《灵芝烯酸及其制备方法和用途.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《灵芝烯酸及其制备方法和用途.pdf（18页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610148142.1 (22)申请日 2016.03.16 (71)申请人 广西医科大学 地址 530021 广西壮族自治区南宁市双拥 路22号 (72)发明人 邱莉谢集照焦杨邹录惠 谢婷韦倩 (51)Int.Cl. C07J 9/00(2006.01) A61K 31/575(2006.01) A61P 25/00(2006.01) (54)发明名称 灵芝烯酸及其制备方法和用途 (57)摘要 灵芝烯酸及其制备方法和用途。 本发明属于 医药技术领域， 具体是从天然产物中提。
2、取活性成 分的方法和活性成分用途， 更具体是从弱光泽灵 芝中提取灵芝烯酸的方法和灵芝烯酸的用途。 本 发明的灵芝烯酸制备方法， 其特征在于： 弱光泽 灵芝经过提取、 萃取、 硅胶柱层析、 ODS柱层析、 制 备液相分离得到五个灵芝烯酸， 并进行了这五个 灵芝烯酸抑制LPS诱导BV-2小胶质细胞释放NO的 活性实验。 结果表明， 化合物(1)(5)能较好的 抑制LPS诱导BV-2小胶质细胞释放NO， 且对BV-2 小胶质细胞的存活率无影响， 可能成为先导化合 物。 权利要求书2页 说明书5页 附图10页 CN 105820204 A 2016.08.03 CN 105820204 A 1.如化合。
3、物(1)的灵芝烯酸： 2.灵芝烯酸的制备方法， 其特征在于： 弱光泽灵芝经过提取、 萃取、 硅胶柱层析、 ODS柱 层析、 制备液相分离得到如权利要求1所述化合物(1)和化合物(2)(5)的灵芝烯酸： 3.如权利要求2所述灵芝烯酸的制备方法， 其特征在于： 弱光泽灵芝子实体20kg打成粗 粉， 用10倍重量的85(体积比， 下同)乙醇回流提取3次， 每次2小时； 合并提取液， 减压浓缩 回收乙醇， 得浸膏670克； 将浸膏分散于5升水中， 依次用与水等体积的乙酸乙酯、 正丁醇各 萃取3次， 减压蒸去溶剂后分别得乙酸乙酯层LE(550g)、 正丁醇层LB和水层提取物； 称取2000g的200-3。
4、00目的柱层析硅胶， 装柱， 用550g200-300目的柱层析硅胶将乙酸 乙酯层LE拌样后过柱， 二氯甲烷甲醇(10000100)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点板 后合并， 减压浓缩得到10个流分， 编号LE1LE10， 其中LE6为142.2g； 称取800g的200-300目的柱层析硅胶， 装柱， 用142g200-300目的柱层析硅胶将LE6拌 样后过柱， 二氯甲烷甲醇(10000100)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点板后合并， 减压 浓缩得到7个流分， 编号LE61LE67， 其中LE64为26.7g； 称取150g的200-300目的柱层析硅胶， 装柱， 用27g200-3。
5、00目的柱层析硅胶将LE64拌 样后过柱， 二氯甲烷乙酸乙酯(10101)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点板后合并， 减 压浓缩得到7个流分， 编号LE641LE647， 其中LE646为14.5g； 将LE646过开放ODS柱， 甲醇水(30701000)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点板后 权利要求书 1/2 页 2 CN 105820204 A 2 合并， 减压浓缩得到7个流分， 编号LE6461LE6467， 其中LE6462为6.7g； 将LE6462过开放ODS柱， 甲醇水(40601000)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点板后 合并， 减压浓缩得到4个流分， 编号LE646。
6、21LE64624， 其中LE64622为0.92g； 将LE64622过制备液相， 用乙腈水磷酸33670.1做流动相， 等体积接收流出液， 点 板后合并， 减压浓缩得到4个流分， 编号LE64621LE64624， 其中LE646223为0.48g， 用上述 条件过制备液相， 得到如权利要求1所述化合物(1)10.8mg； LE646224为0.28g， 用上述条件 过制备液相， 得到如权利要求2所述化合物(4)15.7mg； 称取650g的200-300目的柱层析硅胶， 装柱， 用100g200-300目的柱层析硅胶将LE63 (102g)拌样后过柱， 环己烷乙酸乙酯(10111)梯度洗。
