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1、(10)申请公布号 CN 102618487 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102618487 A *CN102618487A* (21)申请号 201210027052.9 (22)申请日 2012.02.07 C12N 5/071(2010.01) (71)申请人 辽宁省农业科学院大连生物技术研 究所 地址 116024 辽宁省大连市高新园区世达街 2 号 (72)发明人 王林美 李树英 岳冬梅 范琦 (74)专利代理机构 大连东方专利代理有限责任 公司 21212 代理人 贾汉生 (54) 发明名称 一种柞蚕卵巢细胞培养基及其应用 (57) 摘要 本发明公开一种柞蚕。
2、卵巢细胞培养基的 组成成分、 配制方法及其在柞蚕卵巢细胞培养 中的应用。将配制好的氨基酸和糖混合贮藏 液 (MLM-AAS)、 无机盐贮藏液 (MLM-Salt)、 维生 素贮藏液 (MLM-Vit) 和牛血清白蛋白、 胎球蛋 白等按一定比例配制， 并调 pH 为 6.2-6.4， 制 得 MLM-45 培养基， 用于柞蚕卵巢细胞培养前， 按 20体积比加入胎牛血清和 1体积比的青链霉 素混合液。通过多种实验确定该细胞体外生长 条件为培养温度 26-28， pH6.2 6.4 ； 渗透压 315-350mOsm/kg。 本发明为进行柞蚕生物学、 柞蚕 病原微生物及相关领域研究提供技术服务。 (。
3、51)Int.Cl. 权利要求书 4 页 说明书 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 4 页 说明书 9 页 1/4 页 2 1. 一种柞蚕卵巢细胞培养基 MLM-45， 每配制 1000mL， 其具体组成成分及用量如下 ： 分别称取上述组分， 加蒸馏水至 1000mL， 调 pH6.2-6.4， 过滤除菌， 4保存 ； 其中 ： (a) 每配制 1000mL 的 5 倍浓缩的 MLM-AAS， 其具体组成成分及用量如下 ： 权 利 要 求 书 CN 102618487 A 2 2/4 页 3 分别称取上述组分， 加蒸馏水至 1000mL， 过滤除菌。
4、， -20保存 ； (b) 每配制 1000mL 的 10 倍浓缩的 MLM-Salt， 其具体组成成分及用量如下 ： 权 利 要 求 书 CN 102618487 A 3 3/4 页 4 分别称取上述组分， 加蒸馏水至 1000mL， 过滤除菌， 4保存 ； (c) 每配制 100mL 的 1000 倍浓缩的 MLM-Vit， 其具体组成成分及用量如下 ： 分别称取上述组分， 加蒸馏水至 100mL， 过滤除菌， -20保存。 2. 根据权利要求 1 所述的 MLM-45 培养基， 其特征在于 ： 用 10mol/L KOH 调整 pH。 3. 根据权利要求 1 所述的 MLM-45 培养基。
5、， 其特征在于 ： 用 0.22m 或 0.45m 的微孔 滤膜过滤除菌。 4. 如权利要求 1、 2 或 3 中任一项所述的 MLM-45 培养基在培养细胞中的应用。 5. 根据权利要求 4 所述的应用， 其特征在于 ： 培养柞蚕卵巢细胞的条件为 ： 使用前， 向MLM-45培养基中， 按20的体积比加入胎牛血清， 按1的体积比加入青链 霉素混合液 ； 青链霉素混合液中青霉素、 链霉素的浓度均为 10,000 单位 /mL ； 细胞培养温度为 26 28 ； 细胞培养 pH 为 6.2 6.4 ； 细胞培养渗透压值为 315-350mOsm/kg。 6. 根据权利要求 5 所述的应用， 其特。
