发明背景
发明领域
本发明提供了蛋白酶抗性肽、制备此类肽的方法，以及包括蛋白酶抗性肽的组合物和利用此类肽进行治疗的方法。在标准肽合成过程中将α-甲基-官能化氨基酸经由在此所描述的方法直接掺入主链中。
背景技术
长效肽疗法的开发受以下因素阻碍，例如短血浆半衰期和口服生物利用度较差，主要是肽对酶降解的天然敏感性的结果。大部分蛋白水解功能是必要的，包括调节基本的生物分子过程，例如关闭在细胞表面的肽信号传导事件、或蛋白和肽在消化过程中的胃分解。因此，负责蛋白酶的活性不能简单地被抑制，同时在许多情况下不引起其他代谢紊乱。
因此为了克服降解，增强感兴趣的肽的酶抗性是令人希望的。通常，利用两个主要方法来增强酶抗性：序列特异性修饰，即影响肽本身的一级结构的那些；以及整体有效修饰，即改变肽的某些总体物理化学特征的那些。策略上引入的此类修饰可以降低自然生理过程的影响，否则这些过程就会消除或失活其作用令人希望的肽，例如酶降解和/或通过肾超滤的清除。
序列特异修饰包括抗蛋白水解的特殊氨基酸的掺入，或更复杂的修饰，包括天然存在的侧链功能之间的环化例如二硫键形成(Cys-Cys)、或内酰胺化(Lys-Glu或Lys-Asp)。另外的修饰包括在肽主链之内的非天然氨基酸替代物之间的环化，例如烯烃复分解钉合(stapling)。
整体修饰包括过程如肽脂化，例如棕榈酰化和/或聚乙二醇化。棕榈酰化具有产生肽的循环储器的作用，该肽在血液血清中与天然丰富的白蛋白微弱地缔合。与白蛋白缔合的肽有效地逃过肾超滤，因为缔合的复合物的尺寸高于肾小球滤过截取值。当该肽从白蛋白的表面解离时，其再次游离，以便与内源受体相互作用。聚乙二醇化具有物理地屏蔽肽免于蛋白水解的作用并赋予显著亲水性，当水合时所述亲水性大大增加治疗性分子的流体动力学半径以克服肾清除。然而，脂化和聚乙二醇化对主要肽链针对蛋白水解的敏感性均不具有显著影响。
虽然这些技术总体上可以广泛适用于治疗性肽，并在某一程度能够延伸循环半衰期，但仍然存在着对于增加肽和蛋白质对酶降解的稳定性的方法的需要，特别是鉴于产生可口服给予的肽的期望时。
发明概述
通篇描述了满足上述需要的实施例。
在一个实施例中，提供了合成肽，该合成肽包括用α-甲基官能化氨基酸对天然氨基酸残基的至少一个取代。适当地，该合成肽维持与对应的不包括任何取代的合成肽基本上相同的受体效价和选择性。
在实施例中，该至少一个α-甲基官能化氨基酸对应于被取代的该天然氨基酸残基。适当地，该至少一个α-甲基官能化氨基酸包括α-甲基组氨酸、α-甲基丙氨酸、α-甲基异亮氨酸、α-甲基精氨酸、α-甲基亮氨酸、α-甲基天冬酰胺、α-甲基赖氨酸、α-甲基天冬氨酸、α-甲基甲硫氨酸、α-甲基半胱氨酸、α-甲基苯丙氨酸、α-甲基谷氨酸、α-甲基苏氨酸、α-甲基谷氨酰胺，α-甲基色氨酸、α-甲基甘氨酸、α-甲基缬氨酸、α-甲基鸟氨酸、α-甲基脯氨酸、α-甲基硒代半胱氨酸、α-甲基丝氨酸和/或α-甲基酪氨酸。
在实施例中，该合成肽对蛋白降解，包括例如DPP-IV、脑啡肽酶、胰凝乳蛋白酶、纤溶酶、凝血酶、激肽释放酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶和/或胃蛋白酶降解是实质上有抗性的。
适当地，该天然氨基酸残基是对蛋白水解裂解敏感的位点。
在实施例中，该肽是一种肠降血糖素类肽，包括但不限于，胰高血糖素样肽1(GLP-1)、葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)、艾塞那肽(exenatide)加胰高血糖素、促胰液素、腱调蛋白、胃泌酸调节素和血管活性肠肽(VIP)。
在其他实施例中，该肽是胰岛素。
在另外的实施例中，提供了一种GLP-1肽，该GLP-1肽适当地包括用α-甲基官能化氨基酸对天然氨基酸残基的至少三个取代，其中该合成GLP-1肽维持与对应的不包括这些取代的合成GLP-1肽基本上相同的受体效价和选择性。在实施例中，至少三个、或至少四个α-甲基官能化氨基酸是α-甲基苯丙氨酸。适当地，该α-甲基官能化氨基酸是在位置Phe6、Try13、Phe22和Trp25处取代的α-甲基苯丙氨酸。
适当地，这些GLP-1肽进一步包括在位置2(Aib2)处的氨基异丁酸取代、在位置5(Ser5)处的丝氨酸修饰、在位置20(α-MeLys20)和28(α-MeLys28)处取代的α-甲基赖氨酸、位置26(Val26)处的缬氨酸修饰、和/或羧基末端脂化或聚乙二醇化。
还提供了制备合成肽的方法，这些方法包括在肽中鉴别用于取代的至少一种天然氨基酸残基，并且用α-甲基官能化氨基酸取代所鉴别的天然氨基酸残基。其中该合成肽维持与对应的不包括该取代的合成肽基本上相同的受体效价和选择性，并且其中该合成肽对蛋白降解是实质上有抗性的。
在另外的实施例中，提供了制备一种蛋白水解性稳定的肽的方法，这些方法包括将肽暴露于一种或多种蛋白酶、鉴别是对蛋白水解裂解敏感的位点的至少一个天然氨基酸残基，并且用α-甲基官能化氨基酸取代所鉴别的氨基酸残基。其中该合成肽维持与对应的不包括该取代的合成肽基本上相同的受体效价和选择性，并且其中该合成肽对蛋白降解是实质上有抗性的。
还提供了治疗患者的方法，这些方法包括给予药学上有效量的如在此描述的合成肽。
在其他实施例中，提供了一种包括以下氨基酸序列的合成GLP-1肽：
