《一种(+)-内酰胺酶及其编码基因与应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种(+)-内酰胺酶及其编码基因与应用.pdf（12页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102796719 A (43)申请公布日 2012.11.28 CN 102796719 A *CN102796719A* (21)申请号 201210293158.3 (22)申请日 2012.08.16 C12N 9/86(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12P 41/00(2006.01) C12P 17/10(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人。
2、 北京化工大学 地址 100029 北京市朝阳区北三环东路 15 号 (72)发明人 郑国钧 朱绍洲 任璐 (74)专利代理机构 北京思海天达知识产权代理 有限公司 11203 代理人 张慧 (54) 发明名称 一种 (+)- 内酰胺酶及其编码基因与应用 (57) 摘要 本发明公开了一种来源于古细菌 （Aeropyrum pernix） 的 (+)- 内酰胺酶及其编码基因及其应 用。本发明所述的 (+)- 内酰胺酶是如下 （a） 或 （b） 的蛋白质 ：（a） 由序列表中的 SEQ ID No:1 的 氨基酸残基序列组成的蛋白质 ；（b） 将序列表中 的 SEQ ID No:1 氨基酸残基序列。
3、经过一个或多个 氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加且具有 拆分消旋体 - 内酰胺活性的由 SEQ ID No:1 衍 生的蛋白质。 利用该(+)-内酰胺酶水解拆分消 旋体 - 内酰胺可以获得光学纯度 91.4%99.9% 的 (-)- 内酰胺， 收率大于 45%。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 序列表 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 5 页 序列表 3 页 附图 1 页 1/2 页 2 1. 一种具有拆分消旋体 - 内酰胺活性的 (+)- 内酰胺酶， 所述的 (+)- 内酰胺酶。
4、 是以下蛋白质 （a） 或 （b） ： （a） 一种包含 SEQ ID No:1 的氨基酸残基序列的蛋白质 ； （b） 一种包含 SEQ ID No:1 的氨基酸残基序列经过取代和 / 或缺失和 / 或添加至少一 个或多个氨基酸残基而获得的氨基酸残基序列， 且具有拆分消旋体 - 内酰胺活性的蛋白 质。 2. 权利要求 1 中所述的 (+)- 内酰胺酶的编码基因。 3. 根据权利要求 2 所述的编码基因， 其特征在于， 所述的 (+)- 内酰胺酶的编码基因 具有下述核苷酸序列 （a） 或 （b） ： （a） 序列表中 SEQ ID No:2 所示的核苷酸序列 ； （b） 编码序列表中 SEQ I。
5、D No:1 蛋白质序列的多核苷酸序列。 4. 含有权利要求 2 或 3 所述的 (+)- 内酰胺酶编码基因的重组表达载体。 5. 含有权利要求 2 或 3 所述的 (+)- 内酰胺酶编码基因的转基因细胞系。 6. 含有权利要求 2 或 3 所述的 (+)- 内酰胺酶编码基因的宿主菌。 7.一种利用(+)-内酰胺酶制备(-)-内酰胺的方法， 所述的(+)-内酰胺酶是以 下蛋白质 （a） 或 （b） ： （a） 一种包含 SEQ ID No:1 的氨基酸残基序列的蛋白质 ； （b） 一种包含 SEQ ID No:1 的氨基酸残基序列经过取代和 / 或缺失和 / 或添加至少一 个或多个氨基酸残基而。
