技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种环介导恒温扩增法检测油 菜菌核病菌的引物及方法。
背景技术
油菜菌核病是油菜生产上最重要的病害。病原菌油菜菌核病菌 （Sceloritinia sclerotiorum）在油菜花期开始侵染幼嫩的油菜花，随着带菌 花瓣掉落到叶片上，茎杆上，病菌开始蔓延，侵染整株植物。在病害流行 的年度，能够引起15%-20%的经济损失。
公开号为CN101434997A的中国专利文献公开了一种油菜菌核病早 期快速分子检测方法，包括：采集凋谢的油菜花瓣，提取油菜花瓣总DNA， 巢式PCR，PCR扩增产物分析，琼脂糖凝胶电泳和结果判定。虽然巢式 PCR的敏感性较高，但是容易发生非特异性扩增，导致结果出现假阳性。 另外，同常规的PCR一样，巢式PCR也需经过多轮的变性、退火、延伸 等过程，温度和时间等反应条件苛刻。
环介导恒温核酸扩增技术（loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP）是一种新的分子生物学方法，它在等温条件下实现核酸扩 增。LAMP技术的反应原理是，根据序列保守区域设计的一对外引物、一 对内引物和一对环引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，在Bst大片 段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内大量合 成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。在PCR 反应体系中加入一种金属离子指示剂羟基萘酚蓝（HNB），根据反应液中 镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性时为紫色，阳性时为天蓝色。由 于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域,所以反应特异性很强。 更重要的是，整个扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定 热源的设备就能满足反应要求，大大降低了检测的成本。
目前LAMP技术在卫生安全检测、疾病诊断以及环境安全监测等方 面都有很好的应用。但是在植物病原真菌检测方面，LAMP技术应用的还 很少，并未发现有LAMP法检测油菜菌核病菌的报道。
发明内容
本发明提供了一种环介导恒温扩增法检测油菜菌核病菌的引物，该引 物的特异性高，利用该引物能快速且准确地检测油菜菌核病菌。
一种环介导恒温扩增法检测油菜菌核病菌的引物，包括一组内引物和 一组外引物，所述外引物的正向引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示， 所述外引物的反向引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；所述内引物的 正向引物的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，所述内引物的反向引物的碱 基序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种环介导恒温扩增法检测油菜菌核病菌的方法，包 括：
（1）取待检测的油菜的组织，提取DNA；
（2）以所述的DNA为模板，采用所述的引物进行PCR扩增；
（3）观察所述PCR扩增的产物的颜色，或者对所述PCR扩增的产物 进行电泳分析，判断所述的油菜的组织是否感染油菜菌核病菌。
LAMP法在合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁 沉淀产生，通过对PCR扩增的产物的颜色进行判断时，可通过肉眼观察、 浊度仪等检测扩增产物的浑浊度，如果扩增产物出现浑浊，则说明所述油 菜的组织感染了油菜菌核病菌，也可以通过在PCR反应体系中加入金属 离子指示剂如羟基萘酚蓝（HNB），如果扩增产物呈现天蓝色，则说明所 述油菜的组织感染了油菜菌核病菌，如果扩增产物呈现紫色，则说明所述 油菜的组织未感染油菜菌核病菌。
另外，由于LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组成的混合物， 因此，在凝胶上会呈现典型的梯状条带，因此，也可以对扩增产物进行电 泳分析，如果凝胶上出现梯状条带，则说明所述油菜的组织感染了油菜菌 核病菌，反之，则所述油菜的组织未感染油菜菌核病菌。
由于油菜菌核病菌通常最先从油菜的花瓣中侵入，因此，在取油菜的 组织时，取花瓣可较好的反映出该油菜是否感染油菜菌核病菌。
所述提取DNA的方法为：
（1）将所述的组织置于DNA提取缓冲液中进行研磨；
（2）将研磨后的混合液静置一段时间，离心取上清液；
（3）上清液用醇进行沉淀，沉淀物经洗涤后获得所述的DNA。
该DNA提取方法简单快速，不需要传统的DNA的抽提纯化步骤， 且不影响后续检测的准确性。
所述DNA提取缓冲液的组成为：聚乙烯吡咯烷酮，1-2%；Tris-HCl， 200mM；EDTA，50mM；NaCl，200mM；SDS，1%。采用该DNA提取 缓冲液提取得到的DNA能够满足环介导恒温扩增法的质量要求。
提取DNA时，可采用乙醇或者异丙醇对所述的上清液进行沉淀。
所述PCR扩增的反应体系为：Tris-HCl，20mmol/L；KCl，10mmol/L； （NH4）2SO4，10mmol/L；Triton X-100，0.1%；甜菜碱，0.8mol/L；MgSO4， 6mmol/L；dNTP，1.4mmol/L；Bst DNA聚合酶，8U；内引物的正向引 物和反向引物各0.8μmol/L，外引物的正向引物和反向引物各0.2μmol/L； 羟基萘酚蓝，120μM；DNA模板，1μ（约为5ng）。
所述PCR扩增的反应温度为65℃，反应时间为1h。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