6、征在于 ： 培养柞蚕卵巢细胞的条件为 ： 权 利 要 求 书 CN 102618487 A 4 4/4 页 5 细胞培养温度为 27 ； 细胞培养 pH 为 6.3 ； 细胞培养渗透压值为 325mOsm/kg。 权 利 要 求 书 CN 102618487 A 5 1/9 页 6 一种柞蚕卵巢细胞培养基及其应用 技术领域 0001 本发明涉及昆虫解剖学、 昆虫组织培养学等领域， 具体涉及一种柞蚕卵巢细胞培 养基、 及其在柞蚕卵巢细胞体外培养技术中的应用。 背景技术 0002 昆虫细胞培养是从昆虫体内取出细胞， 模拟昆虫体内的生理环境， 在无菌、 适温和 丰富的营养条件下， 使细胞生存、 生长。
7、并维持结构和功能的一门技术。原代细胞因刚从组 织中分离开， 生物学特性未发生很大变化， 仍保留原来的遗传特性， 也最接近和反映体内生 长特性， 适宜用于药物敏感性试验、 细胞分化等实验研究。20 世纪初， 许多昆虫学家尝试 过使用体外培养的昆虫细胞作为科学研究的工具。最早进行昆虫组织体外培养的是德国 Richard Goldschmiedt(1915)， 他使用惜比古天蚕 (Hyalophora cecropia) 蛾的精子进行 体外培养， 用来观察精子的发育 (Goldschmidt and Kaiser， 1915)。在 20 世纪 30 年代， 美 国 Trager 进行了家蚕 (Bom。
8、byx mori) 细胞原代培养， 首次研究了昆虫细胞体外生长条件， 家蚕细胞在培养基中的体外生存可维持 3 周。50 年代， 加拿大 Wyatt 改进了家蚕卵巢细胞 培养条件， 成功设计了昆虫细胞培养基 IPL-16。60 年代， Grace 等进一步改良了昆虫细胞 培养基， 至今已广泛用于昆虫细胞系的培养与研究。 0003 随着细胞生物学和分子生物学的相互渗透， 分子生物学实验技术与细胞培养技术 的结合， 使细胞在阐明基因的结构与功能、 基因在细胞生长和分化中的作用等方面发挥了 重要的作用。 同时， 昆虫细胞培养和分子生物学的应用对于了解昆虫的生理和发育机制， 昆 虫与真菌、 微孢子虫、 。
9、细菌和病毒在细胞和分子水平的相互作用方面也起了重要作用。 2002 年钱永华等利用家蚕细胞研究家蚕微孢子虫的形成、 生活史和侵染家蚕的过程等。2004 年 肖仕全利用家蚕胚胎细胞系对家蚕类浓核病毒毒理进行了研究， 早在 1995 年邓宁等利用 昆虫细胞大规模培养进行杆状病毒杀虫剂的生产。 由此可见， 建立昆虫细胞培养方法， 对了 解昆虫与微孢子虫、 细菌和病毒等相互作用关系的一些理论问题提供了技术手段 ； 同时也 为生物防治工厂化生产昆虫病毒制剂开辟了新途径。 0004 柞蚕 (Antheraea pernyi) 是我国重要的经济昆虫， 辽宁是我国的主产区， 每年产 量 5 万吨左右。由于柞蚕。
10、以蛹滞育越冬， 可长期保存。柞蚕丝除了可以织绸外， 还可广泛 用于军工、 化工、 医药等方面 ； 柞蚕蛹含有大量蛋白质和氨基酸， 营养丰富， 也是深受人们喜 爱的昆虫食品 ； 另外， 由于柞蚕蛹、 蛾、 卵、 幼虫等四个不同变态阶段中含有多种生物活性物 质， 近年 来又成为保健品、 生物药品等的重要原料 ； 柞蚕蛹或细胞又是近年发展起来的基 因工程中得重要的生物反应器， 因此， 人们对柞蚕的需求越来越多， 其经济价值和社会效益 也在不断提高。但由于柞蚕放养在野外， 经受着各种病毒、 细菌、 微孢子虫等病原微生物的 侵袭， 时有病害的发生， 导致部分蚕农减产甚至绝收， 影响了蚕农放养柞蚕的积极性。
11、， 严重 地阻碍了柞蚕生产的发展， 而柞蚕细胞又是研究这些病害发病机理及病原侵染规律必要的 工具与平台， 因此， 开展柞蚕细胞培养方法研究， 建立柞蚕卵巢细胞培养方法对发展柞蚕生 产及相关研究具有重要意义。 说 明 书 CN 102618487 A 6 2/9 页 7 发明内容 0005 为了发展柞蚕生产及相关研究， 本实验室已对柞蚕蛹、 幼虫的卵巢细胞进行了大 量的离体培养试验， 与此同时， 研发了比较适合该细胞体外生长的培养基配方、 培养条件和 培养方法。本发明涉及的柞蚕卵巢细胞培养基的配制方法是， 将配制好的氨基酸和糖混合 贮藏液 (MLM-AAS)、 无机盐贮藏液 (MLM-Salt)。
