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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610303228.7 (22)申请日 2016.05.10 (71)申请人 福州大学 地址 350108 福建省福州市闽侯县上街镇 大学城学园路2号福州大学新区 (72)发明人 邵敬伟范露露李晓杨祥 李诗琪 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 (51)Int.Cl. C07F 9/54(2006.01) A61K 31/662(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 含有糖酵解抑制基团的芦荟。
2、大黄素季磷盐 及其制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种含有糖酵解抑制基团的 芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯及其制备方法； 芦 荟大黄素先与三溴化磷反应得到溴代芦荟大黄 素， 辛基再与三正辛基膦反应生成芦荟大黄素季 磷盐， 最后与二氯乙酰氯发生酯化反应得到芦荟 大黄素季磷盐二氯乙酸酯： 。 芦荟大黄素季 磷盐二氯乙酸酯的体外癌细胞抑制试验表明， 对 多种癌细胞有抑制活性， 在制备抗肿瘤药物方面 具有较大的应用前景。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 105859777 A 2016.08.17 CN 105859777 A 1.一种含有糖酵解抑制基团的芦荟大黄素季磷盐， 其特征在于： 。
3、其结构式如下： 。 2.一种制备如权利要求1所述的含有糖酵解抑制基团的芦荟大黄素季磷盐的方法， 其 特征在于： 将芦荟大黄素与过量三溴化磷反应， 得到溴代芦荟大黄素； 溴代芦荟大黄素再与 三正辛基膦进行亲核取代反应得到芦荟大黄素季磷盐； 芦荟大黄素季磷盐与二氯乙酰氯发 生酯化反应得到芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯。 3.根据权利要求2所述的含有糖酵解抑制基团的芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯的制备 方法， 其特征在于： 具体包括以下步骤： 1） 溴代芦荟大黄素的合成： 将3.70mmol芦荟大黄素溶于100mLCCl4中， 室温下加入 10.8mmolPBr3， 升温至65， 回流下搅拌反应24h； 旋。
4、蒸除去溶剂， 残留物经硅胶柱层析 纯化， 得溴代芦荟大黄素； 2） 芦荟大黄素季磷盐的合成： 将1.00mmol溴代芦荟大黄素溶于15mL丙酮， 室温下加 入1.12mmol三正辛基膦， 升温至50， 反应6h， 反应结束后将溶剂旋干， 用二氯甲烷湿法 上样， 经硅胶柱层析梯度洗脱得芦荟大黄素季磷盐； 3） 芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯的合成： 将0.14mmol芦荟大黄素季磷盐和1.09mmol 碳酸钾用20mL丙酮溶于三口瓶中， 升温至37搅拌0.5h， 加入1.05mmol二氯乙酰氯， 搅 拌反应3h； 停止反应后用旋转蒸发仪除去溶剂， 用二氯甲烷湿法上样， 梯度洗脱进行柱层 析提纯， 得。
5、到芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯。 4.根据权利要求2所述的含有糖酵解抑制基团的芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯的制备 方法， 其特征在于： 步骤1） 中硅胶柱层析纯化所用的洗脱剂为CH2Cl2。 5.根据权利要求2所述的含有糖酵解抑制基团的芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯的制备 方法， 其特征在于： 步骤2） 中梯度洗脱的顺序为： V(CH2Cl2):V(C2H5OH)=40:130:125:1 20:1。 6.根据权利要求2所述的含有糖酵解抑制基团的芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯的制备 方法， 其特征在于： 步骤3） 中梯度洗脱的洗脱顺序为： V(CH2Cl2):V(C2H5OH)=40:130:1 25:1。