引物是影响LAMP法检测准确性的关键因素，根据已报道的文献 （Journal of Phytopathology,2009,157:465-69），油菜菌核病菌中的1443bp 的DNA片段（SS1G_02103）仅与灰霉中的DNA片段（BC1G_09351）有 85%的同源性，而与其它真菌基因组同源性都较低（≤67%）。因此，本发 明选取SS1G_02103中250-700bp间油菜菌核病菌特异性的序列，在软件 PrimerExplorer V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）的辅助 下设计2组油菜菌核病菌的特异性的LAMP引物。试验发现，该两组引物 的特异性好，能够特异性的鉴别油菜菌核病菌。
本发明成功建立了油菜菌核病菌的LAMP检测方法，可更特异，更快 速和更便利地检测油菜菌核病菌。
附图说明
图1为本发明引物设计的原理图。
图2为实施例1LAMP引物特异性扩增后羟基萘酚蓝检测图。
图3为实施例1LAMP引物特异性扩增后的凝胶电泳图。
图4为实施例2LAMP引物检测不同地区油菜花的带菌情况结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进一步阐释本发明。
实施例1
所选用的菌株
灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、核果褐腐病菌（Monilinia fructicola）、 瓜果腐霉病菌（Pythium aphanidermatum）、油菜立枯病菌（Rhizoctonia solani）、油菜白斑病菌（Pseudocercosporella capsella）、禾谷镰刀菌（F. graminearum）、指状青霉菌（Penicillium digitatum）以及油菜菌核病菌（3 个菌株Ss1、Ss6和Ss8）。
上述菌株均为常见的植物病原真菌，保藏于浙江大学生物技术研究 所，也可以通过常规的细菌分离纯化方法得到。
提取DNA
用接种针从PDA平板上刮取菌丝（100mg），置于1.5-mL Eppendorf 管中，加500μL DNA提取裂解液（200mM Tris-HCl，50mM EDTA，20mM NaCl，1%SDS,pH8.0），用电钻驱动玻棒充分研磨，振荡混匀，室温静置 10min；13200r/min4℃，离心5min；取上清液约400μL于新的1.5-mL Eppendorf管中，加750μL无水乙醇，混和混匀，13200r/min4℃，离心5 min，弃上清；沉淀用70%乙醇洗涤，室温放置干燥5-10min，溶于30μL 无菌水中，-20℃保存备用。
上述的7种真菌以及待检测的油菜菌核病菌的DNA均采用上述方法 提取。
引物合成
利用油菜菌核病菌SS1G_02103基因中特异的450bp的序列，通过软 件得到了两组LAMP引物，一组外引物Ss-F3和Ss-B3，一组内引物Ss-FIP 和Ss-BIP。两组引物特异性识别靶序列上的6个独立区域（图1中方框 所示），引物序列从5’到3’，Ss-F3=F3，Ss-B3=B3（与B3c互补）， Ss-FIP=F1c（与F1互补）+F2，Ss-BIP=B1c+B2（与B2c互补）。
上述引物的具体序列以及与序列表中序列对应关系如下表所示：
上述序列可以通过常规方法合成，也可以委托专业生物试剂公司合 成，本发明的引物由上海生工合成。
引物特异性验证
以上述提取的8种真菌的DNA为模板，用Ss-F3/Ss-B3和 Ss-FIP/Ss-BIP两组引物进行PCR反应，每次反应均包含一个阴性对照（用 无菌水代替DNA模板）。
LAMP反应体系：25μL反应混合物各组分的浓度为:20mmol/L Tris-HCl（pH8.8），10mmol/L KCl，10mmol/L（NH4）2SO4，0.1%Triton X-100，0.8mol/L甜菜碱，6mmol/L MgSO4，1.4mmol/L dNTP，8U Bst DNA聚合酶，Ss-FIP和Ss-BIP各0.8μmol/L，Ss-F3和Ss-B3各0.2μmol/L， 120μM羟基萘酚蓝（HNB），1μDNA模板（约0.5ng）。
LAMP反应条件：65℃，1h。
如图2所示，3个油菜菌核病菌（Ss1，Ss6和Ss8）PCR反应结束后，PCR 管中呈现天蓝色，而其它病原真菌的PCR管中呈现紫色。
PCR结束后，通过常规的凝胶电泳，也可证明以上的判断。如图3所 示，3个油菜菌核菌株PCR得到不同大小的扩增片段，而其它真菌都没有 扩增到任何条带。说明本发明的引物能够特异性的鉴别油菜菌核病菌。
实施例2检测不同地区油菜花的带菌情况
从浙江省杭州、临安和平湖市的油菜地中收集油菜花瓣（每块地约100 mg）。将油菜花瓣置于1.5-mL Eppendorf管中，加入100μl DNA提取缓冲 液（1-2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP），200mM Tris-HCl，50mM EDTA，200 mM NaCl，1%SDS和ddH2O，pH8.0），用尖头玻棒安装在常用的电工手 电转上研磨1min，再向离心管中加入400μl的DNA提取缓冲液蜗旋混 匀后，室温静置10min；将上述混合液4℃，15,000rpm条件下离心5min， 再将上清液转移到另一离心管中，然后加入750μl无水乙醇，混匀后4℃， 15,000rpm条件下离心2min，弃上清；将沉淀的DNA用70%乙醇洗涤， 室温干燥后溶于50μl无菌水，即为提取的DNA；将上述的DNA溶液用 UNIQ-10柱式PCR产物回收试剂盒（上海生工生产）过柱纯化。
用Ss-F3/Ss-B3和Ss-FIP/Ss-BIP两组引物对上述田间样品提取的DNA 进行PCR扩增，反应设阴性对照，PCR反应体系同上（实施例1）所述。 如图4所示，浙江省临安油菜花瓣DNA经PCR扩增后呈现天蓝色，说明 该地方的油菜花瓣携带了油菜菌核病菌。浙江杭州和平湖油菜花瓣DNA 经PCR扩增后呈现紫色，说明这两个地方的油菜花瓣未携带油菜菌核病 菌。