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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610388089.2 (22)申请日 2016.06.03 (71)申请人 南通大学 地址 226000 江苏省南通市崇川区啬园路9 号 (72)发明人 沈爱国季俐俐茅国新徐臻 (74)专利代理机构 南京瑞弘专利商标事务所 (普通合伙) 32249 代理人 徐激波 (51)Int.Cl. C07K 14/00(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/85(2006.01) A61K 38/16(2006.01) A61P 35/00(20。
2、06.01) (54)发明名称 RBBP5截短体的应用 (57)摘要 本发明公开了一种RBBP5截短体的应用。 本 发明利用生物工程技术， 基因重组一段135个氨 基酸多肽的RBBP5截短体到3.8kbPCMV-HA载体， 经酶切和序列分析证明重组成功后， 细胞转染免 疫印迹证明多肽的蛋白表达， 实现了多肽的重 组。 接着对多肽的抗增殖的能力行了试验， 为肿 瘤治疗开发新的靶点提供实验依据， 对于应用于 肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。 权利要求书1页 说明书4页 序列表4页 附图3页 CN 105949285 A 2016.09.21 CN 105949285 A 1.RBBP5截。
3、短体在制备抗肺癌药物中的应用； 所述的RBBP5截短体， 其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。 2.编码权利要求1所述的RBBP5截短体的基因， 其DNA序列如SEQIDNO.2所示。 3.含有权利要求2所述的RBBP5截短体的编码基因的载体。 4.根据权利要求3所述载体， 其特征在于： 将RBBP5截短体的编码基因克隆到PCMV-HA真 核表达载体， 构建出重组表达质粒。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105949285 A 2 RBBP5截短体的应用 技术领域 0001 本发明涉及生物工程技术领域， 具体涉及RBBP5截短体的应用。 背景技术 0002 恶性肿瘤已成为危害人类健康的。
4、主要疾病， 对应的抗肿瘤药物是被广泛关注和研 究的热点问题之一。 寻找新型高效、 低毒的抗肿瘤药物一直是国内外医药研发的热点。 多肽 药物是目前生物医药领域中极具发展前景的崭新领域， 抗肿瘤小分子多肽具有分子量小、 毒性低、 活性高、 易于穿透肿瘤细胞等特点， 且能以多种方式给药， 易于多途径吸收、 不易产 生耐药性等特点。 蛋白质类大分子药物分子量大、 结构复杂， 不易穿透细胞， 且具有免疫源 性， 而小分子多肽结构易于改造， 人工合成成本较低， 在临床上具有良好的应用前景。 0003 肺神经内分泌肿瘤， 包括SCLC和部分NSCLC， 其恶性程度高， 极易出现转移、 复发， 目前缺少有效的。
5、早期诊断及治疗手段， 预后不良。 转录因子ASCL1的表达与肺神经内分泌肿 瘤的分化表型和分化程度密切相关， 在肺神经内分泌瘤的发生发展中扮演重要角色。 其可 通过负性调控Wnt通路抑制因子DKK1， 调节肺癌细胞周期转化及促进肿瘤细胞的增殖。 发明内容 0004 发明目的： 针对现有技术中存在的不足， 本发明的目的是提供RBBP5截短体的应 用， 具有抗肺癌细胞增殖的临床应用价值。 0005 技术方案： 为了实现上述发明目的， 本发明采用的技术方案为： 0006 RBBP5截短体在制备抗肺癌药物中的应用； 所述的RBBP5截短体， 其氨基酸序列如 SEQIDNO.1所示。 0007 编码所述。
