资源遗 传多样性评价分析、芝麻品种遗传系谱分析或芝麻品种鉴定的方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
基于芝麻全基因组序列开发的SSR核心引物组，包括32对引物，所述引物 组的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1～64所示。
上述基于芝麻全基因组序列开发的SSR核心引物组在芝麻种质资源遗传多 样性分析中的应用。
上述基于芝麻全基因组序列开发的SSR核心引物组在芝麻品种遗传系谱分 析中的应用。
上述基于芝麻全基因组序列开发的SSR核心引物组在芝麻品种鉴定中的应 用。
利用上述基于芝麻全基因组序列开发的SSR核心引物组进行芝麻种质资源 遗传多样性分析、芝麻品种遗传系谱分析或芝麻品种鉴定的方法，包括如下步骤：
（1）采用CTAB法提取待测芝麻样品基因组DNA；
（2）以步骤（1）提取的待测样品DNA为模板，利用如序列表SEQ ID NO. 1～64所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
（3）将步骤（2）的PCR扩增产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测， 银染显色，统计电泳结果；
（4）利用步骤（3）的统计结果进行芝麻种质资源遗传多样性分析、芝麻品 种遗传系谱分析或芝麻品种鉴定。
按上述方案，所述PCR扩增的体系（10μl）包括10×buffer1μl，dNTPs mixture （10mM）0.2μl，上游引物（50ng/μl）1μl，下游引物（50ng/μl）1μl，Taq酶（5U/μl） 0.1μl，MgCl2（25mM）0.8μl，样品DNA模板2μl，重蒸水3.9μl，所述PCR扩 增的程序为：94℃预变性4min；94℃30s；60℃30s；72℃1min，共35个循环； 72℃延伸10min；4℃保存。
按上述方案，所述电泳在Sequi-Gen GT核酸电泳系统（Bio-Rad，USA）中 进行，以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标准，1800伏恒压电泳80min。
所述芝麻种质资源遗传多样性分析或芝麻品种遗传系谱分析为：使用 NTSYS-pc2.10e软件进行基于UPGMA法的聚类分析；使用powermarker软件 计算各引物的等位基因数（Na）、PIC（多态性信息量）值。
所述芝麻品种鉴定为：统计每个品种在引物中的扩增情况，构建DNA指纹 图谱，一一比较各引物位点差异，差异引物数≥2，判定两个品种为不同品种； 差异引物数=1，判定两个品种为近似品种；差异引物数=0，判定两个品种为相 同品种。
本发明的有益效果：本发明获得的SSR核心引物组具有最大限度反映芝麻 种质材料遗传多样性、多态性高、重复性好、标记稳定可靠、便于统计等优点。 可用于芝麻品种鉴定、芝麻品种遗传系谱鉴定和芝麻品种种质资源遗传多样性评 价等领域，利用该套引物进行遗传多样性分析，能最大限度准确反映供试材料的 遗传亲缘关系。
附图说明
图1建立在218对SSR引物基础上的31份代表性芝麻资源聚类图。
图2建立在137对高多态性SSR引物基础上的31份代表性芝麻资源聚类图。
图3依据32对SSR核心引物绘制的31份代表性材料亲缘关系图谱。
图4依据16对SSR引物绘制的31份代表性材料亲缘关系图谱。
图5依据32对SSR核心引物绘制的23份芝麻品种系谱。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例、附图和附表进一步阐明本发明的 内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
（一）芝麻SSR核心引物组的开发
1、材料和方法：
1.1材料
供试材料为31份代表性芝麻资源：来自13个国家的31份芝麻资源材料类 型丰富，包含了单杆、分枝；单花、三花；高杆、矮秆；黄杆、绿杆；紫花、浅 紫花；绿叶柄、紫叶柄；种皮白色、褐色、黑色等各种芝麻种质和品种，基本涵 盖了芝麻主要的生态类型和主要的农艺性状，尽可能多地体现了芝麻种质的多样 性，具有较高的遗传多样性（见表1）。
表131份芝麻资源材料信息
1.2研究方法
（1）CTAB法提取基因组DNA
利用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下：