R1-His-X1-Glu-Gly-X2-X3-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-X4-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X5-Glu-X6-Ile-Ala-X7-X8-X9-X10-X11-X12-R2(SEQ ID NO:2)，其中：
R1是Hy、Ac或pGlu；
R2是-NH2或–OH；
X1是Ala、Aib、Pro或Gly；
X2是Thr、Pro或Ser；
X3是Aib、Bip、β,β-Dip、F5-Phe、Phe、PhG、Nle、高Phe、高Tyr、N-MePhe、α-MePhe、α-Me-2F-Phe、Tyr、Trp、Tyr-OMe、4I-Phe、2F-Phe、3F-Phe、4F-Phe、1-NaI、2-NaI、Pro或二-β,β-MePhe；
X4是Aib、Ala、Asp、Arg、Bip、Cha、β,β-Dip、Gln、F5-Phe、PhG、Nle、高Phe、高Tyr、α-MePhe、α-Me-2F-Phe、Phe、Thr、Trp、Tyr-OMe、4I-Phe、2F-Phe、3F-Phe、4F-Phe、Tyr、1-NaI、2-NaI、Pro、二-β,β-MePhe、α-MeTyr或二-β,β-MeTyr；
X5是Aib、Lys、D-pro、Pro或α-MeLys或二-β,β-MeLys；
X6是Aib、Asp、Arg、Bip、Cha、Leu、Lys、2Cl-Phe、3Cl-Phe、4Cl-Phe、PhG、高Phe、2Me-Phe、3Me-Phe、4Me-Phe、2CF3-Phe、3CF3-Phe、4CF3-Phe、β-Phe、β-MePhe、D-phe、4I-Phe、3I-Phe、2F-Phe、β,β-Dip、β-Ala、Nle、Leu、F5-Phe、高Tyr、α-MePhe、α-Me-2F-Phe、Ser、Tyr、Trp、Tyr-OMe、3F-Phe、4F-Phe、Pro、1-NaI、2-NaI或二-β,β-MePhe；α-MeTyr、二-β,β-MeTyr、α-MeTrp或二-β,β-MeTyr；
X7是Aib、Arg、Bip、Cha、β,β-Dip、F5-Phe、PhG、Phe、Tyr、高Phe、高Tyr、α-MePhe、α-Me-2F-Phe、2Me-Phe、3Me-Phe、4Me-Phe、Nle、Tyr-OMe、4I-Phe、1-NaI、2-NaI、2F-Phe、3F-Phe、4F-Phe、Pro、N-MeTrp、α-MeTrp、二-β,β-MeTrp、二-β,β-Me-Phe；α-MeTyr或二-β,β-MeTyr；
X8是Aib、Ala、Arg、Asp、Glu、Nle、Pro、Ser、N-MeLeu、α-MeLeu、Val或α-MeVal；
X9是Aib、Glu、Lys、Pro、α-MeVal或α-MeLeu；
X10是Aib、Glu、Lys、Pro或α-MeLys；
X11是Aib、Glu、Pro或Ser；并且
X12是Aib、Gly、Glu、Lys、Pro、α-MeArg或α-MeLys。
参照附图，下文详细地描述了这些实施例的另外的实施例、特征、和优点，连同不同实施例的结构和操作。
附图简要说明
图1示出胰高血糖素样肽1(GLP-1)中的氨基酸取代的示例性位点。(SEQ ID NO:3)
图2A-2C示出GLP-1比较物的脑啡肽酶降解。
图3A-3D示出根据在此描述的实施例的合成GLP-1蛋白暴露于脑啡肽酶的稳定性。
图4A-4D示出在暴露于脑啡肽酶240小时后根据在此描述的实施例的合成GLP-1蛋白的稳定性。
图5A-5C示出GLP-1比较物的胰凝乳蛋白酶降解。
图6A-6D示出根据在此描述的实施例的合成GLP-1蛋白暴露于胰凝乳蛋白酶的稳定性。
图7A-7D示出根据在此描述的实施例的合成GLP-1蛋白暴露于胰凝乳蛋白酶的稳定性。
图8A-8C示出GLP-1比较物的胰蛋白酶降解。
图9A-9C示出根据在此描述的实施例的合成GLP-1蛋白暴露于胰蛋白酶的稳定性。
图10A-10C示出根据在此描述的实施例的合成GLP-1蛋白暴露于胰蛋白酶的稳定性。
图11A-11B示出GLP-1比较物的血清降解。
图12A-12B示出根据在此描述的实施例的合成GLP-1蛋白暴露于血清的稳定性。
图13A-13D示出脂化的比较物和脂化的根据在此描述的实施例的合成GLP-1蛋白暴露于胃液的稳定性。
图14A-14E示出可商购的GLP-1蛋白和根据在此描述的实施例的合成GLP-1蛋白暴露于胃液的稳定性研究。
图15A-15E示出一种放大的谱图，其证明可商购的GLP-1肽和根据在此描述的实施例的合成GLP-1肽暴露于胃液的稳定性研究。
发明详述
应该领会的是在此展示和描述的这些具体的实现方式是实例，并且不旨在以任何方式在其他方面限制本申请的范围。
在此提及的这些公开的专利、专利申请、网站、公司名称、以及科学文献特此以其全文形式通过引用而结合，达到如同每个被确切并单独地表明而通过引用结合的相同程度。在此引用的任何参考文件与本说明书的具体传授之间的任何冲突应以有利于后者的方式来解决。同样，在单词或短语的领域理解的定义与如在本说明书中确切传授的该单词或短语的定义之间的任何冲突应以有利于后者的方式来解决。
如在本说明书中所使用，单数形式“一个/种(a，an)”以及“该”具体地还涵盖它们所提及的术语的复数形式，除非本内容清楚地另外指明。在此使用术语“约”以意指大约(approximately)、在……的附近(in the region of)、粗略地(roughly)、或左右(around)。当术语“约”与一个数值范围结合使用时，它通过扩展列举的数值的上限和下限将该范围加以修饰。通常，在此使用术语“约”以将一个数值以高于和低于该规定值的20％的变化加以修饰。