6、获得的氨基酸残基序列， 且具有拆分消旋体 - 内酰胺活性的蛋白 质 ； 利用 (+)- 内酰胺酶制备 (-)- 内酰胺的方法为 ： 将重组大肠杆菌菌体或重组(+)-内酰胺酶A-P悬浮在磷酸缓冲液中， 向所述的磷酸 缓冲液中加入 (-)- 内酰胺底物， 60120下反应 1024 小时， 得到反应混合物 ； 将上述 反应混合物离心， 取上清液， 向所述的上清液中加入乙酸乙酯进行萃取， 即得到所述的 (-) - 内酰胺。 8.一种利用(+)-内酰胺酶编码基因拆分消旋体-内酰胺制备(-)-内酰胺的方 法， 所述的 (+)- 内酰胺酶编码基因是以下核苷酸序列 （a） 或 （b） ： （a） SEQ I。
7、D No:2 所示的核苷酸序列 ； （b） 编码 SEQ ID No:1 蛋白质序列的多核苷酸序列 ； 利用 (+)- 内酰胺酶编码基因拆分消旋体 - 内酰胺制备 (-)- 内酰胺的方法为 ： 以嗜热泉生古细菌 （Aeropyrum pernix） NBRC No:100138 基因组为模版设计引物， 进 行聚合酶链式反应 （PCR） 扩增目的基因， 电泳回收目的片段 ； 再将所述的目的片段用 T4 连 接酶连接到 T 载体上， 转化到 E.coli DH5 中， 依次通过蓝白斑平板、 含卡那霉素的平板 的筛选 ； 之后进行单菌落 PCR， 根据电泳结果挑选测序的单菌落， 将测序成功的单菌落 。
8、37 培养， 并进行质粒中提， 即得到构建好的表达载体 ； 将所述表达载体导入宿主细胞， 用 IPTG 诱导表达得到重组宿主菌菌体， 将所述的重组宿主菌菌体进行破碎离心后得到所述的 (+) - 内酰胺酶 A-P ； 将所述的 (+)- 内酰胺酶 A-P 悬浮在磷酸缓冲液中， 向所述的磷酸缓冲液中加入 (-) -内酰胺底物， 60120下反应1024小时。 将上述反应混合物离心， 取上清液， 向所述的 权 利 要 求 书 CN 102796719 A 2 2/2 页 3 上清液中加入乙酸乙酯进行萃取， 即得到所述的 (-)- 内酰胺。 9.一种利用(+)-内酰胺酶编码基因拆分消旋体-内酰胺制备(。
9、-)-内酰胺的方 法， 所述的 (+)- 内酰胺酶编码基因是以下核苷酸序列 （a） 或 （b） ： （a） SEQ ID No:2 所示的核苷酸序列 ； （b） 编码 SEQ ID No:1 蛋白质序列的多核苷酸序列 ； 利用 (+)- 内酰胺酶编码基因拆分消旋体 - 内酰胺制备 (-)- 内酰胺的方法为 ： 以嗜热泉生古细菌 （Aeropyrum pernix） NBRC No:100138基因组为模版设计引物， 进行 聚合酶链式反应 （PCR） 扩增目的基因， 电泳回收目的片段 ； 再将所述的目的片段用 T4 连接 酶连接到T载体上， 转化到E.coli DH5中， 依次通过蓝白斑平板、 。
10、含卡那霉素的平板的筛 选 ； 之后进行单菌落 PCR， 根据电泳结果挑选测序条带， 将测序成功的单菌落 37培养， 并 进行质粒中提， 即得到构建好的表达载体 ； 将所述表达载体导入宿主细胞， 用 IPTG 诱导表 达得到重组宿主菌菌体， 将所述的重组宿主菌菌体进行破碎离心后得到所述的 (+)- 内 酰胺酶 A-P ； 将所述的重组宿主菌菌体悬浮在磷酸缓冲液中， 向所述的磷酸缓冲液中加入 (-) - 内酰胺底物， 60120下反应 1024 小时 ； 将上述反应混合物离心， 取上清液， 向所述的 上清液中加入乙酸乙酯进行萃取， 即得到所述的 (-)- 内酰胺。 权 利 要 求 书 CN 102。
11、796719 A 3 1/5 页 4 一种 (+)- 内酰胺酶及其编码基因与应用 技术领域 0001 本发明属于酶工程领域， 具体涉及一种具有拆分消旋体 - 内酰胺活性的 (+) - 内酰胺酶及其编码基因与应用。 背景技术 0002 (-)2- 氮杂双环 2,2,1 庚 -5- 烯 -3- 酮 （简称 (-)- 内酰胺） 是合成抗病毒药 物如阿巴卡韦、 抗甲型流感及禽流感药物帕拉米韦的重要中间体。传统上是通过化学合成 的方法制备 (-)- 内酰胺， 但该方法成本高、 步骤繁琐， 并且催化过程中使用的重金属催 化剂会对环境造成严重的污染。而生物酶法在合成手性 (-)- 内酰胺的过程中具有高效 简。
