技术领域
本发明涉及一种无花果叶有效成分提取方法及其条件优化，特别是涉及利用响应面法优 化无花果叶有效成分提取条件的方法。
背景技术
无花果(FicuscaricaL.)为桑科榕属植物，多年生落叶灌木或小乔木，主要生长在亚洲、 美洲、欧洲、非洲等亚热带地区，现在我国各地均有栽培，是一种特殊的果品和天然药物。 无花果叶含有香柠檬内酯、补骨脂素、呋喃香豆素以及黄酮等多种生理活性成分，具有抗菌、 抗氧化、抗癌以及降低血糖等药理学作用，在农用活性方面也有较强的抑菌抗虫作用。
目前，提取无花果叶有效成分的方法主要有水蒸气蒸馏法、超临界CO2流体萃取法等。 由于水蒸气蒸馏法提取率较低，且蒸馏过程易导致无花果叶有效成分的水解变质、氧化等， 对试验结果影响较大；超临界CO2流体萃取法涉及高压系统，对设备要求较高；而采用超声 法提取无花果叶有效成分的研究较少。超声提取过程产生的空化效应可引起溶剂和样品分子 的快速运动，从而加速叶片中有效成分进入溶剂，提高提取效率，缩短提取时间，且可以避 免高温对提取物的影响。
目前现有的无花果叶有效成分提取方法为：无花果叶与水的液料比为：50～70ml/g；提取 温度为100℃，提取时间为4～6小时，水蒸气蒸馏提取，馏出液用乙酸乙酯萃取，回收乙酸 乙酯得到粗提物。
专利号2014101099048的发明《1-环己烷-6,7-二甲氧基-1,4-二氢萘及制备方法和用途》 公开了如下内容：1)、石油醚提取：将无花果叶粉碎后按照1g:4～6ml的料液比加入石油 醚进行超声波提取，过滤，所得滤渣重复上述超声波提取1～3次；合并所有的提取液； 所述超声波提取的工艺参数为：室温，53kHz的频率，提取时间为25～35分钟；2)、 将所得的提取液减压蒸馏，得到粗提取物；3)、将所得的粗提取物用乙酸乙酯溶解后， 采用扩散养晶体的方法，得到白色晶体---1-环己烷-6,7-二甲氧基-1,4-二氢萘。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种无花果叶有效成分提取法，采用本发明的方法能提 高无花果叶有效成分的提取效果，减少了溶剂资源的消耗，还减少了生产过程中污染物的产 生与排放。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种无花果叶有效成分提取法，将无花果叶片与乙 酸乙酯按照18～22ml乙酸乙酯/1g无花果叶片的液料比混合，于室温下浸泡50～70min后，超声 提取1～2次，每次超声提取的时间为50～70min，超声频率为53kHz；得无花果叶有效成分提取 液，回收提取液中的乙酸乙酯，得到无花果叶有效成分粗提物。
备注说明：
1、上述有效成分是指1-环己烷-6,7-二甲氧基-1,4-二氢萘。
2、超声提取时，温度控制在50～60℃。
3、室温一般是指20～25℃。
作为本发明的无花果叶有效成分提取法的改进：所述浸泡时间为59min，超声提取2次， 每次超声时间为66min，乙酸乙酯与无花果叶的液料比为20.4ml/1g。
本发明还同时提供了一种响应面法优化无花果叶有效成分提取工艺的方法，设置以下3 个变量：设置以下3个变量：乙酸乙酯与无花果叶片的液料比、浸泡时间和超声提取时间；以1- 环己烷-6,7-二甲氧基-1,4-二氢萘(2014101099048的《1-环己烷-6,7-二甲氧基-1,4-二氢萘及制 备方法和用途》)为标准物，以提取液在246nm波长下的吸光度作为响应值；利用designexpert 软件根据Box-Behnken设计原则进行优化。
在此工艺条件下，无花果叶有效成分提取液中的特定化合物(1-环己烷-6,7-二甲氧基-1,4- 二氢萘)的吸光度达到0.623。
本发明首先在大量实验的基础上选用了乙酸乙酯作为提取溶剂，并设定了合适的超声频 率，然后对超声提取时间、液料比和浸泡时间三个影响无花果叶有效成分提取的因素进行优 化，得到最佳工艺条件：超声时间为66min，液料比为20.4，浸泡时间为59min时，无花果 叶有效成分提取液的吸光度达到0.623。
说明：上述无花果叶是指：干燥至含水率≤8％(重量含量)，粉碎，过60目筛的植物无 花果(FicuscaricaL.)叶片。
本发明利用超声提取法，且合理有效地优化无花果叶中有效成分的提取工艺，简便可行； 本发明提高了提取效率，降低了能耗，减少了污染物的排放，具有工业化生产的实际意义。
本发明具有如下技术优势：
1、以乙酸乙酯作为溶剂，超声提取无花果叶有效成分的方法步骤简单，提取效率高。
2、以提取液中的新的发明化合物---1-环己烷-6,7-二甲氧基-1,4-二氢萘作为吸光度响应值， 试验结果更为准确可靠。