12、、 维生素贮藏液 (MLM-Vit) 和牛血清白蛋白、 胎球蛋白等按一定比例混合， 并调 pH 制得 MLM-45 培养基， 用于柞蚕卵巢细胞培养前， 加入 胎牛血清和青链霉素混合液。通过多种实验确定该细胞体外生长条件为培养温度， pH 值及 渗透压值， 本发明为进行柞蚕生物学、 柞蚕病原微生物及相关领域研究提供技术服务。 0006 本发明的具体技术方案如下 ： 0007 本发明的一方面在于 ： 提供一种柞蚕卵巢细胞培养基 MLM-45 的组成成分， 每配制 1000mL， 其具体组成成分及用量如下 ： 0008 0009 分别称取上述组分， 加蒸馏水至 1000mL， 调 pH6.2-6.4。
13、， 过滤除菌， 4保存 ； 0010 其中 ： 0011 (a) 每配制 1000mL 的 5 倍浓缩的氨基酸和糖混合贮藏液， 其具体组成成分及用量 如下 ： 0012 0013 说 明 书 CN 102618487 A 7 3/9 页 8 0014 分别称取上述组分， 加蒸馏水至 1000mL， 过滤除菌， -20保存 ； 0015 (b) 每配制 1000mL 的 10 倍浓缩的 MLM-Salt， 其具体组成成分及用量如下 ： 0016 说 明 书 CN 102618487 A 8 4/9 页 9 0017 0018 分别称取上述组分， 加蒸馏水至 1000mL， 过滤除菌， 4保存 ；。
14、 0019 (c) 每配制 100mL 的 1000 倍浓缩的 MLM-Vit， 其具体组成成分及用量如下 ： 0020 0021 分别称取上述组分， 加蒸馏水至 100mL， 过滤除菌， -20保存。 0022 具体的， 上述的 MLM-45 培养基在调节 pH 的时候， 使用 10mol/LKOH。 0023 具体的， 上述的 MLM-45 培养基在过滤除菌的时候， 使用 0.22m 或 0.45m 的微 孔滤膜。 0024 本发明的另外一方面在于 ： 上述 MLM-45 培养基在培养细胞中的应用。 0025 对于上述 MLM-45 培养基在培养细胞中的应用， 具体的， 应用于培养柞蚕卵巢。
15、细胞 的条件为 ： 0026 使用前， 向 MLM-45 培养基中， 按 20的体积比加入胎牛血清， 按 1的体积比加 入青链霉素混合液 ； 所使用的青链霉素混合液中， 青霉素、 链霉素的浓度均为 10,000 单位 / mL ； 说 明 书 CN 102618487 A 9 5/9 页 10 0027 细胞培养温度为 26 28 ； 0028 细胞培养 pH 为 6.2 6.4 ； 0029 细胞培养渗透压值为 315-350mOsm/kg。 0030 除上述涉及的细胞培养温度、 pH 及渗透压值之外， 活细胞离体培养的操作方法、 细 胞培养基的配制、 使用及培养条件控制方法， 细胞的换液传。
16、代， 细胞形态的观察与检测等实 验方法均按照本领域技术人员的常规操作执行， 其具体实施方式见实施例所述。 0031 对于使用上述 MLM-45 培养基培养柞蚕卵巢细胞的实验中， 最佳的培养条件为 ： 0032 细胞培养温度为 27 ； 0033 细胞培养 pH 为 6.3 ； 0034 细胞培养渗透压值为 325mOsm/kg。 0035 有益效果 ： 0036 本发明首次进行柞蚕卵巢细胞的离体培养， 发明了该细胞的最佳培养基配方、 培 养条件 ( 温度、 pH 和渗透压值 )、 培养方法等。该方法操作方便， 安全无污染， 细胞生长营 养成分全面， 适用于柞蚕细胞培养。为利用该细胞进行柞蚕及相。