在此使用的技术术语和科学术语具有由本申请涉及的领域的普通技术人员通常理解的含义，除非另外定义。在此参考了本领域的普通技术人员已知的不同方法和材料。陈述肽合成的一般原理的标准参考包括W.C.钱(W.C.Chan)和P.D.怀特(P.D.White).，“Fmoc固相肽合成：实用方法”(“Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis:A PracticalApproach”)，牛津大学出版社(Oxford University Press)，牛津(Oxford)(2004)。
术语“多肽”、“肽”、“蛋白质”以及“蛋白质片段”在此可以互换使用以便表示氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是一种对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，并且适用于天然存在的氨基酸聚合物以及非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然存在的以及合成的氨基酸，连同与天然存在的氨基酸功能类似的氨基酸类似物以及氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是通过遗传密码编码的那些氨基酸，以及随后被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、以及O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指以下化合物，这些化合物具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，例如与氢相结合的碳、羰基基团、氨基基团、以及R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物能具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留了与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指以下化学化合物，这些化合物具有不同于通常的氨基酸的化学结构的、但与天然存在的氨基酸的功能相类似的结构。术语“氨基酸”和“氨基酸残基”通篇可互换地使用。
在合成主要肽链之后，旨在改进肽的代谢稳定性的大部分的化学修饰涉及另外的化学操作，例如内酰胺化、二硫键闭合、脂化或聚乙二醇化。此类修饰常常是耗时的并且很可能显著地增加任何产物的最终商品成本。
如在此所描述的，在标准肽合成期间，α-甲基-官能化氨基酸直接掺入主链中使得在此描述的方法更简单并易于进行大规模制备。关于天然螺旋的肽(例如肠降血糖素类，如在此所描述的，包括GLP-1、胰高血糖素、GIP、VIP和促胰液素)的化学合成，认为α-甲基氨基酸的天然转角诱导效应改进了肽在合成过程中的粗品产量。
如在此所描述的，α-甲基氨基酸在合成肽的合成过程中在所希望的一个或多个位点处被策略性地掺入。经修饰的氨基酸允许肽保持天然侧链官能性，这常常对肽的受体效价是关键的。
在此提供了解决肽的天然酶倾向性的组合物和方法。通过用α-甲基官能化氨基酸的位点特异性掺入来屏蔽敏感位点(例如，易裂开的键)，提供了如下肽，其证明对酶降解增加的抗性，同时仍然保持与野生型肽基本上相同的受体效价和选择性。
证明蛋白酶抗性的合成肽
在实施例中，提供了包括用α-甲基官能化氨基酸对天然氨基酸残基的至少一个取代的合成肽。在其他实施例中，提供了包括用α-甲基官能化氨基酸对天然氨基酸残基的至少两个取代的合成肽。
如在此所描述的，“合成肽”是指氨基酸残基的聚合物，其已经通过将一个氨基酸的羧基基团或C-末端化学偶联至另一个氨基酸的氨基基团或N-末端而产生。化学肽合成在肽的C-末端开始并且在N-末端结束。用于肽合成以产生合成肽的各种方法是本领域熟知的。
如在此所描述的，“α-甲基官能化氨基酸”是指如下氨基酸，其中该氨基酸的第一(α)碳原子包括结合至该α碳的一个甲基基团(CH3)取代基。α-甲基官能化氨基酸包括含这种官能化的二十一种氨基酸中的任一者。
如通篇所述，α-甲基官能化氨基酸可以取代，即，可以替换肽中的任何天然氨基酸。“天然”氨基酸是指存在于天然肽或野生型肽中的氨基酸，其将被取代。
取代是指用α-官能化氨基酸替换天然氨基酸。在合成肽的化学合成过程中，该天然氨基酸可以容易地被α官能化氨基酸所替换。
虽然在此描述的合成肽可以是任何长度的，即，长度是任意数目的氨基酸，适当地，合成肽的长度是近似约5个氨基酸至约200个氨基酸，长度适当地是约10个氨基酸至约150个氨基酸，长度是约20个氨基酸至约100个氨基酸，长度是约30个氨基酸至约75个氨基酸，或长度是约20个氨基酸、约30个氨基酸、约40个氨基酸、约50个氨基酸、约60个氨基酸、约70个氨基酸、约80个氨基酸、约90个氨基酸或约100个氨基酸。
如通篇所述，在此描述的包含取代天然氨基酸的一种或多种α-官能化氨基酸的合成肽维持与对应的不包括这些取代的合成肽基本上相同的受体效价和选择性。在一些情况下，这些合成肽包含取代天然氨基酸的两个或更多个α-官能化氨基酸。
