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1、(10)授权公告号 CN 101671320 B (45)授权公告日 2012.02.29 CN 101671320 B *CN101671320B* (21)申请号 200910185163.0 (22)申请日 2009.09.30 C07D 307/58(2006.01) (73)专利权人 合肥工业大学 地址 230009 安徽省合肥市包河区屯溪路 193 号 (72)发明人 张文成 郑仁娟 张海涛 刘玲 王瑞霞 (74)专利代理机构 安徽省合肥新安专利代理有 限责任公司 34101 代理人 吴启运 (54) 发明名称 一种去氧穿心莲内酯分离纯化方法 (57) 摘要 一种去氧穿心莲内酯分离。
2、纯化方法， 是一种 集成溶剂萃取 - 柱层析 - 溶剂重结晶 - 超临界流 体抗溶剂结晶方法。用该方法对穿心莲浸膏进行 加工， 制备高纯去氧穿心莲内酯。用氯仿萃取 ； 柱 层析填料 ( 固定相 ) 采用硅胶等， 流动相为石油 醚与乙酸乙酯的混合溶剂 ； 重结晶溶剂为乙酸乙 酯， 结晶方式为抽虑结晶 ； 超临界 CO2流体抗溶剂 结晶， 结晶条件为 ： 压力15MPa， 温度70。 产 品含量最高可达 99以上。该分离纯化工艺， 方 法简便、 成本低、 易于工业生产应用。 (51)Int.Cl. 审查员 宋增锋 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 。
3、4 页 CN 101671320 B1/1 页 2 1. 一种去氧穿心莲内酯分离纯化方法， 其特征在于 ： 称取 1kg 穿心莲浸膏， 去氧穿心莲内酯含量 4以上， 按 1 10(W/V) 的固液比溶于 35温水中， 再用氯仿萃取 2 次 ； 将氯仿萃取溶液合并、 真空脱溶得到固体粉末， 将粉末转移到硅胶色谱柱中， 用石油 醚与乙酸乙酯体积比 40 60 70 30的流动相洗脱， 以紫外检测器在线检测定 位， 收集 70以上的去氧穿心莲内酯流分 ； 将上述流分合并， 真空浓缩干燥， 得固体粉末， 再溶解到乙酸乙酯中， 按液固比 30 1(V/W) 配成溶液， 进行真空浓缩， 当有微量晶体析出后。
4、停止浓缩， 将溶液再冷却至 25 30， 倒入放有两层滤纸的布氏漏斗上过滤、 结晶 ； 过程重复两次， 取出结晶产物， 进行含量检测， 产品纯度在 97以上 ； 将上述结晶产物用45乙醇溶剂配成饱和溶液， 再放置于超临界CO2结晶釜中， 结晶 压力控制在 10MPa， 温度在 60， 进行超临界 CO2抗溶剂结晶 60min ； 试验结束后， 取样检测， 可得到纯度 99以上去氧穿心莲内酯 17.5g。 2. 一种去氧穿心莲内酯分离纯化方法， 其特征在于 ： 称取 1kg 穿心莲浸膏， 去氧穿心莲内酯含量 4以上， 按 1 20(W/V) 的固液比溶于 40温水中， 再用氯仿萃取 2 次 ； 。
5、将氯仿萃取溶液合并、 真空脱溶得到固体粉末， 将粉末转移到硅胶色谱柱中， 用石油 醚与乙酸乙酯体积比 40 60 70 30的流动相洗脱， 以紫外检测器在线检测定 位， 收集 70以上的去氧穿心莲内酯流分 ； 将上述流分合并， 真空浓缩干燥， 得固体粉末， 再溶解到乙酸乙酯中， 按液固比 30 1(V/W) 配成溶液， 进行真空浓缩， 当有微量晶体析出后停止浓缩， 将溶液再冷却到 25 30， 倒入放有两层滤纸的布氏漏斗上过滤、 结晶 ； 过程重复两次， 取出结晶产物， 进行含量检测， 产品纯度在 97以上 ； 将上述结晶产物用45乙醇溶剂配成饱和溶液， 再放置于超临界CO2结晶釜中， 结晶 。