12、便、 节约能源、 环境友好等诸多优点。 0003 0004 能够水解拆分消旋体 - 内酰胺的酶被称为 (+)- 内酰胺酶。(+)- 内酰胺酶 属于酰胺酶的一种， -内酰胺酶主要应用于(-)-内酰胺的手性合成中。 目前报道的(+) - 内酰胺酶对消旋 - 内酰胺的拆分过程中存在的缺点主要有 ：（1） (+)- 内酰胺酶对 消旋 - 内酰胺拆分的选择性较差 ；（2） 选用的酶不稳定， 从而限制了其工业化应用。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种具有拆分消旋体 - 内酰胺活性的 (+)- 内酰胺酶及 其编码基因与应用。该 (+)- 内酰胺酶对 (+)- 内酰胺具有绝对选择性， 催化反应时只 。
13、选择性水解 (+)- 内酰胺， 从而获得光学纯的 (-)- 内酰胺， 用于药物合成。 0006 为了解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案是 ： 0007 本发明提供的 (+)- 内酰胺酶被命名为 A-P， 来源于嗜热泉生古细菌 （Aeropyrum pernix） NBRC No.100138。 0008 (+)- 内酰胺酶 A-P 是如下 （a） 或 （b） 的蛋白质 ： 0009 （a） 一种包含 SEQ ID No:1 的氨基酸残基序列的蛋白质 ； 0010 （b） 一种包含 SEQ ID No:1 的氨基酸残基序列经过取代和 / 或缺失和 / 或添加至 少一个或多个氨基酸残基而获得。
14、的氨基酸残基序列， 且具有拆分消旋体 - 内酰胺活性的 蛋白质。 0011 其中， 序列表中的 SEQ ID No:1 由 377 个氨基酸残基组成。 说 明 书 CN 102796719 A 4 2/5 页 5 0012 上述 (+)- 内酰胺酶的编码基因也属于本发明的保护范围， 它可具有下述核苷 酸序列之一 ： 0013 （a） 序列表中 SEQ ID No:2 所示的核苷酸序列 ； 0014 （b） 编码序列表中 SEQ ID No:1 蛋白质序列的多核苷酸。 0015 其中， 序列表中的 SEQ ID No:2 由 1134 个碱基组成， 其编码序列为自 5 端第 1 到 第 1134。
15、 位碱基， 编码具有序列表中 SEQ ID No:1 的氨基酸残基序列的蛋白质。 0016 本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的 ： 0017 含有本发明基因的表达载体、 细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。 0018 本发明所述的 (+)- 内酰胺酶 A-P 的制备方法为 ： 0019 A. 以嗜热泉生古细菌 （Aeropyrum pernix） NBRC No.100138 基因组为模版设计引 物， 进行聚合酶链式反应 （PCR） 扩增基因， 将上述得到的扩增片段进行 1.5% 琼脂糖凝胶电 泳， 电泳后回收大小约为 1200bp 的条带， 即得到目的片段 ； 0020 B. 将上述。
16、目的片段用 T4 连接酶连接到 T 载体上， 转化到大肠杆菌 E.coli DH5 中， 转化产物涂到蓝白斑平板上， 其中培养基中加入 40L 5- 溴 -4 氯 -3- 吲哚 -D- 半 乳糖苷 （X-gal） ， 8L 500mol/L 异丙基 -D- 硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG） ， 37过夜培养 ； 0021 C. 挑取上述过夜培养后的单菌落进行 PCR， 根据电泳结果挑选测序的单菌落， 将 测序成功的单菌落于37培养， 并进行质粒中提， 用Nde和Hind 内切酶对目的片段和 质粒pET30进行酶切， 进行1.5%琼脂糖凝胶电泳， 电泳后分别回收目的片段和载体大片段。 0022 D。