a.适量叶片样品取自超低温冰箱（-70℃），立即放入冰冻过的研钵中，加入 液氮研磨成粉状；快速装入50ml离心管中，加入在60℃的水浴锅中预热过的 20ml提取液（0.2M Tris-Cl，0.25M NaCl，25mM EDTA，0.5wt%CTAB，pH7.5）， 混合均匀，放入60℃的水浴锅中水浴40min；
b.取出离心管，加入等体积氯仿/异戊醇（V氯仿:V异戊醇=24：1），缓慢上下颠 倒离心管30～50次，使充分混匀，1300g离心10分钟；
c.取上清于另一离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇（V氯仿:V异戊醇=24：1）， 重新抽提一次；再取上清液，加入0.6倍体积预冷异戊醇，缓慢颠倒离心管，直 至有絮状沉淀集结为止，静止30min，挑出沉淀，用70vt%酒精洗涤2～3次，无 水乙醇洗涤一次，干燥后加1ml无菌水，65℃保温20min溶解DNA；
d.再次加入等体积氯仿/异戊醇（V氯仿:V异戊醇=24：1），重新抽提，取上清液， 加入0.1倍NaAc（3mol/L，PH5.2），混匀后缓慢加入2倍体积的冰无水乙醇， 静止5min后缓慢转动离心管直至絮状沉淀出现，挑出沉淀转入1.5ml离心管中， 用70vt%酒精洗涤2～3次，无水乙醇洗涤一次，干燥后加无菌水溶解，于-20℃ 冰箱中保存备用。
（2）PCR扩增
PCR扩增体系为：
PCR反应程序：
（3）6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
a.试剂配制：
6wt%PAGE胶：6wt%丙烯酰胺，7mol/L尿素，0.5×TBE缓冲液，灌胶前 加入300μl10wt%NH4S2O4，30μl TEMED；
10×TBE：Tris-base108g，硼酸55g，0.5M EDTA(PH8.0)40ml，定容至1000ml。 使用时稀释为0.5×TBE缓冲液。
PAGE胶制备：胶板用10wt%NaOH溶液浸泡24小时，洗净，晾干；长胶 板用餐巾纸均匀涂抹剥离硅烷1ml。短胶板用2ml、0.25vt%（体积百分浓度）亲 和硅烷溶液涂抹，所述亲和硅烷溶液的组分为：冰醋酸10ul、1.985ml95vt%乙 醇、5μl亲和硅烷，放置5分钟后，用95vt%的乙醇轻轻洗擦以除去多余的剥离 硅烷和亲和硅烷。将玻璃装好，并以边条隔开，小心套入制胶夹（GIBCO/BRL） 中；准备就绪后在短胶板上用注射器将50ml（长胶板80ml）6%变性聚丙烯酰胺 凝胶液，缓慢注入，以免产生气泡，插入梳子，并用夹子夹牢，凝聚2小时后即 可电泳。
电泳：从制胶夹中取出胶板，擦净玻璃外侧，固定于电泳槽上，上下槽各加 500ml0.5×TBE缓冲液，将梳子拔出后立即用0.5×TBE缓冲液冲洗点样孔，接通 电源1500伏恒压预热30min；在PCR产物中加入等体积的上样缓冲液（98vt% 去离子甲酰胺，10mmol/L EDTA，0.005wt%二甲苯青FF，0.005wt%溴酚蓝）， 95℃变性5分钟，冰浴冷却；取5μl样品，以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标 准，1800伏恒压电泳80min，当二甲苯青FF到达2/3胶板时停止电泳。
银染法进行染色：将上述凝胶在10vt%冰醋酸中固定至胶板无色，然后在 ddH2O漂洗两次，每次2～3分钟；然后将凝胶置于0.1wt%AgNO3溶液，0.56vt% 甲醛染色30分钟；取出胶板，在ddH2O漂洗10s，再在预冷（4℃）的显影液（3wt% Na2CO3，0.56vt%HCHO，2mg/L Na2S2O3.5H2O）中轻轻摇动至条带清晰可见， 然后倒入中止液（10vt%冰乙酸）中，停止显影；用蒸馏水漂洗3分钟，室温 （20～25℃，以下相同）下自然晾干，拍照保存。
（4）SSR引物开发和筛选
核心引物筛选
利用MISA软件从芝麻基因组中扫描SSR位点，定义2个碱基至少重复六次， 3、4、5、6个碱基至少重复五次为SSR位点，共获得SSR位点23408个。利用Batch Primer3对这些SSR位点设计引物，定义产物大小为100～300bp，引物长度为 19～27bp，引物GC含量在40%～70%，引物退火温度在50℃～60℃。合成其中的1500 个引物，利用四个代表性的种质资源（矮秆芝麻、高杆芝麻、密蒴芝麻、黄杆芝 麻）检测引物的多态性。