6、20:1。 7.一种如权利要求1所述的含有糖酵解抑制基团的芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯在制 备治疗癌症药物中的应用。 8.根据权利要求7所述的含有糖酵解抑制基团的芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯在制备 治疗癌症药物中的应用， 其特征在于： 所述的癌症包括肺癌和肝癌。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105859777 A 2 含有糖酵解抑制基团的芦荟大黄素季磷盐及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于抗癌药物的制备领域， 具体涉及一种含有糖酵解抑制基团的芦荟大黄 素季磷盐二氯乙酸酯及其制备方法。 背景技术 0002 癌细胞具有 “Warburgeffect” ， 即癌细胞即使在供氧充足的条件下依。
7、然倾向于糖 酵解， 因此通过抑制癌细胞糖酵解来抑制癌细胞活性是目前药物化学界公认的极其重要的 抗癌药物设计思路。 目前医学家普遍采用化疗药和糖酵解抑制剂联合用药的方式研究药物 抗癌机制。 0003 芦荟大黄素 （AE） 为大黄的抗菌有效成分， 可从芦荟中提取， 具有抗肿瘤活性、 抗菌 活性和免疫抑制作用等活性。 但是芦荟大黄素本身的活性较弱， 因此， 对芦荟大黄素进行结 构修饰提高其活性， 具有很大的应用前景。 本课题组早期研究表明， 芦荟大黄素季磷盐(AP) 具有良好的抗癌活性。 其与糖酵解抑制剂2-DG联用能够通过降低癌细胞的线粒体膜电位抑 制癌细胞线粒体功能， 增强大黄素季磷盐的抗癌活性。
8、。 但是， 在联合用药过程中发现， 2-DG 的用药剂量偏大， 易产生毒副作用； 同时联合用药难以保证药物同时到达癌症部位， 也难以 保证药物能以合适的浓度来产生协同抗癌效果。 0004 二氯乙酸(DCA)是著名糖酵解抑制剂， 可以激活丙酮酸脱氢酶激酶活性， 使丙酮酸 转化为乙酰辅酶进入有氧代谢途径， 从而抑制无氧代谢途径(即糖酵解途径)。 本发明将大 黄素季磷盐与二氯乙酸通过酯化反应进行耦合， 形成芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯 （AP- DCA） 。 一方面使芦荟大黄素季磷盐的抗癌活性增强； 另一方面使糖酵解抑制剂的用药剂量 降低， 减少毒副作用。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种。
9、含有糖酵解抑制基团的芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸 酯及其制备方法。 通过在芦荟大黄素上引入长碳链季磷盐作为亲脂性阳离子靶向线粒体， 再引入一个二氯乙酸酯， 以便水解后产生二氯乙酸作为糖酵解抑制剂， 从而大大提高芦荟 大黄素的抗癌活性。 0006 为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案： 一种含有糖酵解抑制基团的芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯， 其结构式如下： 。 说明书 1/4 页 3 CN 105859777 A 3 0007 所述的芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯的制备方法， 具体步骤为： 1） 溴代芦荟大黄素的合成： 将3.70mmol芦荟大黄素溶于100mLCCl4中， 室温下加入 10.8mmo。
10、lPBr3， 升温至65， 回流下搅拌反应24h； 旋蒸除去溶剂， 残留物经硅胶柱层析 纯化， 得溴代芦荟大黄素； 2） 芦荟大黄素季磷盐的合成： 将1.00mmol溴代芦荟大黄素溶于15mL丙酮， 室温下加 入1.12mmol三正辛基膦， 升温至50， 反应6h， 反应结束后将溶剂旋干， 用二氯甲烷湿法 上样， 经硅胶柱层析梯度洗脱得芦荟大黄素季磷盐； 3） 芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯的合成： 将0.14mmol芦荟大黄素季磷盐和1.09mmol 碳酸钾用20mL丙酮溶于三口瓶中， 升温至37搅拌0.5h， 加入1.05mmol二氯乙酰氯， 搅 拌反应3h； 停止反应后用旋转蒸发仪除去溶剂，。