17、. 将上述的目的片段用 T4 连接酶连接到载体大片段上， 再次转化到 E.coli DH5 中， 转化产物涂到含卡那霉素的平板上， 37过夜培养。 0023 E. 挑取上述过夜培养后的单菌落进行 PCR， 根据电泳结果挑选测序条带， 将测序 成功的单菌落于 37培养， 并进行质粒中提， 即得到构建好的表达载体。 0024 F. 将上述构建好的表达载体导入宿主细胞， 用 60L 500mol/L IPTG 诱导表达得 到 (+)- 内酰胺酶 A-P。 0025 本发明所述的 (+)- 内酰胺酶 A-P 还可以通过化学合成 (+)- 内酰胺酶 A-P 的编码基因， 通过常规基因操作手段将此化学合成。
18、的基因构建到表达载体， 并导入大肠杆 菌宿主细胞得到转化子， 培养该转化子， 培养后的转化子即为重组大肠杆菌菌体， 表达得到 (+)- 内酰胺酶 A-P。 0026 用于构建含有上述 - 内酰胺酶编码基因的重组表达载体都可以为基因工程领 域中的质粒表达载体， 可行的载体包括 pET 系列载体， pUC 系列载体， pGEX 系列载体等。宿 主细胞选择与上述表达载体相应的宿主， 如大肠杆菌 E.coli BL-21(DH3) 等。表达后的蛋 白可以进一步利用公认已知的纯化方法进行纯化。 0027 本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的 ： 0028 本发明所述的 (+)- 内酰胺酶 A-P 可。
19、以用于消旋的 - 内酰胺的拆分， 其方法 为 ： 0029 将重组大肠杆菌菌体或重组 (+)- 内酰胺酶 A-P 悬浮在 150mmol pH6.08.5 的 磷酸缓冲液中， 向所述的磷酸缓冲液中加入 5g/L 的 (-)- 内酰胺底物， 60120下反应 1024小时。 将上述反应混合物离心， 取上清液， 向所述的上清液中250L乙酸乙酯进行萃 取， 即得到所述的 (-)- 内酰胺。 说 明 书 CN 102796719 A 5 3/5 页 6 0030 本发明相比现有技术的有益效果是 ： 0031 1. 本发明提供了一种具有拆分消旋体 - 内酰胺活性的 (+)- 内酰胺酶及其编 码基因， 。
20、由于该 (+)- 内酰胺酶对消旋 - 内酰胺拆分具有绝对选择性， 所以大大提高了 (-)- 内酰胺的纯度和产率。 0032 2.本发明提供的(+)-内酰胺酶性质稳定， 在60120下可长时间保持其活力， 相比较于常温酶具有耐受性强的特点， 所以具备工业化应用的前景。 0033 3. 本发明提供的 (+)- 内酰胺酶具有较高的温度耐受性， 相比较于现有的常温 酶， 可以采取高温热处理的方法， 可一步获得大量纯化蛋白， 方法简单， 成本较低。 0034 4. 本发明利用 (+)- 内酰胺酶拆分消旋体 - 内酰胺， 方法高效简便， 对环境污 染小。 附图说明 0035 图 1. 以嗜热泉生古细菌基因。
21、组为模板 PCR 扩增 A-P 的 DNA 电泳图 0036 图 2. 重组 A-P 表达的 SDS-PAGE 图 0037 图 3. 重组 A-P 拆分外消旋 - 内酰胺 HPLC 图谱 具体实施方式 0038 实施例 1 0039 （一） 本发明的 (+)- 内酰胺酶 A-P 基因的获得 0040 （1） (+)- 内酰胺酶 A-P 基因组日本生物资源中心 （NBRC） 直接购买 0041 （2） 引物设计 0042 根据已知的 (+)- 内酰胺酶 A-P 基因序列设计引物， 引物序列如下 （由上海生工 合成） ； 0043 A-P 上游引物 ： 0044 5 -GGAATTCCATATG。