7、脱， 等体积接收流出液， 点板后合 并， 减压浓缩得到7个流分， 编号LE631LE637， 其中LE636为25.2g； 将LE636过开放ODS柱， 甲醇水(10901000)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点板后 合并， 减压浓缩得到6个流分， 编号LE6361LE6366， 其中LE6363为7.8g， 将其过开放ODS柱， 甲醇水(40601000)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点板后合并， 减压浓缩得到6个流 分， 编号LE63631LE63636， 其中LE63634为2.6g； 将LE63634过制备液相， 用乙腈水磷酸43570.1做流动相， 得到如权利要求2所述 化合物(。
8、3)24mg； 将LE6364(4.0g)过开放ODS柱， 甲醇水(40601000)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点板后合并， 减压浓缩得到4个流分， 编号LE63641LE63644， 其中LE63643为3.3g， 将其反 复过制备液相， 用乙腈水磷酸42580.1做流动相， 得到如权利要求2所述化合物(2) 5.7mg； 将LE8(40.5g)过HP-20大孔树脂柱， 树脂用量2000g； 乙醇水(1090955)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点板后合并， 减压浓缩得到5个流分， 编号LE81LE5， 其中LE84为 16.2g； 称取80g的200-300目的柱层析硅胶， 装柱，。
9、 用16g200-300目的柱层析硅胶将LE84拌样 后过柱， 二氯甲烷甲醇(15121)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点板后合并， 减压浓缩 得到6个流分， 编号LE841LE846， 其中LE845为4.2g； 将LE845过开放ODS柱， 甲醇水(10901000)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点板后 合并， 减压浓缩得到6个流分， 编号LE8451LE8456， 其中LE8454为1.1g， 将其反复过制备液 相， 用乙腈水磷酸30700.1做流动相， 得到如权利要求2所述化合物(5)7.8mg。 4.灵芝烯酸在制备神经退行性病变药物的用途。 5.如权利要求1所述化合物(1)和如权。
10、利要求2所述化合物(2)(5)的灵芝烯酸在制备 神经退行性病变药物的用途。 6.如权利要求1所述化合物(1)和如权利要求2所述化合物(2)(5)的灵芝烯酸在制备 抑制脂多糖诱导BV-2小胶质细胞释放一氧化氮药物的用途。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105820204 A 3 灵芝烯酸及其制备方法和用途 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域， 具体是从天然产物中提取活性成分的方法和活性成分 用途。 背景技术 0002 神经退行性病变是一类以神经元丧失正常的功能和结构甚至死亡为病理特征的 疾病， 包括帕金森病(PD)、 阿尔茨海默病(AD)， 多发性硬化(MS)等， 这些疾病的发生与发。
11、展 都与神经炎症密切相关。 神经炎症反应介导的神经元退行性病变主要是由胶质细胞的激活 及外周入侵的淋巴细胞释放神经毒性因子所引起的。 小胶质细胞BV-2是神经系统常驻的免 疫细胞。 持续或过度活化的小胶质细胞介导神经炎症， 释放包括白细胞介素1 (IL-1)、 肿 瘤坏死因子 (TNF-)、 一氧化氮(nitricoxide， NO)、 前列腺素及活性氧簇(reactive oxygenspecies， ROS)等在内的炎症介质， 直接或间接损伤神经元， 导致继发性神经损伤。 近年来的研究发现， 抑制小胶质细胞BV-2激活及其介导的炎症反应可显著减少神经毒性物 质释放， 减轻神经功能损伤。 0。
12、003 灵芝是灵芝科真菌的总称， 属于真菌界， 担子菌门， 担子菌纲， 非褶菌目的一类高 等担子菌， 是我国历代医药学家推崇的滋补强壮、 扶正培本的珍贵药品， 久服有轻身延年的 功效。神农本草经 将灵芝列为上品。 关于灵芝化学成分及其生物活性研究， 多年来一直都 是国内外药学领域的研究热点之一。 但绝大部分的研究集中在赤芝GanodermaLucidum这 个品种， 偶有涉及紫芝Ganodermasinense、 松杉灵芝Ganodermatsugae、 薄盖灵芝 Ganodermacapense、 树舌灵芝Ganodermaapplanatum等品种。 0004 弱光泽灵芝Ganoderma。
13、curtisii(Berk.)Murrill在国内河北、 江西、 湖南、 海南、 四川、 云南均发现有分布， 本课题组在前期调研中首次发现其在广西境内有分布， 标本样品 现收于中国科学院微生物研究所国家菌物标本馆。 本课题组前期工作中采用薄层色谱 (TLC)分析比对了弱光泽灵芝与赤芝的化学成分， 发现弱光泽灵芝与赤芝含有相类似的次 生代谢产物， 但二者之间也具有明显的差异， 对其药学及药效学方面的研究目前未见国内 外文献报道。 发明内容 0005 本发明的目的是提供从弱光泽灵芝中提取灵芝烯酸的方法和灵芝烯酸的用途。 0006 本发明解决上述技术问题的技术方案如下： 0007 1.五个灵芝烯酸，。