11、 用二氯甲烷湿法上样， 梯度洗脱进行柱层 析提纯， 得到芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯。 0008 步骤1） 中硅胶柱层析纯化所用的洗脱剂为CH2Cl2。 0009 步骤2） 中梯度洗脱的顺序为： V(CH2Cl2):V(C2H5OH)=40:130:125:120:1。 0010 步骤3） 中梯度洗脱的洗脱顺序为： V(CH2Cl2):V(C2H5OH)=40:130:125:120: 1。 0011 一种如上所述的含有糖酵解抑制基团的芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯在制备治 疗癌症药物中的应用； 所述的癌症包括肺癌和肝癌。 0012 本发明的显著优点在于： 本发明将糖酵解抑制剂通过化学键合的方法引入。
12、芦荟大黄素季磷盐， 利用癌细胞水解 酶活性高特点， 可以保证化疗药芦荟大黄素季磷盐与糖酵解抑制剂二氯乙酸能同时到达癌 细胞部位且产生协同抗癌作用； 抗癌活性测试显示该药物具有较好抗癌活性， 其对多种癌 细胞具有增殖抑制作用， 有望开发为广谱抗癌药物。 附图说明 0013 图1芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯的合成路线； 图2二氯乙酸和芦荟大黄素及其衍生物等对肺癌细胞A549的抑制活性(IC50, M)； 图3二氯乙酸和芦荟大黄素及其衍生物等对肝癌细胞HepG2的抑制活性(IC50, M)。 具体实施方式 0014 为了使本发明所述的内容更加便于理解， 下面结合具体实施方式对本发明所述的 技术方案做进。
13、一步的说明， 但是本发明不仅限于此。 0015 实施例1 一种芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯的制备方法， 具体步骤为： 1） 溴代芦荟大黄素的合成 将芦荟大黄素3.70mmol溶于100mLCCl4中， 室温下加入10.8mmolPBr3,升温至65 ,回流下搅拌反应24h； 旋蒸除去溶剂后， 残留物经硅胶柱层析纯化 （洗脱剂CH2Cl2） 得橙 黄色固体溴代芦荟大黄素； 产物表征数据如下： 产率72.1%； m.p.72-73； Rf(CH2Cl2)=0.74;1HNMR(400MHz,CDCl3) :12.09 (s,1H,ArOH),12.06(s,1H,ArOH),7.89(d,J=5.2。
14、Hz,1H,ArH),7.88(s,1H, 说明书 2/4 页 4 CN 105859777 A 4 ArH),7.73(t,J=7.6Hz,1H,ArH),7.36(s,1H,ArH),7.35(d,J=6.4Hz,1H, ArH),4.51(s,2H,ArCH2Br);ESI-MSm/z331.1(M-H)-;HRMSm/z330.9619,理论值 (M-H)-330.9611. 2） 芦荟大黄素季磷盐的合成 将步骤1） 合成的溴代芦荟大黄素1.00mmol溶于15mL丙酮， 室温下加入1.12mmol三 正辛基膦， 升温至50， 反应6h， 反应结束后将溶剂旋干， 用二氯甲烷湿法上样， 。
15、经硅胶柱 层析梯度洗脱得芦荟大黄素季磷盐； 表征数据如下： 产率51.2%； m.p.54-56； Rf(CH2Cl2:C2H5OH=20:1)=0.21； 1HNMR(400MHz, CDCl3) :11.75(br,2H,OH),7.63(t,J=7.6Hz,1H,Ar-H),7.58(m,1H,Ar- H),7.57(m,2H,Ar-H),7.17(m,1H,Ar-H),4.67s,1H,ArCH2P+(C8H17)3,4.63 s,1H,ArCH2P+(C8H17)3,2.38(m,6H,P+(CH2C7H15)3),1.49-1.21m,36H,3CH2 (C6H12CH3)3,0.。
16、81(t,9H,CH3);13CNMR(400MHz,CDCl3) :192.1,180.4, 162.7,162.5,140.5,137.4,133.8,132.9,126.0,124.9,120.7,120.1,115.3, 115.1,31.7,31.6,31.2,31.1,30.8,30.7,29.0,28.9,28.8,22.6,22.5, 21.9,21.6,19.5,19.0,14.0;LC-MS(ESI)m/z:623.67(M-Br)+. 3） 芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯的合成 将步骤2） 合成的芦荟大黄素季磷盐0.14mmol和1.09mmol碳酸钾用20mL丙酮溶于三 口。