3、本发明缩短了超声提取时间和浸泡时间，提高了生产效率；降低了液料比，减少了有 机溶剂的消耗，同时也减少了生产过程中污染物的产生与排放。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是提取因素对无花果叶有效成分提取效果影响的响应面和等高线图；
(a)中：
上图为超声时间和液料比对提取液吸光度影响的响应面图，
下图为超声时间和液料比对提取液吸光度影响的等高线图；
(b)中：
上图为超声时间和浸泡时间对提取液吸光度影响的响应面图，
下图为超声时间和浸泡时间对提取液吸光度影响的等高线图；
(c)中：
上图为液料比和浸泡时间对提取液吸光度影响的响应面图，
下图为液料比和浸泡时间对提取液吸光度影响的，等高线图。
图2是1-环己烷-6,7-二甲氧基-1,4-二氢萘分子结构图。
图3是提取溶剂对无花果叶有效成分提取效果的影响图。
图4是超声时间对无花果叶有效成分提取效果的影响图。
图5是浸泡时间对无花果叶有效成分提取效果的影响图。
图6是液料比对无花果叶有效成分提取效果的影响图。
图7是超声温度对无花果叶有效成分提取效果的影响图。
具体实施方式
实验一、响应面法优化无花果叶有效成分提取：
一、样品准备
将无花果叶干燥至含水率≤8％(重量含量)，粉碎，过60目筛，作为样品备用。
用天平称取样品5.00g，置于150ml三角瓶中，加入一定量试剂，浸泡一段时间后，在一 定温度下超声提取一段时间，过滤得到提取液。每个样品重复提取2次，2次的提取液合并， 减压蒸馏得无花果叶粗提物。所得粗提物用无水乙醇溶解，定溶至10ml，再用无水乙醇稀释 400倍，取3ml稀释液放入石英比色皿中，以无水乙醇为空白对照，在波长246nm下测定吸光 度。
二、试验设计与统计分析
1、单因素试验
分别改变提取溶剂、超声提取时间、浸泡时间、液料比、超声温度进行单因素试验，测定 波长246nm下提取液的吸光度。每次处理重复3次。
2、响应面法优化设计
根据单因素试验结果及Box-Behnken中心组合设计原则，选取对无花果叶有效成分提取效 果有显著影响的3个因素：超声时间，液料比，浸泡时间，而对无花果叶有效成分提取效果影 响不显著的提取溶剂和超声温度，统一选取提取效果较好的工艺水平，即选取乙酸乙酯作为 提取溶剂，设定超声温度为50℃。利用DesignExpert9.0.5.1软件进行试验设计，并对试验数 据进行分析。试验因素及水平设计见表1。
表1、响应面分析的因素与水平
以超声时间(A)、液料比(B)和浸泡时间(C)为自变量，以无花果叶有效成分提取 液在波长246nm下的吸光度作为响应值(Y)。试验方案及结果见表2。试验方案中1～12为析 因点，13～15为中心点。
3、模型的建立和统计分析
利用DesignExpert1软件对15个试验点的响应值进行多元回归分析，得到响应变量(超 声时间A，液料比B，浸泡时间C)与响应值(吸光度Y)之间的多元二次回归模型方程：
Y＝0.60+0.056A+0.022B+0.012C+0.011AB－0.027AC－0.029BC－0.049A2－0.084B2－ 0.084C2。
各因子与响应值之间线性关系显著性，由F值检验来判定，P值越小，则说明变量的显著 性越高。由方差分析表(表3)可知，所考察自变量与响应值之间的线性关系显著(R2＝0.9586)， 模型的显著水平为0.0098(小于0.01)，所以该回归模型是极显著的。失拟项显著水平为0.0795 (大于0.05)，说明该回归模型拟合程度良好。
表2、Box-Behnken试验方案与结果
表3回归模型方差分析结果
4、试验结果分析与优化
利用DesignExpert软件根据回归方程进行绘图分析，得到回归方程各因素相互之间的响 应面及其等高线图(如图1所示)。
根据模型分析可知，无花果叶有效成分的提取优化工艺参数为：超声时间66.07min，液 料比20.36，浸泡时间59.47min。在此条件下，无花果叶有效成分提取液吸光度预测值为 0.614164。为验证该模型的可靠性，结合实际操作过程，将提取工艺参数修正为超声时间 66min，液料比为20.4ml/1g，浸泡时间59min；在此工艺条件下，重复试验3次，提取液吸光 度平均值为0.623，与模型预测值相对偏差远小于5％。
实验二、最大吸收波长的确定
按照201410109904.8的发明《1-环己烷-6,7-二甲氧基-1,4-二氢萘及制备方法和用途》制 备得到的晶体化合物1-环己烷-6,7-二甲氧基-1,4-二氢萘 (1-cyclohexyl-6,7-dimethoxyl-1,4-dihydronaphthalene)，分子量：272.37，分子式：C18H24O2， 其分子结构见图2。
