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1、(10)申请公布号 CN 103667511 A (43)申请公布日 2014.03.26 CN 103667511 A (21)申请号 201310742906.6 (22)申请日 2013.12.30 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) (71)申请人 山东滨州博莱威生物技术有限公司 地址 256603 山东省滨州市经济开发区黄河 六路 218 号 (72)发明人 郎景民 马景霞 吴洪才 杨平 郭显坡 (74)专利代理机构 济南舜源专利事务所有限公 司 37205 代理人 徐槐 (54) 发明名称 一种副鸡嗜血杆菌 PCR 检测试剂盒 (57) 摘要。
2、 本发明涉及一种试剂盒， 更具体的讲是一 种副鸡嗜血杆菌 PCR 检测试剂盒， 所述试剂 盒 包 括 20L 的 PCR 缓 冲 液、 25L 超 纯 水、 5LMarkerDL2000， 3L15pmol/L 上引物， 3L 浓度为 15pmol/L 的下引物， 3L 聚合酶， 3L 溴酚蓝， 15L 的 TE 缓冲液， 5L 阴性对 照， 5L 阳性对照， 本发明的有益效果是 ： 本发明 拥有 PCR 检测技术的检测快的优点， 而且本试剂 盒造价低、 采用了特殊的引物， 可以满足最低为 0.00953ng基因片段PCR产物的检测， 检测灵敏性 高。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 。
3、页 说明书 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103667511 A CN 103667511 A 1/1 页 2 1. 一种副鸡嗜血杆菌 PCR 检测试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒包括 20L 的 PCR 缓 冲液、 25L超纯水、 5LMarker DL2000， 3L15pmol/L上引物， 3L浓度为15pmol/L 的下引物， 3L 聚合酶， 3L 溴酚蓝， 15L 的 TE 缓冲液， 5L 阴性对照， 5L 阳性对照。 2.根据权利要求1所述的一种副鸡嗜血杆菌PCR。
4、检测试剂盒， 其特征在于 ： 所述PCR缓 冲液由 25 mmol/L MgCl2 2L， 10PCR buffer 5L， 10mmol/L dNTPx2L。 3. 根 据 权 利 要 求 1 所 述 的 一 种 副 鸡 嗜 血 杆 菌 PCR 检 测 试 剂 盒， 其 特 征 在 于 ： 所 述 上 引 物 的 序 列 号 为 5 -CCGCATAGAARRRRAAGA-3 ， 下 引 物 的 序 列 号 为 5 -CCAACCTTCCTCACCACC-3。 4. 根据权利要求 1 所述的一种副鸡嗜血杆菌 PCR 检测试剂盒， 其特征在于 ： 所述阴性 对照为非副鸡嗜血杆菌的 DNA 片段。
5、。 5. 根据权利要求 1 所述的一种副鸡嗜血杆菌 PCR 检测试剂盒， 其特征在于 ： 所述阳性 对照为标准副鸡嗜血杆菌的 PCR 产物。 6. 根据权利要求 1 所述的一种副鸡嗜血杆菌 PCR 检测试剂盒， 其特征在于 ： 所述上引 物中 R 为简并引物。 权 利 要 求 书 CN 103667511 A 2 1/2 页 3 一种副鸡嗜血杆菌 PCR 检测试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一种试剂盒， 更具体的讲是一种副鸡嗜血杆菌 PCR 检测试剂盒。 背景技术 0002 鸡 传 染 性 鼻 炎 (Infectious coryza， IC) 是 由 副 鸡 嗜 血 杆 菌 (Haem。
6、ophilus paragallinarum， HPG) 引起的一种上呼吸道疾病， 最明显的症状是鼻道和鼻窦有浆液性或 黏液性分泌物流出、 面部水肿和结膜炎， 肉垂出现明显肿胀1。 该菌有A、 B、 C 3个血清型， 主要引起育成鸡生长不良， 产蛋鸡产蛋率下降， 给养鸡业造成很大的经济损失 2。目前诊 断鸡传染性鼻炎的方法主要用传统的细菌培养和生化鉴定副鸡嗜血杆菌， 由于副鸡嗜血杆 菌对营养要求高， 不易培养， 而且该菌常常与其它细菌混合感染， 无法快速鉴别诊断， 因此 应用特异、 快速、 敏感的聚合酶链反应 (PCR) 检测副鸡嗜血杆菌技术就显得非常重要， 但是 目前市场上并没有用于检测副鸡。
