技术领域
本发明属于分析检测领域，涉及一种用于新城疫病毒class I检测的荧光定量RT-PCR 试剂盒及其应用。
背景技术
新城疫(Newcastle disease,ND)是唯一分布五大洲的O IE A类传染病,我国ND疫情十 分严重,仍然是养鸡业发展最直接的威胁[1]，可对家禽生产造成严重损失[2]。
新城疫病毒(NDV)，是新城疫的病原，属禽副粘病毒1型（AMPV-1），有囊膜，基因组 为单股负链RNA，大小约15kb，编码6种蛋白质，包括RNA聚合酶（L），血凝素-神经氨酸酶 蛋白（HN），融合蛋白（F），基质蛋白（M），磷蛋白（P）和核蛋白（N）。新城疫病毒分离株根 据对鸡致病严重程度可分为三个主要致病型（毒力型）[2]：Lentogenic株是低致病力型，可造 成鸡轻微呼吸道或肠道感染；Mesogenic株是中等致病力型，主要引起呼吸系统疾病； Velogenic株是高致病力型，造成高死亡率，基于病理表现被进一步分为嗜神经或嗜内脏型。 高毒力型NDV属于必须报告的O IE A类传染病，它的发生可导致检疫和贸易禁运。NDV只有 一个血清型,但是分为2类:class I、class I I,绝大多数常见的都是class II,可分成I-IV 10个基因型。class II与class I核酸差异较大。
目前，用鸡胚进行病毒分离，然后用新城疫特异性抗体做血凝抑制试验代表病毒检测的参 考标准[3]。虽然病毒分离是一个敏感和特异性的方法，但由于NDV毒力差异大,低毒和无毒 株普遍存在,加之弱毒疫苗的普遍使用,对分离毒株血凝抑制试验结果必须结合毒力鉴定才 能确诊,一般需要数天才能完成[1]。
将荧光定量RT-PCR应用于新城疫病毒的检测已有报道。Mark G.Wise等「2」建立了RRT-PCR 技术检测鸟类临床标本新城疫病毒。检测采用单管水解探针，引物和探针根据M基因保守区序 列设计，可检测到大约1000拷贝病毒基因组RNA和10EID50病毒。Beate M.Crossley等「7」建立了高通量的检测外来NDV的RRT-PCR方法。L.Mia Kim等「8」建立了新城疫病毒L基因 基础上的RRT-PCR技术，对Mark G.Wise等建立的新城疫病毒M基因RRT–PCR是一个有 力的补充。但目前尚未有有关新城疫病毒NP基因RRT–PCR检测的相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于新城疫病毒class I检测的RT- PCR试剂盒。
本发明的另一目的是提供该试剂盒的应用。
本发明的又一目的是提供一种实时荧光定量检测新城疫病毒class I的方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种用于新城疫病毒class I检测的实时荧光定量RT-PCR试剂盒，包含：上游引物CNPIF： 5′-CCTCAACTTATTACAACCTC-3′（SEQ ID NO.1）,下游引物CNPIR：5′- TACAGATGCCATACCCATTGC-3′（SEQ ID NO.2）,以及TaqMan探针CNPIP：5′- JOE-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-TAMRA-3′（SEQ ID NO.3）。
所述的试剂盒还包含102、103、104、105、106、107、108拷贝/μL的NP基因阳性质粒 作为标准品模板。
所述的NP基因阳性质粒是以pGEM-T载体为出发载体，在其EcoR V位点插入序列如SEQ ID NO.4所示的NP基因所得
所述的试剂盒还包含～TaqMan Universal PCR Master Mix Kit为美国ABI公司产品。
本发明所述的试剂盒在实时荧光定量检测新城疫病毒class I中的应用。
一种实时荧光定量检测新城疫病毒class I的方法，将标准品模板和待测样品DNA模板以及 分别置于各自的反应体系中，并同时置入PCR仪进行扩增，扩增完毕后由PCR仪自动得出检测结 果，其中
进入PCR仪的标准品模板的反应体系为25μl：其中ABI TaqMan Universal PCR Master Mix 加入量为12.5μl,模板加入量为3μl，上游引物和下游引物在体系中的终浓度均为0.5μmol/L, 探针在体系中的终浓度为0.5μmol/L，其余为无菌去离子水；