对该晶体化合物溶液在190～400nm波段进行扫描，其在波长246nm处具有最大吸收值， 故以该化合物为标准物，测定246nm下提取液的吸光度。
实施例1、一种无花果叶有效成分提取方法，包括如下步骤：
将无花果叶片干燥至含水率≤8％(重量含量)，粉碎，过60目筛；将上述粉末状的无花 果叶片5.0g与102.0ml乙酸乙酯混合(即，液料比20.4：1)，室温下浸泡59min后超声提取66min， 过滤，所得的滤渣重复上述提取(即，在滤渣中加入102.0ml乙酸乙酯后，超声提取66min)。 超声频率为53kHz，超声提取的温度控制在50～60℃。
合并2次的提取液，减压蒸馏，得无花果叶粗提物。
上述减压蒸馏，目的是回收提取液中的乙酸乙酯，具体如下：将合并后的提取液置于烧 瓶中，在45℃，100rpm工艺条件下旋转蒸发直至无乙酸乙酯蒸出为止；得到无花果叶有效成 分粗提物(即，1-环己烷-6,7-二甲氧基-1,4-二氢萘的粗提物)。所得粗提物用无水乙醇溶解， 定溶至10ml，再用无水乙醇稀释400倍，取3ml稀释液放入石英比色皿中，以无水乙醇为空白 对照，在波长246nm下测定吸光度，为0.623。
为了分别考察不同提取溶剂、超声提取时间、浸泡时间、液料比和超声提取温度5个因 素对无花果叶有效成分提取效果的影响。通过以下实施例2～实施例6这5个试验(实验一中 的单因素试验设计)的试验结果，选取对无花果叶有效成分提取效果有显著影响的3个因素： 超声提取时间，液料比，浸泡时间作为响应面优化的因素；而这3个因素响应面优化的水平 设计，以相应试验的最佳条件作为中水平，选取与中水平相近的数值作为高、低水平，从而 进行响应面优化设计和相关数据分析，最终得到实施例1中的最佳工艺参数。
实施例2、不同提取溶剂对无花果叶有效成分提取效果的影响：
设定超声时间为30min，浸泡时间30min，液料比12：1，超声温度30℃，改变提取溶剂 (甲醇、95％乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚)；其余等同于实施例1。结果如图3所示。
当提取溶剂为乙酸乙酯时，无花果叶有效成分的提取效果最佳，提取液吸光度为0.490。
实施例3、不同超声提取时间对无花果叶有效成分提取效果的影响：
设定提取溶剂为石油醚，浸泡时间30min，液料比12，超声温度30℃，改变超声时间(15， 30，45，60，75min)；其余同实施例1。结果如图4所示。
当超声时间设定为60min时，无花果叶有效成分的提取效果最佳，提取液吸光度为0.269。
实施例4、不同浸泡时间对无花果叶有效成分提取效果的影响：
设定提取溶剂为石油醚，超声时间30min，液料比12，超声温度30℃，改变浸泡时间(15， 30，45，60，75min)；其余同实施例1。结果如图5所示。
当浸泡时间设定为60min时，无花果叶有效成分的提取效果最佳，提取液吸光度为0.383。
实施例5、不同液料比对无花果叶有效成分提取效果的影响：
设定提取溶剂为石油醚，超声时间30min，浸泡时间30min，超声温度30℃，改变液料 比(8，12，16，20，24)；其余同实施例1。结果如图6所示。
当液料比设定为20时，无花果叶有效成分的提取效果最佳，提取液吸光度为0.393。
实施例6、不同超声提取温度对无花果叶有效成分提取效果的影响：
设定提取溶剂为石油醚，超声时间30min，浸泡时间30min，液料比12，改变超声温度 (20，30，40，50，60℃)；其余同实施例1。结果如图7所示。
当超声温度设定为50℃时，无花果叶有效成分的提取效果最佳，提取液吸光度为0.319。
对比例1-1、将超声时间设定为80min，其余同实施例1。无花果叶有效成分提取液在246nm 处的吸光度为0.529。
对比例1-2、将超声时间设定为40min，其余同实施例1。无花果叶有效成分提取液在246nm 处的吸光度为0.536。
对比例2-1、将乙酸乙酯与干燥的无花果叶片液料比设定为25ml:1g，其余同实施例1。无 花果叶有效成分提取液在246nm处的吸光度为0.594。
对比例2-2、将乙酸乙酯与干燥的无花果叶片液料比设定为15ml:1g，其余同实施例1。无 花果叶有效成分提取液在246nm处的吸光度为0.583。
对比例3-1、将浸泡时间设定为80min，其余同实施例1。无花果叶有效成分提取液在246nm 处的吸光度为0.601。
对比例3-2、将浸泡时间设定为40min，其余同实施例1。无花果叶有效成分提取液在246nm 处的吸光度为0.554。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导 出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。