7、嗜血杆菌的试剂盒， 这是现有技术中的不足。 发明内容 0003 本发明的发明目的在于针对现有技术中的不足， 提供一种快速、 准确、 简便的副鸡 嗜血杆菌 PCR 检测试剂盒。 0004 本发明是通过以下技术方案实现的 ： 一种副鸡嗜血杆菌 PCR 检测试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒包括 20L 的 PCR 缓冲 液、 25L超纯水、 5LMarker DL2000， 3L15pmol/L上引物， 3L浓度为15pmol/L的 下引物， 3L 聚合酶， 3L 溴酚蓝， 15L 的 TE 缓冲液， 5L 阴性对照， 5L 阳性对照。 0005 上 述 PCR 缓 冲 液 由 25 mmol/。
8、L MgCl2 2L， 10PCR buffer 5L， 10mmol/L dNTPx2L。 0006 上述上引物的序列号为 5 -CCGCATAGAARRRRAAGA-3， 下引物的序列号为 5 -CCAACCTTCCTCACCACC-3。 0007 上述阴性对照为非副鸡嗜血杆菌的 DNA 片段。 0008 上述阳性对照为标准副鸡嗜血杆菌的 PCR 产物。 0009 上述上引物中 R 为简并引物。 0010 反应步骤 ： 第一步 50 min 50， 1 个循环 ； 第二步 94 3 min， 1 个循环 ； 第三步 94 1 min， 52 1 min， 72 2 min， 35 个循环，。
9、 第四步 72延伸 7min， 1 个循环 取 5L 上述反应产物进行 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检验， 以 Marker DL2000 作为参考， TAE 缓冲液为电泳缓冲液， 以 5V/cm 电泳 1h， 凝胶成像系统观察结果 ; 回收目的条带， 16 1.5 h连接至PMD19-T Easy Vector， 转化感受态DH5， 均匀涂布 于含 Amp、 IPTG 和 X-gal 的 LB 固体培养基平板， 37培养 16h, 挑取白色菌落小量培养， 提 取质粒作 PCR 扩增鉴定 , 将阳性菌液测序， 并采用非副鸡嗜血杆菌 DNA 片段作为阴性对照， 标准副鸡嗜血杆菌 DNA 片段作为阳性。
10、对照。 0011 本发明的有益效果是 ： 本发明拥有 PCR 检测技术的检测快的优点， 而且本试剂盒 说 明 书 CN 103667511 A 3 2/2 页 4 造价低、 采用了特殊的引物， 可以满足最低为 0.00953ng 基因片段 PCR 产物的检测， 检测灵 敏性高。 附图说明 0012 图 1 为本发明敏感性实验结果图 ； 1-95.3ng 基因片段 PCR 产物， 2-9.53 ng 基因片段 PCR 产物， 3-0.953ng 基因片段 PCR 产物， 4-0.0953ng 基因片段 PCR 产物， 5-0.00953ng 基因片段 PCR 产物。 0013 图 2 为本发明电。
11、泳实验结果图 1-Marker DL2000， 2-PCR 产物 （650bp） ， 3- 标准菌株 PCR 产物 （650bp） ， 4- 阴性对照。 具体实施方式 0014 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明， 以便本领域技术人员可以更 好的了解本发明， 但并不因此限制本发明。 0015 实施例 1 一种副鸡嗜血杆菌 PCR 检测试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒包括 20L 的 PCR 缓冲 液、 25L超纯水、 5LMarker DL2000， 3L15pmol/L上引物， 3L浓度为15pmol/L的 下引物， 3L 聚合酶， 3L 溴酚蓝， 15L 的 TE 缓冲液， 。
12、5L 阴性对照， 5L 阳性对照。 0016 上 述 PCR 缓 冲 液 由 25 mmol/L MgCl2 2L， 10PCR buffer 5L， 10mmol/L dNTPx2L。 0017 上述上引物的序列号为 5 -CCGCATAGAARRRRAAGA-3， 下引物的序列号为 5 -CCAACCTTCCTCACCACC-3。 0018 上述阴性对照为非副鸡嗜血杆菌的 DNA 片段。 0019 上述阳性对照为标准副鸡嗜血杆菌的 PCR 产物。 0020 上述上引物中 R 为简并引物。 说 明 书 CN 103667511 A 4 1/1 页 5 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103667511 A 5 。