术语“受体效价”是指肽的半数最大(50％)有效浓度(EC50)的倒数。EC50是指肽在指定的暴露时间之后诱导介于对于肽的选定靶标的基线应答与最大应答之间的一半的生物应答的浓度。因此，表现出小的EC50值的肽具有相应高的受体效价，然而表现出大的EC50值的肽具有相应低的受体效价，即诱导与受体相关的应答所需要的肽越多，该肽对该受体的效价就越小。
用于确定受体效价和EC50的方法是本领域中已知的并且适当地涉及确定一种或多种细胞受体应答的刺激。例如，通过标准方法产生表达GLP-1受体(GLP-1R)、胰高血糖素受体(GCGR)或葡萄糖依赖性促胰岛素肽(抑胃多肽)受体(GIPR)的合适的细胞系。这些不同受体的肽活化导致下游的cAMP第二信使的产生，其可以在功能活性测定中测得。从这些测量，EC50值可容易地确定。
如通篇所述，包括α-官能化氨基酸的一个或多个取代的合成肽(在此也称为“经取代的肽”)维持与对应的不包括取代的合成肽“基本上相同的”受体效价。如在此所使用，“基本上相同的”当是指受体效力时意指当将这些经取代的肽与不包含任何取代并且最好包含原始的未经修饰的野生型序列、或其他适合的比较物序列(即对照)的肽的受体效价进行比较时，这些经取代的肽表现出适当地约75％的受体效价。在另外的实施例中，当将经取代的肽与不包含任何取代并且最好包含原始的未经修饰的野生型序列、或其他适合的比较物序列(即对照)的肽的受体效价进行比较时，这些经取代的肽表现出适当地约80％的受体效价、或约85％的受体效价、或约90％的受体效价、或约91％的受体效价、或约92％的受体效价、或约93％的受体效价、或约94％的受体效价、或约95％的受体效价、或约96％的受体效价、或约97％的受体效价、或约98％的受体效价、或约99％的受体效价、或约99.1％的受体效价、或约99.2％的受体效价、或约99.3％的受体效价、或约99.4％的受体效价、或约99.5％的受体效价、或约99.6％的受体效价、或约99.7％的受体效价、或约99.8％的受体效价、或约99.9％的受体效价、或适当地约100％的受体效价。
如通篇所述，包括α-官能化氨基酸的一个或多个取代的合成肽还适当地维持与对应的不包括这些取代的合成肽“基本上相同的选择性”。如在此所使用，“选择性”是指肽结合其靶标(即激动剂，该肽其被设计成结合至激动剂)，同时不结合至其他非靶标蛋白的能力。适当地，当将经取代的肽与不包含任何取代并最好包含原始的未经修饰的野生型序列、或其他适合的比较物序列(即对照)的肽的受体效价进行比较时，这些经取代的肽表现出“基本上相同的选择性”并从而表现出约75％的选择性。在另外的实施例中，当将经取代的肽与不包含任何取代并且最好包含原始的未经修饰的野生型序列、或其他适合的比较物序列(即对照)的肽的选择性进行比较时，这些经取代的肽表现出适当地约80％的选择性、或约85％的选择性、或约90％的选择性、或约91％的选择性、或约92％的选择性、或约93％的选择性、或约94％的选择性、或约95％的选择性、或约96％的选择性、或约97％的选择性、或约98％的选择性、或约99％的选择性、或约99.1％的选择性、或约99.2％的选择性、或约99.3％的选择性、或约99.4％的选择性、或约99.5％的选择性、或约99.6％选择性的、或约99.7％的选择性、或约99.8％的选择性、或约99.9％的选择性、或适当地约100％的选择性。
适当地，该α-甲基官能化氨基酸对应于野生型蛋白中的被取代的天然氨基酸。也就是说，原始的野生型肽序列中的氨基酸被具有相同侧链的α-甲基官能化氨基酸取代。换言之，例如，Phe、Trp、Tyr等分别被α-MePhe、α-MeTrp、α-MeTyr等取代。
在另外的实施例中，α-甲基官能化氨基酸对应于与被取代的天然氨基酸相同的类别。例如，脂肪族α-甲基官能化氨基酸取代脂肪族天然氨基酸；羟基α-甲基官能化氨基酸取代羟基天然氨基酸；含硫的α-甲基官能化氨基酸取代含硫天然氨基酸；环状α-甲基官能化氨基酸取代环状天然氨基酸；芳香族α-甲基官能化氨基酸取代芳香族天然氨基酸；碱性α-甲基官能化氨基酸取代碱性天然氨基酸；和/或酸性α-甲基官能化氨基酸取代酸性天然氨基酸。
在另外的实施例中，该α-甲基官能化氨基酸不对应于被取代的天然氨基酸。
α-甲基官能化氨基酸的商业来源包括，例如，瑞士的巴亨公司(Bachem AG)。
在示例性实施例中，在此描述的合成肽中的至少一个α-甲基官能化氨基酸是α-甲基苯丙氨酸。
在又另外的实施例中，在此描述的合成肽中的至少一个α-甲基官能化氨基酸选自α-甲基官能化组氨酸、α-甲基官能化丙氨酸、α-甲基官能化异亮氨酸、α-甲基官能化精氨酸、α-甲基官能化亮氨酸、α-甲基官能化天冬酰胺、α-甲基官能化赖氨酸、α-甲基官能化天冬氨酸、α-甲基官能化甲硫氨酸、α-甲基官能化半胱氨酸、α-甲基官能化苯丙氨酸、α-甲基官能化谷氨酸，α-甲基官能化苏氨酸、α-甲基官能化谷氨酰胺、α-甲基官能化色氨酸、α-甲基官能化甘氨酸、α-甲基官能化缬氨酸、α-甲基官能化鸟氨酸、α-甲基官能化脯氨酸、α-甲基官能化硒代半胱氨酸、α-甲基官能化丝氨酸以及α-甲基官能化酪氨酸。
如通篇所述，在此描述的合成肽对蛋白降解是实质上有抗性的。
如在此所使用，“蛋白降解”意指将肽分解为更小的肽或甚至氨基酸，通常由肽键通过酶的水解所引起。