22、GTAACAAGGATAACT-3 0045 下划线表示 Nde 酶切位点 0046 A-P 下游引物 ： 0047 5 -CCCAAGCTTCTACTCTGCTAGCTTCTTC-3 0048 下划线表示 Hind 酶切位点 0049 （3） PCR 扩增及基因克隆 0050 以所述的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增， PCR 反应体系为 ： 1L 基因组 DNA （100g/L） ， 2.5L10PCR Buffer， 上下游引物各 1L， 1L dNTP（2.5mM， GenStar， Cat#A114-01） ， 1mL Taq 酶 （5U/L， TaKaRa TaqTM， D。
23、R001A） ， 用 ddH2O 补至 25L。PCR 条件 为 ： 第一步热变性 95， 5 分钟 ； 第二步热变性 95， 30 秒 ； 第三步退火 53， 1 分钟 ； 第四 步延伸 72， 1 分钟 ； 第五步延伸 72， 10 分钟。第二步到第四步之间设置 30 个循环， PCR 反应结束之后琼脂糖凝胶电泳检测 （见附图 1， 泳道 1 ： A-P PCR 产物 ； 泳道 M ： DNA 分子量标 准） 。 0051 PCR 产物经胶回收试剂盒 （QIAGEN， Cat.No.28704） ， 操作方法按照试剂盒提供的 说明书进行， 回收 1200bp 左右的条带 ； 将该条带回收后。
24、用 T4 连接酶连接到 T 载体上， 转化 说 明 书 CN 102796719 A 6 4/5 页 7 到 E.coli DH5 中， 转化产物进行蓝白斑筛选 （培养基中加入 40L X-gal， 8L500mol/L IPTG） ， 37过夜培养 ； 挑取过夜培养后得到的单菌落， 进行菌落 PCR， 根据 PCR 产物电泳结 果挑选测序的单菌落， 将测序成功的单菌落于 37培养， 并进行质粒中提 ； 将提取的质粒 分别用 Nde （Fermentas,Cat.No.FD0584） 和 Hind 酶切 （Fermentas,Cat.No.FD0504） ， 连入相同酶切的 pET30 质粒 。
25、（Novagen,Cat.No.69909-3） ， 得到构建好的载体 pET30A-P。 0052 （二） 重组蛋白表达和纯化 0053 将所述的构建好的质粒 pET30A-P 通过热激法导入大肠杆菌 E.coli BL-21 （DH3） ， 获得转化子 E.coli BL-21（pET30A-P） ； 将所述的转化子 800L 接种到 LB 液体培养基 （含 卡那霉素， 浓度为 30g/mL） 的试管中， 37过夜培养 ； 然后接种到 50mL LB 培养基中， 37 培养3-4小时， 加入60L 500mol/L IPTG， 30过夜诱导表达， 得到诱导表达混合液。 将上 述的诱导表达混。
26、合液离心并收集菌体， 该菌体即为重组大肠杆菌菌体 ； 将所述菌体悬浮在 磷酸缓冲液中， 超声破碎 （227W， 超声 2 秒， 间隔 4.5 秒， 超声 50 分钟） 。将所述的超声破碎 的菌液离心 （12000rpm） ， 收集上清液， 即得到 (+)- 内酰胺酶 A-P 粗提物。 0054 根据所述的 (+)- 内酰胺酶 A-P 的嗜热特性， 纯化过程不采用 Ni-NTA 亲和柱纯 化的方法， 而是采用高温加热的方法除去杂蛋白。将超声破碎后得到的所述的 (+)- 内酰 胺酶 A-P 粗提物， 在 80100温度范围内加热 1024 个小时， 14800rpm 离心除去沉淀， 获得 上清液，。