（5）数据统计与分析
利用电泳统计结果，使用NTSYS-pc2.10e软件进行基于UPGMA法的聚类分 析，使用powermarker软件计算各引物的PIC值。
二、结果与分析
2.1对31份供试材料的SSR标记多态性分析
利用四个材料（矮秆芝麻、高杆芝麻、密蒴芝麻、黄杆芝麻）对合成的1500 对引物进行初步筛选，成功扩增1449对引物，并获得在四个材料之间有差异的引 物218对，占总引物的14.5%。218对多态性引物用来检测31份供试材料的遗传多 样性，每个引物的等位数从2到13不等，平均每个引物含5.46个等位变异，其中 主要等位变异数所占比例从12.9%～96.8%，平均值为43.1%。实际杂合度从0～1不 等，平均值为0.25。预期杂合度从0.06～0.91不等，平均值为0.69。多态性信息含 量从0.06～0.89不等，平均值为0.63。多态性信息含量大于0.6的有144个，占总引 物的66.1%，可见本发明采用的31份供试材料多样性丰富，能够有效反映检验出 不同芝麻种质材料SSR差异位点，具有较高的遗传多样性代表性。
2.2SSR核心引物组筛选
利用218对多态性引物对31份代表性材料构建UPGMA树，显示31份材料主 要分为来自中国的材料和来自国外的材料（见图1）。
将多态性信息含量大于0.6的多态性高，条带稳定，易统计的137对引物作为 核心引物组的备选引物，对31份代表性材料进行聚类分析，聚类图与218对多态 性引物构建的UPGMA数基本一致，也可以明显分为国内材料组和国外材料组 （见图2）。
依据标记数目最少和每条染色体至少两个标记的原则，选取32对引物，对31 份供试材料进行聚类分析，获得32对引物组合能够与218对引物组合的聚类结果 相似，其每个类别所包含种质材料以及材料之间的遗传相似系数具有较高的一致 性（见图3），且32对引物分布于16个连锁群上，平均每个连锁群含2个标记，所 以将这32对引物确定为芝麻SSR核心引物组。
如果进一步将引物对减少为每条染色体1对引物即16对引物，其所反映的31 份材料之间的DNA差异水平与137对引物基本吻合，但是与32对引物相比，这16 对引物不能非常准确反映31个育种材料间的亲缘关系，不同种植资源在聚类图上 所处的分枝与图1的区别很大，例如，3932与3800从图1中的相邻分枝变成了距离 较远的两个分枝（见图4）。而相比较而言，采用32对引物分析得到的图3与图1 的区别要小得多，反映的材料间亲缘关系更准确。采用较少的引物对，不能非常 准确反映参试材料的遗传多样性信息，上述16对引物不适合作为核心引物组。
表232对核心引物信息
（二）芝麻SSR核心引物组的有效性检验
供试材料为23份芝麻品种（见表3），按照品种间的亲缘关系可分为三组， 第一组包括宜阳白、鄂芝6号、中芝12、中芝16、豫芝7号、豫芝8号、豫芝 4号、舆芝18，他们都与骨干亲本宜阳白遗传关系较近；第二组中有中芝13、 中芝14、中芝15、豫芝11、郑芝13、漯芝12、漯芝15、漯芝18、漯芝19、皖 芝1号、皖芝2号，他们都是豫芝4号的后代；第三组包括中芝11、中芝19、 中芝20、中芝2771，他们都选育自中芝11。
表323份芝麻品种信息
利用SSR核心引物组对23份芝麻品种进行遗传多样性分析和品种遗传系谱 分析，聚类分析的结果显示这三组材料基本按照系谱关系聚类，尽管带有相同血 缘关系的品种都不同程度地与其他品种发生了基因交流，但是亲缘关系较近的材 料具有聚到一类的趋势。这也说明32对核心引物组可以反映芝麻品种间的亲缘 关系（见图5）。
利用SSR核心引物组对23份芝麻品种进行PCR扩增、电泳检测，统计每 个品种在引物中的扩增情况，比较各引物位点差异可以发现任意两个品种的 DNA电泳条带都不相同（差异≥2），同时图5的聚类分析结果显示，23份芝麻 品种分别处在不同分支上，这也说明这23份芝麻的品种是不同的，上述结果可 以说明该SSR核心引物组可用于芝麻品种鉴定。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限 制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不 同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引 申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。