14、 结构式为： 说明书 1/5 页 4 CN 105820204 A 4 0008 0009 2.灵芝烯酸的制备方法， 其特征在于： 弱光泽灵芝经过提取、 萃取、 硅胶柱层析、 ODS柱层析、 制备液相分离得到五个灵芝烯酸。 0010 3.灵芝烯酸抑制LPS诱导BV-2小胶质细胞释放NO的活性。 0011 本发明的益效如下： 0012 1.进行了弱光泽灵芝的药学研究且得到积极的结果， 纠正了之前人们普遍认为其 效果不佳而不进行研究的技术偏见， 为进一步应用提供理论依据。 0013 2.提供了神经退行性病变的可能先导化合物。 附图说明 0014 图1为化合物(1)的1H-NMR 0015 图2为化。
15、合物(1)的13C-NMR 0016 图3为化合物(2)的1H-NMR 0017 图4为化合物(2)的13C-NMR 0018 图5为化合物(3)的1H-NMR 说明书 2/5 页 5 CN 105820204 A 5 0019 图6为化合物(3)的13C-NMR 0020 图7为化合物(4)的1H-NMR 0021 图8为化合物(4)的13C-NMR 0022 图9为化合物(5)的1H-NMR 0023 图10为化合物(5)的13C-NMR 具体实施方式 0024 下面结合实施例对本发明作进一步描述。 0025 实施例1 0026 化合物提取： 弱光泽灵芝的子实体20kg打成粗粉， 用10倍。
16、重量的85(体积比， 下 同)乙醇回流提取3次， 每次2小时。 合并提取液， 减压浓缩回收乙醇， 得浸膏670克。 将浸膏分 散于5升水中， 依次用与水等体积的乙酸乙酯、 正丁醇各萃取3次， 减压蒸去溶剂后分别得乙 酸乙酯层LE(550g)、 正丁醇层LB和水层提取物。 0027 称取2000g的200-300目的柱层析硅胶， 装柱， 用550g200-300目的柱层析硅胶将 乙酸乙酯层LE拌样后过柱， 二氯甲烷甲醇(10000100)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点板后合并， 减压浓缩得到10个流分， 编号LE1LE10， 其中LE6为142.2g。 0028 称取800g的200-300。
17、目的柱层析硅胶， 装柱， 用142g200-300目的柱层析硅胶将 LE6拌样后过柱， 二氯甲烷甲醇(10000100)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点板后合 并， 减压浓缩得到7个流分， 编号LE61LE67， 其中LE64为26.7g。 0029 称取150g的200-300目的柱层析硅胶， 装柱， 用27g200-300目的柱层析硅胶将 LE64拌样后过柱， 二氯甲烷乙酸乙酯(10101)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点板后合 并， 减压浓缩得到7个流分， 编号LE641LE647， 其中LE646为14.5g。 0030 将LE646过开放ODS柱， 甲醇水(30701000)梯度。
18、洗脱， 等体积接收流出液， 点 板后合并， 减压浓缩得到7个流分， 编号LE6461LE6467， 其中LE6462为6.7g。 0031 将LE6462过开放ODS柱， 甲醇水(40601000)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点 板后合并， 减压浓缩得到4个流分， 编号LE64621LE64624， 其中LE64622为0.92g。 0032 将LE64622过制备液相， 用乙腈水磷酸33670.1做流动相， 等体积接收流出 液， 点板后合并， 减压浓缩得到4个流分， 编号LE64621LE64624， 其中LE646223为0.48g， 用 上述条件过制备液相， 得到化合物(1)10.8。
19、mg。 LE646224为0.28g， 用上述条件过制备液相， 得到化合物(4)15.7mg。 0033 称取650g的200-300目的柱层析硅胶， 装柱， 用100g200-300目的柱层析硅胶将 LE63(102g)拌样后过柱， 环己烷乙酸乙酯(10111)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点板 后合并， 减压浓缩得到7个流分， 编号LE631LE637， 其中LE636为25.2g。 0034 将LE636过开放ODS柱， 甲醇水(10901000)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点 板后合并， 减压浓缩得到6个流分， 编号LE6361LE6366， 其中LE6363为7.8g， 将其过。