通篇所提供的对蛋白降解“实质上有抗性”的合成肽表明在酶通常有活性的(即，适合的pH、温度、其他环境条件)的条件中暴露于该酶中持续一段限定的时间之后，至少约50％的合成肽保持完整。适当地，在此提供的合成肽对持续以下时间的蛋白降解是实质上有抗性的：至少4小时，更适当地至少8小时、至少12小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少120小时、至少144小时、至少168小时、至少192小时、至少216小时、至少240小时、或约36小时至约240小时、约48小时至240小时、约72小时至约240小时、约96小时至约240小时、约120小时至约240小时、约144小时至约240小时、约168小时至约240小时、约192小时至约240小时、或约216小时至约240小时。在另外的实施例中，在酶通常有活性的条件中暴露于该酶持续一段限定的时间之后，至少约80％的合成肽保持完整，或在酶通常有活性的条件中暴露于该酶持续一段限定的时间之后，更适当地至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.1％、至少约99.2％、至少约99.3％、至少约99.4％、至少约99.5％、至少约99.6％、至少约99.7％、至少约99.8％、至少约99.9％、或至少约100％的合成肽保持完整。
所提供的合成肽是适当地对在哺乳动物体内(适当地在人体内)发现的一种或多种酶的蛋白降解实质上有抗性。例如，这些合成肽是适当地对以下各项中的一种或多种的蛋白降解有抗性：二肽基肽酶-IV(DPP-IV)、脑啡肽酶、胰凝乳蛋白酶、纤溶酶、凝血酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶和胃蛋白酶。在适合的实施例中，这些合成肽是对两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、或适当地所有的所列举的酶的蛋白降解有抗性。在此所描述的合成肽还可以对本领域中已知的其他酶的蛋白降解实质上有抗性。在实施例中，在此所描述的这些合成肽是对消化(胃)酶和/或血液/血清中的酶的蛋白降解实质上有抗性。
在实施例中，在此所描述的合成肽是对DPP-IV和脑啡肽酶的蛋白降解实质上有抗性。在实施例中，在此所描述的这些合成肽是对胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶的蛋白降解实质上有抗性。在实施例中，在此所描述的合成肽是对纤溶酶、凝血酶和激肽释放酶的蛋白降解实质上有抗性。在实施例中，在此所描述的这些合成肽是对胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的蛋白降解实质上有抗性。在实施例中，在此所描述的这些合成肽是对胃蛋白酶和胰蛋白酶的蛋白降解实质上有抗性。
如在此所描述的，包括在通篇所提供的方法中，用α-官能化氨基酸取代天然氨基酸适当地发生在是对蛋白水解裂解敏感的位点的天然氨基酸残基处。也就是说，被取代的氨基酸残基被确定为其中蛋白水解酶在天然(即，野生型)肽的裂解肽键中有活性的位点。用于确定蛋白水解裂解的位点的方法在本领域是熟知的且在此所描述的。
可以根据在此提供的方法制备任何类别的肽，以产生具有所列举的特征的合成肽。
在示例性实施例中，这些合成肽是肠降血糖素类肽。可以如在此所描述的制备的示例性合成肠降血糖素类肽包括但不局限于，胰高血糖素样肽1(GLP-1)、葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)、艾塞那肽加胰高血糖素、促胰液素、腱调蛋白、胃泌酸调节素或血管活性肠肽(VIP)。
另外类别的肽可以如在此所描述的来制备。
在实施例中，在此所描述的合成肽是GLP-1肽。在另外的实施例中，在此所描述的合成肽是胰岛素。
可以制备为用以产生具有所列举的特征的合成肽的在此所描述的各种肽和肽类别的天然(野生型)肽序列是本领域熟知的。
GPL-1的天然氨基酸序列是本领域中已知的，如以下所列出的：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO:1)。
在实施例中，提供了合成GLP-1肽，这些合成GLP-1肽包括用α-甲基官能化氨基酸对天然氨基酸残基的至少三个取代。如通篇所述，适当地，该合成GLP-1肽维持与对应的不包括这些取代的合成GLP-1肽基本上相同的受体效价和选择性。
在实施例中，该至少三个α-甲基官能化氨基酸取代对应的天然氨基酸残基。也就是说，如在此所描述的，天然蛋白中的氨基酸被相同的对应的α-甲基官能化氨基酸取代。
在另外的实施例中，该三个α-甲基官能化氨基酸是α-甲基苯丙氨酸。在此类实施例中，不必要的是，将被α-甲基官能化苯丙氨酸取代的天然氨基酸本身为苯丙氨酸。而是，如在此所描述的，简单地通过用来自同类的α-甲基官能化氨基酸(即，芳香族氨基酸)替换一种天然芳香族氨基酸，已经发现在此所描述的合成肽表现出所维持的受体效价和选择性连同增加的稳定性的所希望的特征。
在另外的实施例中，在此所描述的合成肽可以进一步包括通过脂化的修饰，所述脂化包括羧基末端脂化或氨基末端脂化或主链脂化。制备具有这种脂化的合成肽的方法是本领域中已知的。已经确定，与在此所述的其中天然氨基酸被α-甲基官能化氨基酸所取代的实施例组合，C-末端脂化提供了另外的稳定性，特别是在暴露于血清和胃液期间。