17、瓶中， 升温至37搅拌0.5h， 加入1.05mmol二氯乙酰氯， 搅拌反应3h； 停止反应后用 旋转蒸发仪除去溶剂， 用二氯甲烷湿法上样， 梯度洗脱进行柱层析提纯， 得到红棕色粘稠固 体， 即芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯； 产物表征数据为： 产率36.6%； m.p.46-48； Rf(CH2Cl2:C2H5OH=20:1)=0.20;1HNMR(400MHz, CDCl3) :7.70(d,J=7.6Hz,1H,Ar-H),7.60(s,1H,Ar-H),7.53(s,1H,Ar- H),7.37(s,1H,Ar-H),7.20(s,1H,Ar-H),6.06(s,1H,COCHCl2),4。
18、.32s, 1H,ArCH2P+(C8H17)3,4.30s,1H,ArCH2P+(C8H17)3,2.24m,6H,ArCH2P+ (CH2C7H15)3,1.60-1.50m,6H,3P+(CH2CH2C6H13)3,1.46-1.24m,30H,3P+ (C2H4C5H10CH3)3,0.86(t,J=7.2Hz,9H,CH3);13CNMR(400MHz,CDCl3) :192.3, 181.1,167.4,162.9,162.7,138.7,137.7,134.4,133.1,125.5,125.3,120.51, 120.47,115.7,115.6,65.4,37.1,31.9,。
19、31.7,31.6,31.0,30.8,30.6,30.0, 29.7,29.4,29.0,28.9,28.8,22.7,22.6,21.6,21.3,19.1,18.6,14.1;LC-MS (ESI)m/z:(M-Br)+733.67. 应用实施例1 芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯对肺癌细胞A549增殖抑制实验 将对数期的A549细胞， 用胰酶消化后， 细胞计数， 配成5104-1105/ml的细胞浓度， 将制得的细胞悬液， 每孔100 L接种到96孔板， 放于37、 5%CO2培养箱中培养24h， 弃掉 旧的培养基， 加入配制好的不同浓度芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯药物， 分别作用24h 后，。
20、 吸弃含药培养基， 于每孔中加入0.5mg/mlMTT的溶液100 L， 继续孵育4h后， 终止培 养； 小心吸弃96孔板孔内上清液， 每孔加入100 LDSMO， 振荡10min， 于570nm波长处在酶 标仪上测定各孔光吸收值 （OD值） ， 计算细胞成活率 （%） = （用药组平均OD值/空白对照组平均 OD值） 100%。 用GraphPadPrism软件进行数据处理并计算半数抑制浓度IC50值， 结果如图 说明书 3/4 页 5 CN 105859777 A 5 2所示。 0016 应用实施例2 芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯对肝癌细胞HepG2增殖抑制实验 将对数期的HepG2细胞， 。
21、用胰酶消化后， 细胞计数， 配成5104-1105/ml的细胞浓度， 将制得的细胞悬液， 每孔100 L接种到96孔板， 放于37、 5%CO2培养箱中培养24h， 弃掉旧 的培养基， 加入配制好的不同浓度芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯药物， 分别作用24h后， 吸弃含药培养基， 于每孔中加入加入0.5mg/mlMTT的溶液100 L， 继续孵育4h后， 终止培 养； 小心吸弃96孔板孔内上清液， 每孔加入100 LDSMO， 振荡10min， 于570nm波长处在酶 标仪上测定各孔光吸收值 （OD值） ， 计算细胞成活率 （%） = （用药组平均OD值/空白对照组平均 OD值） 100%。 用G。
22、raphPadPrism软件进行数据处理并计算半数抑制浓度IC50值。 结果如图 3所示。 0017 表1二氯乙酸和芦荟大黄素及其衍生物等对肺癌细胞A549和肝癌细胞HepG2的 IC50值 （ M)。 0018 上述实验结果表明， 芦荟大黄素季磷盐二氯乙酸酯因为水解后可以产生芦荟大 黄素季磷盐和糖酵解抑制剂二氯乙酸， 能够同时破坏癌细胞的线粒体供能和糖酵解供能， 对多种肿瘤细胞如白血病细胞HL60、 肺癌细胞A549和肝癌细胞HepG2等显示了很好的抗癌 活性。 这个结果表明将二氯乙酸与芦荟大黄素季磷盐进行共价结合是良好的抗癌药物设计 思路。 0019 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰， 皆应属本发明的涵盖范围。 说明书 4/4 页 6 CN 105859777 A 6 图1 图2 说明书附图 1/2 页 7 CN 105859777 A 7 图3 说明书附图 2/2 页 8 CN 105859777 A 8 。