17、关领域研究提供了技术平 台。 具体实施方式 0037 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明， 但不以 任何方式限制本发明。 0038 本发明通过下述技术方案实现 ： 柞蚕卵巢细胞离体培养方法 ； 细胞体外培养基配 方组成及配制方法 ； 细胞体外培养条件 ； 细胞培养监控与调整。其中， 实施例所涉及的试剂 来源如下 ： 0039 MM、 TC-100、 GRACE、 TNM-FH、 SF-900、 IPL-41 等 培 养 基 均 购 自 Gibico 公 司， MGM-443、 MGM-448、 MLM-45 等培养基配方中所有组分及牛血清白蛋白 (Albumin) 。
18、均购 自 Sigma 公司， 试验用胎牛血清 (Fetal calf serum) 购自美国 Hyclone 公司， 胎球蛋白 (Fetuin) 购自日本 Nacalai Tesoue Inc， 青链霉素混合液 ( 青霉素、 链霉素各 10,000 单位 /mL) 购自北京索莱宝科技有限公司。 0040 实施例 1 柞蚕卵巢细胞培养基 MLM-45 配方组成及配制方法 0041 培养基配方组成及培养液的配制。培养基由氨基酸、 糖、 无机盐、 维生素和促细胞 生长添加剂组成。 0042 表 1. 配制 5 倍 1000mL 氨基酸和糖混合贮藏液 (5， MLM-AAS)， 其组成成分及用 量 ：。
19、 0043 5 倍 MLM-AAS 成分 用量 (g) L-Cystine(L- 胱氨酸 ) 0.28 L-Tyrosine(L- 酪氨酸 ) 0.425 -Alanine(- 丙氨酸 ) 1.55 -Alanine(- 丙氨酸 ) 1.05 L-Arginine-HCl(L- 精氨酸 ) 3.45 L-Aspartic acid(L- 天冬氨酸 ) 3.75 L-Asparagine(L 天冬酰胺 )- 3.75 说 明 书 CN 102618487 A 10 6/9 页 11 0044 L-Glutamic acid(L- 谷氨酸 ) 4.5 L-Glutamine(L- 谷氨酰胺 ) 4。
20、.5 L-Glycine(L- 甘氨酸 ) 2.3 L-Histidine(L- 组氨酸 ) 4.25 L-Isoleucine(L- 异亮氨酸 ) 2.6 L-Leucine(L- 亮氨酸 ) 0.405 L-Lysine-HCl(L- 赖氨酸 ) 3.25 L-Methionine(L- 蛋氨酸 ) 2.25 L-Phenylalanine(L- 苯丙氨酸 ) 3.4 L-Proline(L- 脯氨酸 ) 1.95 DL-Serine(DL- 丝氨酸 ) 2.65 L-Threonine(L- 苏氨酸 0 0.8 L-Tryptophan( 色氨酸 ) 0.425 L-Valine(L- 。
21、缬氨酸 ) 2.5 Glucose( 葡萄糖 ) 12.5 Fructose( 果糖 ) 2.5 Sucrose( 蔗糖 ) 87.5 0045 上述组分加蒸馏水至 1000mL， 0.45m 微孔滤膜过滤除菌， -20保存。 0046 表 2. 配制 10 倍 1000mL 无机盐贮藏液 (10， MLM-Salt) 其组成成分及用量 0047 10 倍 MLM-Salt 成分 用量 (g) NaHCO3 3.5 MgSO4.7H2O 13.58 NaH2PO4.2H2O 8.78 KCl 33.7 MgCl2.6H20 19.68 CaCl2 10.97 0048 上述组分加蒸馏水至 10。
22、00mL， 0.45m 微孔滤膜过滤除菌， 4保存。 0049 表 3. 配制 1000 倍 100mL 维生素贮藏液 (1000， MLM-Vit)， 其组成成分及用量 0050 0051 1000 倍 MLM-Vit 成分 用量 (g) Folic acid( 叶酸 ) 0.16 Biotin( 生物素 ) 0.08 Riboflavin( 核黄素 ) 0.16 Thiamine-HCl( 硫胺素 ) 0.2 Ca-Pantothenate( 泛酸钙 ) 0.02 Pyridoxine-HCl( 吡哆醇 ) 0.02 P-Aminobenzoic acid( 对氨基苯甲酸 ) 0.16 N。