适当地，在此提供的合成GLP-1肽包括四种α-甲基官能化氨基酸。在实施例中，该四种α-甲基官能化氨基酸取代对应的氨基酸。在示例性实施例中，该四种α-甲基官能化氨基酸在位置Phe6、Try13、Phe22和Trp25处取代，并且在另外的实施例中，该四种α-甲基官能化氨基酸是在位置Phe6、Try13、Phe22和Trp25处取代的α-甲基苯丙氨酸。
在另外的实施例中，在此提供的合成GLP-1肽包括六种α-甲基官能化氨基酸。在实施例中，该六种α-甲基官能化氨基酸取代对应的氨基酸。在示例性实施例中，该六种α-甲基官能化氨基酸在位置Phe6、Try13、Lys20、Phe22、Trp25和Lys28处取代，并且在另外的实施例中，该六种α-甲基官能化氨基酸是在Phe6、Try13、Phe22和Trp25位置处取代的四种α-甲基苯丙氨酸以及在位置Lys20和Lys28处取代的两种α-甲基赖氨酸。
在适合的实施例中，在此所描述的GLP-1合成肽适当地进一步包括在位置2(Aib2)处的氨基异丁酸取代。在又另外的实施例中，在此所描述的GLP-1合成肽适当地进一步包括在位置5处用丝氨酸取代苏氨酸(Thr5Ser；T5S)。在又另外的实施例中，在此所描述的GLP-1合成肽适当进一步包括在位置26处用缬氨酸取代亮氨酸(Leu26Val；L26V)。
在实施例中，在此所描述的合成GLP-1肽对蛋白降解是实质上有抗性的，所述蛋白降解包括但不局限于以下各项中的一种或多种的降解：DPP-IV、脑啡肽酶、胰凝乳蛋白酶、纤溶酶、凝血酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶和胃蛋白酶。
在另外的实施例中，在此提供了包括以下氨基酸序列的GLP-1肽，按次序为：
R1-His-X1-Glu-Gly-X2-X3-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-X4-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X5-Glu-X6-Ile-Ala-X7-X8-X9-X10-X11-X12-R2(SEQ ID NO:2)，
其中：
R1是Hy、Ac或pGlu；
R2是-NH2或–OH；
X1是Ala、Aib、Pro或Gly；
X2是Thr、Pro或Ser；
X3是Aib、Bip、β,β-Dip、F5-Phe、Phe、PhG、Nle、高Phe、高Tyr、N-MePhe、α-MePhe、α-Me-2F-Phe、Tyr、Trp、Tyr-OMe、4I-Phe、2F-Phe、3F-Phe、4F-Phe、1-NaI、2-NaI、Pro或二-β,β-Me-Phe；
X4是Aib、Ala、Asp、Arg、Bip、Cha、β,β-Dip、Gln、F5-Phe、PhG、Nle、高Phe、高Tyr、α-MePhe、α-Me-2F-Phe、Phe、Thr、Trp、Tyr-OMe、4I-Phe、2F-Phe、3F-Phe、4F-Phe、Tyr、1-NaI、2-NaI、Pro或二-β,β-Me-Phe；
X5是Aib、Lys、D-pro、Pro或α-MeLys；
X6是Aib、Asp、Arg、Bip、Cha、Leu、Lys、2Cl-Phe、3Cl-Phe、4Cl-Phe、PhG、高Phe、2Me-Phe、3Me-Phe、4Me-Phe、2CF3-Phe、3CF3-Phe、4CF3-Phe、β-Phe、β-MePhe、D-phe、4I-Phe、3I-Phe、2F-Phe、β,β-Dip、β-Ala、Nle、Leu、F5-Phe、高Tyr、α-MePhe、α-Me-2F-Phe、Ser、Tyr、Trp、Tyr-OMe、3F-Phe、4F-Phe、Pro、1-NaI、2-NaI或二-β,β-Me-Phe；
X7是Aib、Arg、Bip、Cha、β,β-Dip、F5-Phe、PhG、Phe、Tyr、高Phe、高Tyr、α-MePhe、α-Me-2F-Phe、2Me-Phe、3Me-Phe、4Me-Phe、Nle、Tyr-OMe、4I-Phe、1-NaI、2-NaI、2F-Phe、3F-Phe、4F-Phe、Pro、N-MeTrp、α-MeTrp或二-β,β-Me-Phe；
X8是Aib、Ala、Arg、Asp、Glu、Nle、Pro、Ser、N-MeLeu、α-MeLeu或Val；
X9是Aib、Glu、Lys、α-MeVal或Pro；
X10是Aib、Glu、α-MeLys或Pro；
X11是Aib、Glu、Pro或Ser；并且
X12是Aib、Gly、Glu、Pro或α-MeArg。
适当地，GLP-1肽由在SEQ ID NO:2中所列出的氨基酸序列组成，即，仅由在完整序列中并按所列举的顺序列举的氨基酸组成，如在SEQ ID NO:2中所列出的。
制备合成肽的方法
还提供了制备合成肽的方法。
在一些实施例中，这些方法适当地包括在该肽中鉴别用于取代的至少一个天然氨基酸残基。在其他实施例中，这些方法适当地包括在该肽中鉴别用于取代的至少两个天然氨基酸残基。然后用α-甲基官能化氨基酸取代所鉴别的天然氨基酸残基。
如通篇所述，通过在此提供的方法制备的合成肽适当地维持与对应的不包括取代的合成肽基本上相同的受体效价和选择性。此外，根据在此描述的方法制备的合成肽还对蛋白降解是实质上有抗性的。
适当地，在此提供的方法中，取代的α-甲基官能化氨基酸对应于被取代的天然氨基酸残基，并且在另外的实施例中，取代的α-甲基官能化氨基酸对应于与被取代的天然氨基酸残基相同的类别。