6、压力控制在 12MPa， 温度在 55， 进行超临界 CO2抗溶剂结晶 70min ； 试验结束后， 取样检测， 可得到纯度 99以上去氧穿心莲内酯 16.7g。 3. 一种去氧穿心莲内酯分离纯化方法， 其特征在于 ： 称取 1kg 穿心莲浸膏， 去氧穿心莲内酯含量 4以上， 按 1 15(W/V) 的固液比溶于 45温水中， 再用氯仿萃取 2 次 ； 将氯仿萃取溶液合并、 真空脱溶得到固体粉末， 将粉末转移到硅胶色谱柱中， 用石油 醚与乙酸乙酯体积比 40 60 70 30的流动相洗脱， 以紫外检测器在线检测定 位， 收集 70以上的去氧穿心莲内酯流分 ； 将上述流分合并， 真空浓缩干燥， 。
7、得固体粉末， 再溶解到乙酸乙酯中， 按液固比 30 1(V/W) 配成溶液， 进行真空浓缩， 当有微量晶体析出后停止浓缩， 将溶液再冷却到 25 30， 倒入放有两层滤纸的布氏漏斗上过滤、 结晶 ； 过程重复两次， 取出结晶产物， 进行含量检测， 产品纯度在 97以上 ； 将上述结晶产物用45乙醇溶剂配成饱和溶液， 再放置于超临界CO2结晶釜中， 结晶 压力控制在 8MPa， 温度在 65， 进行超临界 CO2抗溶剂结晶 60min ； 试验结束后， 取样检测， 可得到纯度 99以上去氧穿心莲内酯 16.1g。 权 利 要 求 书 CN 101671320 B1/4 页 3 一种去氧穿心莲内酯。
8、分离纯化方法 一、 技术领域 0001 本发明涉及一种中药有效成分分离纯化方法， 确切地说是一种去氧穿心莲内酯分 离纯化方法。 二、 背景技术 0002 穿心莲 Andrographis paniculate(Burm.f.)Nees 为爵床科植物穿心莲的全草 或叶。别名 ： 春莲秋柳 (岭南采药录 )、 一见喜 (泉州本草 )、 榄核莲、 苦胆草、 斩蛇剑、 日行千里、 印度草 ( 广东 )， 苦草 ( 福建 ) 等。原产于印度， 我国主产于华南、 西南等长江以 南温暖、 湿润地区、 其气味苦、 性寒、 归大肠、 心、 肺、 膀胱经， 具有清热解毒、 凉血、 消肿的功 效。用于感冒发热， 咽。
9、喉肿痛， 口舌生疮， 顿咳劳嗽， 泄泻痢疾， 热淋涩痛， 痈肿疮疡， 毒蛇咬 伤。 0003 穿心莲内酯类化合物主要活性成分有穿心莲内酯、 去氧穿心莲内酯、 脱水穿心莲 内酯、 新穿心莲内酯等。 0004 其中， 去氧穿心莲内酯 (dexyandrographolide)， 别名 ： 穿心莲甲素， 脱羟基穿心 莲内酯、 14- 去氧穿心莲内酯， 为萜类化合物 ； 可溶于甲醇、 乙醇、 丙酮、 吡啶和氯仿， 微溶于 苯和乙醚 ； 这无色针状结晶(乙醚-轻石油醚)， 无色片状结晶(丙酮、 乙醇或氯仿) ； 熔点 ： 174 175.5 ； 分子式 ： C20H30O4； 分子量 334.44。有以。
10、下结构式 ： 0005 0006 去氧穿心莲内酯具有抗菌和钩端螺旋体作用。临床试用治疗钩端螺旋体、 急性细 菌性痢疾、 上呼吸道感染、 流行性感冒及原因不明的发热等病症均有一定疗效。毒性小， 未 见明显副作用。能减少二甲苯或 H+刺激所致伊文思兰自毛血管壁的渗出， 有抑制巴豆油所 致大鼠炎性渗出作用， 对大鼠蛋清性足肿显著抑制作用， 对肾上腺皮质功能有不同程度的 兴奋作用。 0007 鉴于去氧穿心莲内酯有上述专属功效， 有必要进行分离纯化。而国内对穿心莲内 酯类化合物提取分离研究比较早， 也比较多。 早期主要以水浸提、 乙醇提取、 碱水提取为主， 得到的产品为粗提物 ( 穿心莲总内酯含量在 3。
11、0左右 )。目前也有采用新技术提取分离 穿心莲内酯， 取得了一定的成效， 如南开大学采用大孔吸附树脂提取穿心莲总内酯的研究 说 明 书 CN 101671320 B2/4 页 4 ( 范去鸽， 张秀莉， 史作清， 等 . 离子交换与吸附 ， 2002， 18(1) ： 30-35) ； 也有采用超临界流 体技术提取穿心莲总内酯 ( 葛发欢， 林秀仙， 黄晓芬， 等 . 中药材 ， 2002， 25(2) ： 101-102)， 产品质量相对传统工艺有所提高， 但在提高产品纯度上没有明显优势， 只是以穿心莲内酯 总内酯为考察指标的粗提物 ； 也有采用超临界流体萃取技术提取分离穿心莲内酯专利报 道。