20、开放 ODS柱， 甲醇水(40601000)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点板后合并， 减压浓缩得到6 个流分， 编号LE63631LE63636， 其中LE63634为2.6g。 0035 将LE63634过制备液相， 用乙腈水磷酸43570.1做流动相， 得到化合物(3) 24mg。 说明书 3/5 页 6 CN 105820204 A 6 0036 将LE6364(4.0g)过开放ODS柱， 甲醇水(40601000)梯度洗脱， 等体积接收流 出液， 点板后合并， 减压浓缩得到4个流分， 编号LE63641LE63644， 其中LE63643为3.3g， 将 其反复过制备液相， 用乙腈。
21、水磷酸42580.1做流动相， 得到化合物(2)5.7mg。 0037 将LE8(40.5g)过HP-20大孔树脂柱， 树脂用量2000g。 乙醇水(1090955)梯度 洗脱， 等体积接收流出液， 点板后合并， 减压浓缩得到5个流分， 编号LE81LE5， 其中LE84为 16.2g。 0038 称取80g的200-300目的柱层析硅胶， 装柱， 用16g200-300目的柱层析硅胶将LE84 拌样后过柱， 二氯甲烷甲醇(15121)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点板后合并， 减压 浓缩得到6个流分， 编号LE841LE846， 其中LE845为4.2g。 0039 将LE845过开放OD。
22、S柱， 甲醇水(10901000)梯度洗脱， 等体积接收流出液， 点 板后合并， 减压浓缩得到6个流分， 编号LE8451LE8456， 其中LE8454为1.1g， 将其反复过制 备液相， 用乙腈水磷酸30700.1做流动相， 得到化合物(5)7.8mg。 0040 化合物(1)(5)的结构式如下： 0041 0042 通过SciFinder检索， 未发现化合物(1)有相关报道， 说明这是一个新化合物。 说明书 4/5 页 7 CN 105820204 A 7 0043 药理活性实验： 化合物(1)(5)及阳性药槲皮素均用DMSO溶解并稀释至合适浓 度， -20保存备用。 将BV-2小胶质细。
23、胞调整为2105个/mL， 接种于96孔细胞培养板中， 每 孔加入100 L细胞悬浮液， 37、 5CO2隔夜培养后， 各孔按以下分组情况加样： (1)脂多糖 (lipopolysaccharide， LPS)组不加入被测试样品； (2)空白对照组(等体积DMSO)； (3)经LPS 预处理的不同浓度的化合物(1)(5)(加入终浓度为1 g/mL的LPS孵育30min， 再分别加入 浓度为40、 20、 10、 2.5、 1.0、 0.5、 0.1 M的样品)， 每个浓度设3个平行孔。 在37、 5CO2恒温 培养箱中培养24h后， 吸取培养液上清100 L至酶标板中， 加入等体积的Gries。
24、s试剂， 室温反 应15min后测定540nm处的吸光值。 用浓度分别为1、 2、 5、 10、 20、 40、 60、 100 mol/L的NaNO2绘 制标准曲线， 根据NaNO2标准曲线计算细胞培养上清液中NO2-的浓度以及对NO释放的抑制 率， 抑制率计算公式为： 0044 0045 具体实验结果见Table1： 0046 Table1Inhibitoryeffectofcompounds1-5onNOproductionLPS- inducedinBV-2( s， n3) 0047 0048 NOconcentrationofcontrolgroup： 1.020.18 M 0049。
25、 NOconcentrationofLPS-treatedgroup： 10.041.25 M 0050 #Positivecontrol 0051 结果表明， 化合物(1)(5)能较好的抑制LPS诱导BV-2小胶质细胞释放NO。 0052 在上述培养板每孔中加入MTT溶液(终浓度200 g/mL)， 置于37、 5CO2培养箱中 继续培养4h后， 弃去上清， 吸干残留液体， 加入DMSO150 L， 振摇10min使生成的甲瓒结晶充 分溶解后， 以630nm为参比波长在570nm下测定吸光值。 细胞存活率计算公式为： 0053 0054 结果表明， 化合物(1)(5)对BV-2小胶质细胞的存。
26、活率无影响， 可能成为先导化 合物。 说明书 5/5 页 8 CN 105820204 A 8 图1 说明书附图 1/10 页 9 CN 105820204 A 9 图2 说明书附图 2/10 页 10 CN 105820204 A 10 图3 说明书附图 3/10 页 11 CN 105820204 A 11 图4 说明书附图 4/10 页 12 CN 105820204 A 12 图5 说明书附图 5/10 页 13 CN 105820204 A 13 图6 说明书附图 6/10 页 14 CN 105820204 A 14 图7 说明书附图 7/10 页 15 CN 105820204 A 15 图8 说明书附图 8/10 页 16 CN 105820204 A 16 图9 说明书附图 9/10 页 17 CN 105820204 A 17 图10 说明书附图 10/10 页 18 CN 105820204 A 18 。