6、的RBBP5截短体的基因， 其DNA序列如SEQIDNO.2所示。 0008 含有所述的RBBP5截短体的编码基因的载体。 0009 所述载体： 将RBBP5截短体的编码基因克隆到PCMV-HA真核表达载体， 构建出重组 表达质粒。 0010 本发明人研究结果表明， RBBP5可以通过与ASCL分子相互作用， 促进ASCL1对DKK1 的负性调控， 以促进肺癌细胞增殖。 因此依据竞争性结合的原理， 阻断RBBP5-ASCL1相互作 用， 将抑制ASCL1通路， 达到抗肿瘤增殖的作用。 0011 有益效果： 与现有技术相比， 本发明利用生物工程技术， 基因重组一段135个氨基 酸多肽的RBBP5。
7、截短体到3.8kbPCMV-HA载体， 经酶切和序列分析证明重组成功后， 细胞转 染免疫印迹证明多肽的蛋白表达， 实现了多肽的重组。 接着对多肽的抗增殖的能力行了试 验， 为肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据， 对于应用于肿瘤的临床治疗具有十分重要的 开发应用前景。 附图说明 0012 图1是肺癌组织、 细胞中RBBP5和ASCL1的相互作用结果图； 说明书 1/4 页 3 CN 105949285 A 3 0013 图2是载体质粒图谱PCMV-HA的结构示意图； 0014 图3是免疫印迹检测RBBP5全长和不同截短重组多肽RBBP5的表达结果图； 0015 图4是A549细胞中免疫沉淀检测RB。
8、BP5全长及其截短体与ASCL1的相互作用结果 图； 0016 图5是RBBP5截短体的表达后对肺癌细胞周期的影响结果图； 0017 图6是RBBP5截短体的表达后对肺癌细胞增殖的影响结果图。 具体实施方式 0018 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。 0019 实施例1RBBP5与ASCL1相互作用结构域的确定 0020 免疫沉淀分析RBBP5和ASCL1在肺癌组织及细胞中的相互作用。 组织及细胞匀浆 后， 以RBBP5或ASCL1的抗体进行免疫沉淀， 免疫沉淀后进行免疫印迹分析两者的相互作用。 0021 具体方法： 新鲜肺癌组织匀浆。 细胞予预冷的0.01MPBS洗涤2次； 加入1。
9、mLPBS后， 细胞刮冰上刮取细胞， 移至1.5mL离心管中， 1000g5min离心收集细胞； 加入配置好的500 L细胞裂解液置于轮转仪上4轮转30min彻底裂解细胞， 12000g4离心10min， 将上清液 转移至新EP管。 预澄清加入20 L混匀的ProteinA/Gbeads， 在DNA混合仪上转动1小时， 900g离心5min(4)， 将上清液转移至新离心管， 弃珠子。 取40-60 L上清液作为Input， 加入 等量2SDSloadingbuffer， 沸水煮5-10min， 离心后冻存。 其余部分平分为两等分， 分别 加入等量(1 g)NormalIgG或相应抗体,在DNA。
10、混合仪上转动2小时(4)。 在每个离心管中 各加入30 L混匀的ProteinA/Gbeads继续转动2小时。 然后900g离心5min(4)， 弃上清。 加入1mL洗涤缓冲液洗涤珠子。 900g离心5min(4)， 共洗涤3次。 最后将40-60 L2SDS loadingbuffer加入洗好的珠子中， 沸水煮5-10min， 离心后冻存。 连同Input样品一起进行 Westernblot检测。 0022 实验结果如图1所示， 在组织IP和细胞IP中均存在RBBP5全长蛋白和ASCL1的相互 作用。 0023 实施例2RBBP5截短体克隆载体构建 0024 提取肺癌细胞mRNA ， 逆转录。
11、为cDNA ， 以 cDNA为模板 ， 上游 引物为5 - CGGAATTCATGAACCTCGAGTTGCTGGAGTC-3 ( 含ECOR1酶切位点 )； 下游引物为5 - ATAAGAATGCGGCCGCTCACCCTGTCTGCTCAGGCTCACTC-3 (含NotI酶切位点)， 应用PCR技术成功 扩增出含135个氨基酸的RBBP5截短体(序列如SEQIDNO.1所示)对应的405bp的DNA序列 (序列如SEQIDNO.2所示)。 扩增得到的片段与PCMV-HA载体连接(载体质粒图谱见图2)， 将 连接产物转入感受态大肠杆菌中， 在含Amp+琼脂平板上挑选克隆， 以碱裂解法小提重。