12、， 如专利 ： 一种提取穿心莲有效成份的方法(专利号 ： ZL00114213.5)。 国内外对去氧穿心 莲内酯单体提取分离研究的报道较少。 0008 2000 药典则收集了穿心莲药材及片剂的质量检测方法， 其内酯含量是重要的质控 指标， 已得到多数研究的肯定， 且大多数是以穿心莲内酯、 脱水穿心莲内酯为研究对象， 而 去氧穿心莲内酯由于难与脱水穿心莲内酯分离， 故研究较少， 并被忽视利用。 0009 目前制备高纯度萜类化合物在都采用有机溶剂反复重结晶方法， 其耗时长、 得率 低， 且纯度也难于达到 98以上。 三、 发明内容 0010 本发明旨在为开发 I 类中药新药提供高纯度的原料药去氧穿。
13、心莲内酯， 所要解决 的技术问题是去氧穿心莲内酯的分离和纯化。 0011 本发明的技术方案是以穿心莲浸膏 ( 穿心莲总内酯含量 30 ) 为起始原料， 浸 膏先经过氯仿进行萃取， 脱溶后得到浅黄色的粗晶体， 然后上色谱柱， 接收含量 70以上的 去氧穿心莲内酯单体组分， 脱溶后再用有机溶剂重结晶， 最后进行超临界流体抗溶剂结晶。 0012 所谓的超临界流体抗溶剂结晶， 就是以超临界流体为逆溶剂， 其与溶质、 溶剂形成 的溶液相混合， 快速带走溶剂和部分杂质使溶液在较短的时间内形成较高的过饱和度， 溶 质结晶析出， 得到纯度高， 粒径分布均匀的微粒。一般选 CO2为超临界流体。 0013 具体的。
14、技术方案是 ： 0014 将穿心莲浸膏溶于温水中， 用氯仿萃取， 萃取液脱溶后上色谱层析柱， 并用混合溶 剂洗脱， 接收含量 70以上的去氧穿心莲内酯组分， 脱溶后再采用乙酸乙酯进行重结晶， 纯 度达 97， 最后进行超临界 CO2抗溶剂结晶， 通过控制压力、 温度、 时间进行结晶， 经 1 次抗 溶剂结晶后， 可制得 99上的去氧穿心莲内酯高纯品。 0015 具体操作步骤是 ： 0016 (1) 首先将穿心莲浸膏溶解到 10-20 倍体积的 30 50的温水中， 选择氯仿进行 溶剂萃取至少 2 次 ； 0017 (2) 将萃取液合并、 脱溶后， 进行色谱柱层析分离， 分离介质 ( 固定相 )。
15、 选自硅胶 等， 流动相选自石油醚与乙酸乙酯的混合液， 进行分段收集流份， 主要收集含量 70以上的 目标物质流份 ； 0018 (3) 将上述收集到的流分合并、 真空浓缩干燥成粉末， 再采用乙酸乙酯进行重结晶 3 次， 纯度达 97 ； 0019 (4) 将纯度 97产品配成乙酸乙酯饱和溶液， 进行超临界 CO2抗溶剂结晶， 控制在 压力 8 15MPa， 温度在 45 70， 时间在 45 90min ； 0020 (5) 停机后收集抗溶剂结晶产物， 可制得纯度 99以上去氧穿心莲内酯。 0021 本发明为相关企业提供一种集成溶剂萃取 - 柱层析分离 - 溶剂结晶 - 超临界 CO2 抗溶。
16、剂结晶纯化的方法， 制备纯度达 99以上的去氧穿心莲内酯。超临界流体 (CO2) 抗溶 说 明 书 CN 101671320 B3/4 页 5 剂结晶不但具有传统的细化微粒的效果， 同时具有脱除溶剂和萃取微量杂质等功能， 从而 达到结晶纯化效果 ； 结晶条件要求较低， 一般压力小于 15MPa， 温度 70以下， 所析晶体纯 度高， 可达到 99以上， 适合高纯物质的制备。本法工艺简单， 无需冷冻干燥或喷雾干燥等 复杂耗能工艺。同时其得率也较传统工艺高， 去氧穿心莲内酯纯度超过 99， 收率 40 ( 以浸膏中去氧穿心莲内酯计 )， 适合批量生产。穿心莲浸膏产品目前市场饱和， 价格便宜， 方便。