23、icotinic acid( 尼克酸 ) 0.02 Myo-Inositol( 肌醇 ) 0.02 Choline chloride( 氯化胆碱 ) 1.6 0052 上述组分加蒸馏水至 100mL， 0.45m 微孔滤膜过滤除菌， -20保存。 0053 表 4. 配制 1000mL MLM-45 培养基， 其组成成分及用量 0054 MLM-45 成分 用量 5 倍 MLM-AAS 200mL 10 倍 MLM-Salt 100mL 说 明 书 CN 102618487 A 11 7/9 页 12 1000 倍 MLM-Vit 1mL 牛血清白蛋白 (Albumin) 5.0g 胎球蛋白 。
24、(Fetuin) 0.02g 0055 上述成分加蒸馏水至1000mL， 用10mol/L KOH和lmol/LHCL调pH6.2-6.4， 0.22m 微孔滤膜过滤除菌， 4保存。 0056 实施例 2 柞蚕卵巢细胞离体培养方法 0057 青六号柞蚕品种 (5 龄幼虫和蛹 ) 材料由辽宁省蚕业科学研究所提供。 0058 1、 柞蚕卵巢细胞的获取 ： 0059 (a) 柞蚕蛹卵巢细胞的获取 ： 取健康柞蚕蛹， 用 75乙醇进行体表消毒 20min， 于超净工作台内用无菌蒸馏水洗涤 3 次， 无菌纱布吸干体表水分， 用大头针固定在用紫外 灭菌 2h 的解剖蜡盘中。无菌操作剪开腹部， 用眼科剪刀和。
25、镊子解剖取出卵巢组织于无菌 的 Corlson 缓冲液 (1000mlCorlson 液配方 ： NaCl 7g、 KCl 0.2g、 CaCL2 0.2g、 MgCl2.6H2O 0.1g、 NaH2PO4 0.2g、 NaHCO3 0.05g、 葡萄糖 8g) 的小平皿中， 剔除卵巢上粘连的脂肪组织和 被膜等， 再将卵巢转移至盛有无菌的 Corlson 缓冲液小烧杯中， 洗涤 3 次。 0060 采用机械法将卵巢组织剪碎成 0.5 1mm3大小的组织块， 加细胞培养液， 用灭菌 吸管温和抽吸后， 直接将悬液连同组织块一起接种 25mL 细胞培养瓶 ( 底面积为 17.5cm2) 中， 将小。
26、块 均匀涂布于瓶壁， 一般在培养瓶可接种2030个卵巢为宜， 然后于瓶内加入适 量培养基盖好瓶塞。 0061 (b)柞蚕5龄幼虫卵巢细胞的获取 ： 取健康柞蚕5龄幼虫， 体表消毒前， 需要把5龄 幼虫饥饿 24h， 其余步骤与柞蚕蛹卵巢细胞的获取方法相同。 0062 2、 柞蚕卵巢细胞培养条件 ： 0063 该细胞体外培养用 MLM-45 培养液按培养液的 20的体积比添加胎牛血清， 再按 培养液的 1的体积比添加青链霉素混合液， 用 10mol/L KOH 调节 pH 至 6.2 6.4， 控制 渗透压值为 315 350mOsm/kg， 置 26 28生化培养箱中静止培养。开始时培养基不宜。
27、 多， 以保持组织块湿润即可， 培养 24 小时后再补液， 培养初期移动和观察时要轻拿轻放， 前 几天尽量不去搬动， 以利贴壁和生长， 每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化， 根据生长变 化监控培养温度、 培养液 pH、 培养液渗透压变化， 每隔 7 天更换一半培养液。一方面补充营 养， 一方面有去除代谢产物的作用。 0064 实施例 3 柞蚕卵巢细胞体外培养条件 0065 利用目前已有的商品昆虫培养基 (MM、 TC-100、 MGM-443、 GRACE、 IPL-41、 MGM-448、 TNM-FH、 SF-900) 和实施例 1 所制得的 MLM-45 培养基进行细胞生长试验。 006。