12、组质 粒后， 并进行酶切鉴定。 0025 基因片段的PCR引物由上海桑尼公司合成， 引物序列如下： 0026 上游引物： 5 -CGGAATTCATGAACCTCGAGTTGCTGGAGTC-3 ； 0027 下游引物： 5 -GGGGTACCGAAAGCTGTGAGATGATATTGGGTGCC-3 。 0028 PCR反应体系为： H2O22 L， 上游引物1 L， 下游引物1 L， PCMV-N-HA-RBBP5质粒1 L ( 质粒来自PPL质粒与抗体共享库， 网址http:/ppl .biogot .com/产品编号： 5929 (BC053856)， TaqDNA聚合酶25 L。 说。
13、明书 2/4 页 4 CN 105949285 A 4 0029 PCR反应条件为： 94变性4min， 55退火， 72引物延伸。 0030 在基因片段两端设计了EcoRI和NotI两个限制性酶切位点， 双酶切连入PCMV-HA 质粒。 0031 连接体系为： H2O10 L， T4连接酶buffer1 L， T4连接酶2 L， Fragment1 L。 0032 另设对照组， 不加fragment， 以H2O补足体积。 PCR机中连接过夜。 0033 用连接产物转化JM109感受态菌。 转化步骤为： 1)100 L感受态菌置于冰水， 加入 DNA0.5 L， 静置30分钟； 2)42水浴2。
14、分钟； 3)冰浴5分钟； 4)加入不含抗生素的LB培养基， 37下， 150RPM震荡培养50分钟。 5)将转化菌接种于含氨苄青霉素的LB琼脂平板， 置37孵 箱培养过夜。 6)挑选阳性克隆4个， 分别接种于LB液体培养基， 置37摇床震荡培养。 0034 经转化、 提取等步骤获得重组真核表达载体。 酶切鉴定重组体， 并且测序进一步确 定； 将正确连接的多肽真核表达载体转染肺癌A549细胞， 48小时后搜集样品， 结果如图3： A549细胞转染后免疫印迹检测RBBP5全长(WT)及不同小分子多肽(截短1， 及截短2即RBBP5 )的表达。 A549细胞成功表达RBBP5截短体(截短2)， 分子。
15、量大小为15KD。 具体过程如下： 0035 挑取LB琼脂培养板上生长的阳性单克隆菌落， 接种于23ml含Amp的LB液体培养 基中， 37恒温， 250rpm振荡培养过夜约1214h， 用质粒小量抽提试剂盒少量制备细菌质 粒DNA； 酶切鉴定含有阳性片段的质粒DNA， 双酶切体系为： H2O14 L， Greenbuffer2 L， DNA2 L， HindIII1 L， KpnI1 L， 37水浴4小时。 并且阳性质粒送上海桑尼生物技术公司测序。 将相应含阳性片段质粒DNA的感受态细胞保种， 保存于-70。 0036 其中质粒抽提的具体步骤为： 挑取LB琼脂培养板上生长的阳性单克隆菌落， 。
16、接种 于23mLLB选择性液体培养基内， 37恒温， 300rpm剧烈振荡培养过夜(约1214h)； 取 1.5mL新鲜菌液离心， 6,000g15min， 4， 弃上清； 按照质粒抽提试剂盒说明书进行质粒抽 提： 收集的转化菌沉淀块加入solutionI250uL， 离心机13000R离心10min； 加入solution II250uL， 反复颠倒20次， 呈拉丝状后离心机13000R离心10min； 加入solutionIII350uL， 离心机13000R离心10min； 加入DNAwashingbuffer750uL， 离心机13000R离心1min。 0037 RBBP5截短体重组。
17、质粒表达鉴定： 细胞传代： 转染前一天， 将0.5-1.510A549细 胞用1640培养基传代至6cm培养皿中， 使得第二天转染时融合度在80-90左右； 将2-4ug 的质粒加入200 L的无血清培养基中， 混匀； 将Lipofectamine2000取出， 轻柔摇匀， 再将 质粒量1-3倍量的Lipofectamine2000用另一200 L的无血清培养基稀释， 吹打混匀， 静置 5min； 将质粒和Lipofectamine2000混匀， 室温静置20min； 将混合物加入培养皿中， 轻 柔地摇匀， 静置， 36-48h后收集细胞； RIPA细胞裂解液裂解， 免疫印迹检测多肽的表达。 。