在另外的实施例中，取代的a-甲基官能化氨基酸是α-甲基苯丙氨酸。在示例性实施例中，α-甲基苯丙氨酸取代对应的天然氨基酸，但在方法的另外的实施例中，该α-甲基苯丙氨酸并非必须对应于其中发生取代的相同天然氨基酸。
在适合的实施例中，根据在此描述的方法制备的合成肽对以下各项中的一种或多种是实质上有抗性的：DPP-IV、脑啡肽酶、胰凝乳蛋白酶、纤溶酶、凝血酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶和胃蛋白酶降解。
在实施例中，将合成肽在TGR树脂上制备为C-末端甲酰胺。在环境温度下，将氨基酸(天然和非天然两者)使用于NMP中的HCTU/DIPEA适当地偶联，用乙酸酐和吡啶的溶液加帽残余官能团。在环境温度下，使用DMF中的哌啶将Fmoc适当地解封闭。
如在此所描述的，在肽中鉴别用于取代的至少一个天然氨基酸残基适当地包括鉴别在对酶促裂解敏感的位点处的氨基酸。鉴别在对酶促裂解敏感的位点处的氨基酸的示例性方法是本领域熟知的。在实施例中，鉴别在对酶促裂解敏感的位点处的氨基酸的方法适合地包括在其中酶有活性的条件下(例如，合适的pH、缓冲条件、温度等)将天然肽(即，野生型肽)暴露于单一酶持续预定的时间量，并且测量该肽的酶降解产物。用于测量酶降解产物的示例性方法包括，例如，反相液相色谱-质谱法。
适当地，将肽溶液添加至所希望的蛋白酶的溶液中。将肽和酶适当地在约37℃下进行共孵育。将经孵育的肽-酶混合物的等分部分周期性地取出，进行淬灭以阻滞蛋白水解活性，并且通过液相色谱-质谱法(LC/MS)进行分析。通过UV吸收(例如，在210nm处)以及通过使用质量检测器(ESI+模式)的电离化两者适当地检测分析物。将肽的酶促裂解产生的肽种类(片段)进行后处理分析，并且使用它们的分子质量来鉴别精确的裂解位置(在每一情况下突出显示易断开的键)。
在实施例中，在此所描述的方法被适当地用来制备具有所列举特征的任何类别的肽。
在示例性实施例中，这些方法被用来制备肠降血糖素类肽。可以如在此描述制备的示例性合成肠降血糖素类肽包括但不局限于，胰高血糖素样肽1(GLP-1)、葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)、艾塞那肽加胰高血糖素、促胰液素、腱调蛋白和胃泌酸调节素。
另外类别的肽可以如在此所描述的来制备。
在实施例中，这些方法被用来制备合成GLP-1肽。在另外的实施例中，这些方法被用来制备合成胰岛素。
在另外的实施例中，提供了制备蛋白水解性稳定的肽的方法。适当地，此类方法包括将肽暴露于一种或多种蛋白酶、鉴别是对蛋白水解裂解敏感的位点的至少两个天然氨基酸残基，并且用α-甲基官能化氨基酸取代所鉴别的氨基酸残基。
如通篇所述，适当地，此类方法提供一种合成肽，该合成肽维持与对应的不包括一个或多个取代的合成肽基本上相同的受体效价和选择性。在另外的实施例中，这些方法还提供一种合成肽，该合成肽对蛋白降解是实质上有抗性的。
适当地，在此提供的方法中，取代的α-甲基官能化氨基酸对应于被取代的天然氨基酸残基，并且在另外的实施例中，取代的α-甲基官能化氨基酸对应于与被取代的天然氨基酸残基相同的类别。
在又另外的实施例中，取代的a-甲基官能化氨基酸选自选自α-甲基官能化组氨酸、α-甲基官能化丙氨酸、α-甲基官能化异亮氨酸、α-甲基官能化精氨酸、α-甲基官能化亮氨酸、α-甲基官能化天冬酰胺、α-甲基官能化赖氨酸、α-甲基官能化天冬氨酸、α-甲基官能化甲硫氨酸、α-甲基官能化半胱氨酸、α-甲基官能化苯丙氨酸、α-甲基官能化谷氨酸，α-甲基官能化苏氨酸、α-甲基官能化谷氨酰胺、α-甲基官能化色氨酸、α-甲基官能化甘氨酸、α-甲基官能化缬氨酸、α-甲基官能化鸟氨酸、α-甲基官能化脯氨酸、α-甲基官能化硒代半胱氨酸、α-甲基官能化丝氨酸以及α-甲基官能化酪氨酸。
在另外的实施例中，取代的a-甲基官能化氨基酸是α-甲基苯丙氨酸和/或α-甲基赖氨酸。在示例性实施例中，α-甲基苯丙氨酸和/或α-甲基赖氨酸取代对应的天然氨基酸，但在方法的另外的实施例中，该α-甲基苯丙氨酸和/或α-甲基赖氨酸并非必须对应于其中发生取代的相同天然氨基酸。
在适合的实施例中，根据在此描述的方法制备的合成肽对以下各项中的一种或多种是实质上有抗性的：DPP-IV、脑啡肽酶、胰凝乳蛋白酶、纤溶酶、凝血酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶和胃蛋白酶降解。
在实施例中，在此所描述的方法被适当地用来制备具有所列举特征的任何类别的肽。
在示例性实施例中，这些方法被用来制备肠降血糖素类肽。可以如在此描述制备的示例性合成肠降血糖素类肽包括但不局限于，胰高血糖素样肽1(GLP-1)、葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)、艾塞那肽加胰高血糖素、促胰液素、腱调蛋白和胃泌酸调节素。
另外类别的肽可以如在此所描述的来制备。
在实施例中，这些方法被用来制备合成GLP-1肽。在另外的实施例中，这些方法被用来制备合成胰岛素。
包括合成肽的配制品
还提供了包括在此所描述的合成肽的配制品(或药物组合物)。适当地，此类配制品包括如在此所描述的合成肽以及载体。此类配制品可以按通篇所述的各种方法容易地给予。在一些实施例中，该配制品包括药学上可接受的载体。