28、6 选用上述不同昆虫培养基， 在相同培养条件下培养柞蚕蛹及幼虫卵巢细胞 2 个月 后， 于相差倒置显微镜下观察发现 MLM-45 培养基细胞生长情况好于其他几种， 通过 Trypan Blue染色计数细胞存活情况(见表5)。 利用MLM-45培养基进行不同温度(4、 15、 20、 26、 27、 28、 30、 37 ) 条件下细胞生长试验， 以确定细胞最适生长温度 ( 表 6)。利 用MLM-45培养基进行了不同pH(pH5.5、 6.0、 6.2、 6.3、 6.4、 6.5、 7.0)对细胞生长影响试验， 确定最适细胞生长 pH( 表 7)。利用 MLM-45 培养基进行细胞培养液不同。
29、渗透压 (285mOsm/ kg、 295mOsm/kg、 315mOsm/kg、 325mOsm/kg、 345mOsm/kg、 365mOsm/kg、 380mOsm/kg) 试 验， 以 确定该细胞生长最适渗透压 ( 表 8)。 0067 表 5 不同培养基卵巢细胞存活情况 说 明 书 CN 102618487 A 12 8/9 页 13 0068 0069 0070 * 细胞分裂， 数量倍增 0071 表 5 不同昆虫培养基对比试验可见 MLM-45 培养基培养柞蚕卵巢细胞明显优于其 他几种培养基， 并且在柞蚕蛹卵巢细胞培养试验中细胞出现了分裂， 数量成倍增长， 表明 MLM-45 培。
30、养基为柞蚕卵巢细胞生长最佳培养基 ； 0072 表 6 MLM-45 不同培养温度卵巢细胞生长情况 0073 温度 ( ) 4 15 20 25 26 27 28 30 37 培养时间 ( 天 ) 7 7 7 7 7 7 7 7 7 幼虫细胞存活率() 3.5 36.7 41.8 76.3 97.8 98.9 95.1 13.0 0 蛹细胞存活率 ( ) 2.8 25.6 40.3 75.5 99.8 100* 96.8 11.5 0 0074 * 细胞分裂， 数量倍增 0075 表 6 选取不同培养温度进行柞蚕卵巢细胞体外生长试验， 表明 26-28均适宜细 胞生长， 最佳培养温度为 27 。
31、； 0076 表 7 MLM-45 不同 pH 卵巢细胞生长情况 0077 pH 5.5 6.0 6.2 6.3 6.4 6.5 7.0 培养时间 ( 天 ) 7 7 7 7 7 7 7 幼虫细胞存活率 ( ) 0 50.2 90.4 98.6 97.5 58.7 0 蛹细胞存活率 ( ) 0 45.6 93.8 100* 96.4 56.5 0 0078 * 细胞分裂， 数量倍增 0079 表 7 进行不同 pH 对柞蚕细胞生长试验， 结果表明适宜柞蚕卵巢细胞生长 pH 为 6.2-6.4， 最佳细胞生长 pH 为 6.3。 0080 表 8 MLM-45 不同渗透压细胞生长情况 0081 。
32、渗透压 (mOsm/kg) 285 295 315 325 345 365 380 培养时间 ( 天 ) 30 30 30 30 30 30 30 幼虫细胞存活率 ( ) 26.4 45.5 86.7 98.8 95.9 54.6 0 说 明 书 CN 102618487 A 13 9/9 页 14 蛹细胞存活率 ( ) 28.5 50.6 85.7 100* 96.7 52.3 0 0082 *细胞分裂， 数量倍增 0083 表 8 为不同渗透压对细胞生长影响， 试验结果表明柞蚕卵巢细胞体外生长适宜渗 透压值范围为 315-350mOsm/kg， 最佳渗透压值 325mOsm/kg。 0084 柞蚕卵巢细胞培养监控与调整 ： 随着培养时间增加， 原培养液营养被消耗， 导致营 养缺乏， 大量活细胞和组织块代谢产物增多， pH 变酸， 不利于细胞生长， 此时细胞还未长成 单层， 未达到饱和密度， 仍需继续培养， 因此， 需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞 继续生长繁殖的需要。其换液方法是按 1 1 更换， 即弃去一半旧液， 加入与原培养液相同 的等量完全培养基。在倒置显微镜下观察细胞生长变化， 做到实时监控细胞生长周围环境 变化， 包括培养温度、 pH、 渗透压等， 出现问题及时调整。 说 明 书 CN 102618487 A 14 。