27、 即得到所述的 (+)- 内酰胺酶 A-P。经 SDS-PAGE 检测表明蛋白的纯化效果较好， 除去了大部分的杂蛋白， 检测结果见附图 2（泳道 M ： 蛋白分子量标准 ； 泳道 1 ： pETA-P 诱导 前空白 ； 泳道 2 ： pETA-P 诱导后表达 ； 泳道 3 ： pETA-P 细胞破碎后上清表达 ； 泳道 4， pETA-P 细胞破碎后沉淀） 。 0055 （三） (+)- 内酰胺酶在消旋的 - 内酰胺拆分中的应用 0056 所述的 (+)- 内酰胺酶的活性测定采用 HPLC 方法。色谱柱型号为 Daicel 公司 Chiralpark AS-H(2504.6mm) ； 流动相为。
28、乙腈 ： 异丙醇 9:1 ； 流速为 0.6mL/min ； 检测波长 为 230nm。测定不同浓度的内酰胺标准品的峰面积， 绘制标准回归曲线， 从而可以根据峰面 积定量分析内酰胺的含量及转化率。 0057 取 150L 所 述 的 (+)- 内 酰 胺 酶 A-P（约 含 10g A-P）悬 浮 在 450L 150mmolpH6.08.5 的磷酸缓冲液中， 向所述的磷酸缓冲液中加入 50L 5g/L 的 (-)- 内 酰胺底物， 60120下反应 1024 小时。将上述反应混合物离心， 取上清液， 向所述的上清 液中 250L 乙酸乙酯进行萃取， 即得到所述的 (-)- 内酰胺。 0058。
29、 取所述的 (-)- 内酰胺 100L 进行 HPLC 检测， 获得光学纯度为 91.4%99.9%， 收率大于 45%， 结果参见图 3（A 消旋体 - 内酰胺的 HPLC 分析图谱 ； B 酶拆分获得的 (-) - 内酰胺 HPLC 分析图谱 ； 其中， 1 乙酸乙酯溶剂峰， 2(+)- 内酰胺， 3(-)- 内酰胺） 。 0059 实施例 2 0060 本实施例中所用原料的品质与实施例 1 相同， 制备方法参见实施例 1， 改进之处 在于 ： (+)- 内酰胺酶拆分消旋的 - 内酰胺应用中， 取 5mg 重组大肠杆菌菌体悬浮在 450L 150mmol pH6.08.5 的磷酸缓冲液中，。
30、 向所述的磷酸缓冲液中加入 50L 5g/L 的 (-)- 内酰胺底物， 60120下反应 1024 小时。将上述反应混合物离心， 取上清液， 向所 述的上清液中 250L 乙酸乙酯进行萃取， 即得到所述的 (-)- 内酰胺。 0061 取所述的 (-)- 内酰胺 100L 进行 HPLC（Shimadzu， Essentia LC-15C） 检测， 说 明 书 CN 102796719 A 7 5/5 页 8 获得光学纯度为 91.4%99.9%， 收率大于 45%。 0062 实施例 1、 实施例 2 中所采用的试剂和仪器如未作特殊说明均为市场常规产品。 0063 实施例1、 实施例2中，。
31、 所采用的PCR、 酶切、 连接、 转化等基因工程基本操作方法记 载于 分子克隆实验指南第三版 中 （ （美） J. 萨姆布鲁克等著， 科学出版社， 2002 年出版） 。 0064 显然， 本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所做的举例， 而并非是对 本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说， 在上述说明的基础上还可 以做出其他不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发 明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。 说 明 书 CN 102796719 A 8 1/3 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 102796719 A 9 2/3 页 10 0003 序 列 表 CN 102796719 A 10 3/3 页 11 序 列 表 CN 102796719 A 11 1/1 页 12 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102796719 A 12 。