进入PCR仪的待测样品DNA模板的反应体系为25μl：其中ABI TaqMan Universal PCR Master Mix加入量为12.5μl,模板加入量为3μl，上游引物和下游引物在体系中的终浓度均为0.5μmo l/L,探针在体系中的终浓度为0.5μmol/L，其余为无菌去离子水；
其中所述的上游引物CNPIF：5′-CCTCAACTTATTACAACCTC-3′（SEQ ID NO.1）,下游引 物CNPIR：5′-TACAGATGCCATACCCATTGC-3′（SEQ ID NO.2）,以及TaqMan探针CNPIP：5′- JOE-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-TAMRA-3′（SEQ ID NO.3）；
PCR仪中的反应程序为：95℃预变性10min,然后95℃15s,60℃1min43个循环；荧光 信号的收集及数据的采集定在60℃。检测结束,根据噪音情况设定和调整基线及阈值,并利用 随机软件进行分析,建立标准曲线，根据荧光曲线和Ct值判断结果。
有益效果：
本发明基于NP基因相对比F基因更保守。Class I分离株NP基因之间氨基酸序列的同源 性在93.0%-99.5%之间，Class I毒株与Class II毒株NP蛋白同源性在88.2%-92.5%之间； 选取Class I NP基因保守区设计引物和探针，首次报告建立了一种新的基于NP基因的检测新 城疫病毒class I的RRT–PCR试剂盒以及方法，具有高灵敏度、高特异性、搞重复性的优 点。本发明方法对Mark G.Wise等建立的新城疫病毒M基因RRT–PCR也是一个重要的补充。 这两个方法结合可以快速检测所有class I和class II新城疫病毒并初步分群。随着NDV分 子生物学研究的不断深入,NDV基因序列及功能得到不断的揭示,ND分子生物学检测技术将 得到进一步的补充和完善。
附图说明
图1荧光定量RT-PCR扩增动力学曲线
图中，从左至右依次为稀释度102～108的NP基因克隆阳性质粒的扩增曲线。
图2RRT-PCR标准曲线
具体实施方式
实施例1NP基因阳性质粒的构建
化学合成SEQ ID NO.4所示的NP基因511-1274bp获得目的片段,纯化后TA克隆连接到 pGEM‐T载体(Promega公司产品)上，转化至E.coli DH5α中，小提质粒，经PCR和酶切鉴定， 挑取阳性克隆经测序验证后，抽提纯化质粒DNA，测其核酸浓度，计算出拷贝数，以此作为荧 光定量RT-PCR质粒标准品。SEQ ID NO.4所示的NP基因511-1274bp片段也可通过PCR方式 扩增得到，以新城疫病毒JS‐10‐06株基因组为模板，经RT-PCR扩增得到。
实施例2
根据GenBank上5株class I NDV NP基因序列，结合本实验室分离鉴定测序的8株class I NDV NP基因序列（表1），选取保守区（靠近5′端）设计引物。采用LASERGENE软件包(DNASTAR Inc.,Madison,WI,USA)和Primer Premier5.0软件(Premier Biosoft International,Palo Alto,CA)设计和分析引物，合成NDV的1对特异引物及相应的探针，并在NCBI上进行了 BLAST比对验证。扩增片段位于NDV class I国际标准分离株DE-R49-99NP基因的800-1086bp, 长度为287bp,探针位于NP基因970-990bp，上、下游引物及探针如下所示：
CNPIF：5′-CCTCAACTTATTACAACCTC-3′(SEQ ID NO.1),（800-819bp）
CNPIR：5′-TACAGATGCCATACCCATTGC-3′(SEQ ID NO.2),（1066-1086bp）
Probe：(JOE)5′-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-3′(TAMRA)(SEQ ID NO.3)（970-990bp）;
探针为TaqMan探针,5′端标记的荧光报告基团是JOE,3′端标记的荧光淬灭基团为 TAMRA，探针命名为:CNPIP。引物由上海生工有限公司合成,探针由大连宝生物工程有限公司 合成。
表1本实验所用NDV标准参考分离株及其它禽病毒株
aL,弱毒;M,中等毒力;V,强毒.NA,不可用.