18、0038 实施例3RBBP5截短体与ASCL1在肺癌细胞中的相互作用 0039 将RBBP5截短体表达载体转入肺癌细胞中， 进行细胞免疫共沉淀， 具体实验步骤同 实施例1。 0040 实验结果如图4所示： 免疫沉淀检测RBBP5全长(WT)及构建的不同小分子多肽(截 短1， 及截短2即RBBP5)与ASCL1的相互作用。 其中除了RBBP5全长蛋白(WT)能与ASCL1蛋白 相互作用外， RBBP5截短突变体2(即即RBBP5)也能与ASCL1蛋白发生相互作用， 而截短1与 ASCL1无相互作用。 0041 实施例4流式细胞术检测RBBP5截短体的表达对细胞周期的影响 0042 将RBBP5截。
19、短体转染入A549细胞， 培养细胞48h后， 胰酶消化， 用完培终止并收集到 说明书 3/4 页 5 CN 105949285 A 5 5mLEP管中离心， 1200rpm离心5min， 弃掉培养基， 用预冷的细胞PBS重悬洗涤2次， 再离心， 弃掉PBS， 用70乙醇重悬， 置于-20固定至少24小时， 1200rpm离心5min， 弃乙醇， 用PBS洗 涤3次， 并用含1tritonX-100的PBS4通透10min， 每管200 L。 加入RNaseA， 与triton X-100的PBS比例为1:1000， 避光4反应20min， 每管300-400 L。 加入200 LPI染色剂， 。
20、避光 4染色20min， 每管200 L， 过滤(400目筛子)。 置于冰盒内， 流式细胞仪检测。 0043 结果如图5： 流式检测小分子多肽RBBP5转染后对A549肺癌细胞周期的影响。 ， 与 空白对照组A549细胞(左)相比， 小分子多肽RBBP5转染后(右)， A549细胞的细胞增殖能力 明显受到抑制。 对照组细胞停滞在G1期的为55.34， 而转染RBBP5截短体的细胞停滞在G1 期的增加至73.27， 并且进入S期的细胞由对照组21.76减少为9.34。 与对照组相比， 转染RBBP5截短体后能够将细胞周期阻滞在G1期， 有明显的细胞周期抑制作用。 0044 实施例5CCK8检测R。
21、BBP5截短体的表达对细胞增殖的影响 0045 CCK-8细胞增殖实验： 在A549细胞中， 转染RBBP5截短体48h后收集细胞， 每孔5000 个细胞接种到96孔板， 每孔体积100 L。 每孔换液(CCK-8与培养液的比例为1:10)， 37孵育 2h， 终止培养， 酶标仪以490nm波长测量各孔的吸光度值， 每组设四复孔。 每24h测定各组 CCK-8吸光度值一次， 共检测3天， 以时间为横坐标， 吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 0046 主要方法为： 在96孔板中接种H1299细胞悬液(100 L/孔)， 密度为104-105/mL， 将 培养板在培养箱预培养过夜(在37， 5CO。
22、2的条件下)， 刺激细胞。 到达时间点后换液， 向每孔加入100 L含10 LCCK-8溶液的细胞培养基(注意不要在孔中生成气泡， 它们会影响 OD值的读数)。 将培养板在培养箱内孵育1.5-2h。 (不同时间点要保持相同的时间)用酶 标仪测定(测定波长490nm， 参照波长630nm)处的吸光度。 0047 结果如图6 CCK8实验检测小分子多肽RBBP5转染后对A549肺癌细胞增殖的影响。 结果显示： 转染RBBP5截短体的细胞增殖速度低于空白对照组。 说明书 4/4 页 6 CN 105949285 A 6 0001 序列表 1/4 页 7 CN 105949285 A 7 0002 序列表 2/4 页 8 CN 105949285 A 8 0003 序列表 3/4 页 9 CN 105949285 A 9 0004 序列表 4/4 页 10 CN 105949285 A 10 图1 图2 图3 说明书附图 1/3 页 11 CN 105949285 A 11 图4 图5 说明书附图 2/3 页 12 CN 105949285 A 12 图6 说明书附图 3/3 页 13 CN 105949285 A 13 。