17、运输， 既提高分离纯化的生产效率， 又降低层析柱的污染。 四、 具体实施方式 0022 实施例 1 ： 0023 称取 1kg 穿心莲浸膏 ( 去氧穿心莲内酯含量 4以上 )， 按 1 10(W/V) 的固液 比溶于 35温水中， 再用氯仿萃取 2 次 ； 0024 将氯仿萃取溶液合并、 真空脱溶得到固体粉末， 将粉末转移到硅胶色谱柱中， 用 石油醚与乙酸乙酯 (40 60 70 30， V/V) 流动相洗脱， 以紫外检测器在线检测 定位， 收集 70以上的去氧穿心莲内酯流分 ； 0025 将上述流分合并， 真空浓缩干燥， 得固体粉末， 再溶解到乙酸乙酯中， 按液固比 30 1(V/W) 配成。
18、溶液， 进行真空浓缩， 当有微量晶体析出后停止浓缩， 将溶液再冷却至 25 30左右， 倒入放有两层滤纸的布氏漏斗上过滤、 结晶 ； 0026 过程重复两次， 取出结晶产物， 进行含量检测， 产品纯度在 97以上 ； 0027 将上述结晶产物用 45左右乙醇溶剂配成饱和溶液， 再放置于超临界 CO2结晶 釜中， 结晶压力控制在 10MPa， 温度在 60， 进行超临界 CO2抗溶剂结晶 60min ； 0028 试验结束后， 取样检测， 可得到 99以上高纯去氧穿心莲内酯 17.5g。 0029 实施例 2 ： 0030 称取 1kg 穿心莲浸膏 ( 去氧穿心莲内酯含量 4以上 )， 按 1 。
19、20(W/V) 的固液 比溶于 40温水中， 再用氯仿萃取 2 次 ； 0031 将氯仿萃取溶液合并、 真空脱溶得到固体粉末， 将粉末转移到硅胶色谱柱中， 用 石油醚与乙酸乙酯 (40 60 70 30， V/V) 流动相洗脱， 以紫外检测器在线检测 定位， 收集 70以上的去氧穿心莲内酯流分 ； 0032 将上述流分合并， 真空浓缩干燥， 得固体粉末， 再溶解到乙酸乙酯中， 按液固比 30 1(V/W) 配成溶液， 进行真空浓缩， 当有微量晶体析出后停止浓缩， 将溶液再冷却到 25 30左右， 倒入放有两层滤纸的布氏漏斗上过滤、 结晶 ； 0033 过程重复两次， 取出结晶产物， 进行含量检。
20、测， 产品纯度在 97以上 ； 0034 将上述结晶产物用 45左右乙醇溶剂配成饱和溶液， 再放置于超临界 CO2结晶 釜中， 结晶压力控制在 12MPa， 温度在 55， 进行超临界 CO2抗溶剂结晶 70min ； 0035 试验结束后， 取样检测， 可得到 99以上高纯去氧穿心莲内酯 16.7g。 0036 实施例 3 ： 0037 称取 1kg 穿心莲浸膏 ( 去氧穿心莲内酯含量 4以上 )， 按 1 15(W/V) 的固液 比溶于 45温水中， 再用氯仿萃取 2 次 ； 0038 将氯仿萃取溶液合并、 真空脱溶得到固体粉末， 将粉末转移到硅胶色谱柱中， 用 石油醚与乙酸乙酯 (40 。
21、60 70 30， V/V) 流动相洗脱， 以紫外检测器在线检测 说 明 书 CN 101671320 B4/4 页 6 定位， 收集 70以上的去氧穿心莲内酯流分 ； 0039 将上述流分合并， 真空浓缩干燥， 得固体粉末， 再溶解到乙酸乙酯中， 按液固比 30 1(V/W) 配成溶液， 进行真空浓缩， 当有微量晶体析出后停止浓缩， 将溶液再冷却到 25 30左右， 倒入放有两层滤纸的布氏漏斗上过滤、 结晶 ； 0040 过程重复两次， 取出结晶产物， 进行含量检测， 产品纯度在 97以上 ； 0041 将上述结晶产物用 45左右乙醇溶剂配成饱和溶液， 再放置于超临界 CO2结晶 釜中， 结晶压力控制在 8MPa， 温度在 65， 进行超临界 CO2抗溶剂结晶 60min ； 0042 试验结束后， 取样检测， 可得到 99以上高纯去氧穿心莲内酯 16.1g。 说 明 书 。