实施例3
标准品模板的稀释用紫外分光光度计分别测定NP基因阳性重组质粒在260和280nm 处的吸光度,并根据公式计算重组质粒的DNA浓度与纯度。将重组质粒进行10倍梯度稀释, 以102、103、104、105、106、107、108拷贝/μL作为标准品模板,利用实施例2设计合成 的引物对以及探针进行实时荧光定量RT-PCR，RRT-PCR反应体系为：12.5μl ABI TaqMan Universal PCR Master Mix,0.5μmol/L（体系中的终浓度）上游引物,0.5μmol/L（体系中的 终浓度）下游引物,0.5μmol/L（体系中的终浓度）探针,模板3μl,加无菌去离子水至反应总 体积25μl；反应程序为95℃预变性10m in,然后95℃15s,60℃1min43个循环。利用随机 软件进行分析,建立标准曲线，系统自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良 好的线性关系(图1和2)。从图1可见,当标准质粒（NP基因阳性重组质粒）浓度 ≥1.0copies/μl时仍可出现典型扩增曲线。从图2可见,在较广的范围内(1.0×102-1.0×108copies/μl)C t值与质粒拷贝数的对数之间呈现很好的线性关系,相关系数R2=0.99。将 其检测限的Ct值通过标准曲线换算成拷贝数约为1copy/μl,相当于1个NDV颗粒。
分子拷贝数(个/mL)=DNA质量浓度/DNA分子量
DNA分子量=DNA碱基数×324.5
DNA质量浓度=260nm吸光度×50μg/mL×稀释倍数×6.02×1023
实施例4
特异性试验
以AIV、EDS76、IBDV、IBV、ILTV、FPV等常见其它禽病病毒及NDV class II核酸（表1） 和健康鸡组织RNA、水为模板,进行荧光定量PCR，反应体系及反应程序同实施例3。结果AIV、 EDS76、IBDV、IBV、ILTV、FPV等常见其它禽病病毒及NDV class II核酸、健康鸡组织RNA、 水显示没有发现有效扩增。而NDV class I光信号明显。
重复性试验
批内重复性试验:分别取等量的3份不同滴度(102、104、106拷贝/μL)的重组质粒进行 荧光定量PCR检测,每份样品做5个重复；批间重复性试验:取以上3份样品,在同一反 应条件下进行5次独立的荧光定量PCR检测。结果，批内变异系数CV为0.43%—0.99%, 批间变异系数为0.95%—1.39%，表明误差都非常小,扩增效率稳定。数据见表2和表3。
表2用荧光定量RT-PCR检测3份不同病毒含量标准品的批内和批间重复检测结果
表3用荧光定量RT-PCR检测3份不同病毒含量标准品的批间重复检测结果
实施例5
用表1中所列毒株接种SPF鸡胚,收集尿囊液进行血凝试验[1](Hemagglutination test, HA)和NDV血凝抑制试验[1](Hemagglutination inhibition test,HI),同时用样品做RRT-PCR 试验，计算2种方法的符合率。RRT-PCR与病毒分离结果见表1,可见2种方法检测33株NDV 符合率为100.0%。
参考文献
[1]殷震，刘景华.动物病毒学，第二版.北京:科学出版社，1997，329‐330。