术语“药学上可接受的载体”意指不干扰合成肽的生物活性的有效性的一种或多种非毒性材料。此类制剂常规地可以含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体以及任选地其他治疗剂。配制品常规地还可以含有适合给予人的相容固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。术语“载体”表示天然的或合成的有机或无机成分，合成肽与该载体组合以促进应用。
如在此所描述的配制品可以调配用于特定剂量。可以调整剂量方案以提供最佳的期望反应。举例来说，如由治疗情况所指示的，可以给予单次推注，可以随着时间给予若干分次剂量，或可以按比例地减少或增加剂量。尤其有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物，以便于剂量的给予和均匀性。如在此使用的剂量单位形式是指用于有待治疗的受试者的、适合作为单一剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算以与需要的药用载体相关的产生所希望的疗效的预定量的合成肽。剂量单位形式的规格是通过以下各项指定并且直接取决于以下各项：(a)合成肽的独特特征和有待实现的具体治疗效果，以及(b)在混配这种合成肽的领域中的固有限制。
在此所描述的配制品可以被配制用于特定的给药途经，如口服、经鼻、经肺、局部(包括经颊和舌下)、经直肠、经阴道和/或肠胃外给药。这些配制品可以合宜地呈现为单位剂型，并且可以通过药学领域已知的任何方法来制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的合成肽的量将取决于正在被治疗的受试者、以及特定的给药模式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的合成肽的量一般将是产生治疗效果的组合物的量。
利用合成肽治疗的方法
在此还提供了治疗患者的方法，这些方法包括向对其有需要的患者给予合成肽，例如，在此所描述的配制品。
可以按在此所描述的不同方法给予合成肽的适合受试者是哺乳动物，如例如人类、狗、猫、灵长类动物、牛、绵羊、马、猪等。
可以通过在此所描述的不同方法中的任一种向该受试者给予合成肽的示例性方法包括但不限于，静脉内(IV)、瘤内(IT)、病灶内(IL)、雾化、经皮、口服、内窥镜、局部、肌内(IM)、皮内(ID)、眼内(IO)、腹膜内(IP)、透皮(TD)、鼻内(IN)、脑内(IC)、器官内(例如肝内)、缓释植入物，或皮下给药，或经由使用渗透泵或机械泵给药。
适当地，合成肽在适合的诊断之后尽快给予，例如在数小时或数天之内。有待给予的合成肽的持续时间和量易于由本领域普通技术人员确定并且通常取决于肽和所治疗的疾病或障碍的类型。
如在此所描述，适当地这些不同方法是对哺乳动物受试者进行，该哺乳动物受试者是人类，包括任何年龄的成人和儿童。
在实施例中，治疗的方法包括治疗被诊断为患有糖尿病的患者，包括给予治疗有效量的如在此所描述的适合的合成肽，适当地是如在此所描述的合成GLP-1肽。
如在此使用的，术语“治疗有效量”是指合成肽或配制品的量，该量足以降低疾病或障碍(或其一种或多种症状)的严重性，改善此类疾病或障碍的一种或多种症状，防止这种疾病或障碍的进展，致使这种疾病或障碍的消退，或者增强或改善另一种疗法的一种或多种治疗效果。在一些实施例中，治疗有效量不能事先指定，并且可以由照护者(例如，由医师或其他医疗服务提供者)使用各种方式(例如剂量调整)确定。适当的治疗有效量还可以通过常规实验使用例如动物模型来确定。
在实施例中，提供了治疗被诊断为患有糖尿病的患者的方法，这些方法包括向患者给予治疗有效量的合成胰岛素。
如在此所描述，给予在此所描述的合成肽或配制品的适当方法是口服递送。如在此所描述，合成肽对以下项是实质上有抗性的：蛋白降解，即在口服给药之后在胃中被酶降解。
相关领域的普通技术人员容易清楚的将是在不背离任何这些实施例的范围的情况下，可以对在此描述的这些方法和应用做出其他适合的修改和适配。以下这些实例仅仅出于说明的目的被特此包括并不旨在是限制性的。
实例
实例1：蛋白水解抗性肽的化学合成和测试
1.引言
以下提供了用于制备如在此描述的蛋白水解抗性肽的示例性方法。2.缩写
Boc，叔丁氧基羰基；DIPEA，N,N-二异丙基乙胺；DMF，N,N-二甲基甲酰胺；DMSO，二甲亚砜；ESI，电喷雾电离；Fmoc，9-芴基甲氧基羰基；GIP，抑胃多肽；GLP-1，胰高血糖素样肽1；HCTU，O-(1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯；RP-HPLC，反相高效液相色谱法；EC50，半数最大(50％)有效浓度；LC/MS，与液相色谱联用的质谱；MeCN，乙腈；NMP，N-甲基吡咯烷酮；Pbf，2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；PBS，磷酸盐缓冲盐水；tBu，叔丁基；TFA，三氟乙酸；TIS，三异丙基硅烷；Tris，三(羟甲基)氨基甲烷；Trt，三苯基甲基；UV，紫外线。
3.实验
3.1肽合成
3.1.1材料
N-α-Fmoc-L-氨基酸获自瑞士巴亨公司(Bachem AG)。特殊氨基酸获自德国爱丽思生物技术有限公司(Iris Biotech AG)，或通过中国康龙化成(Pharmaron)制备。TGR(TentaGel Rink)和TGA(TentaGel Wang)合成树脂获自德国达姆施塔特市(Darmstadt)默克生物科学(Merck Biosciences)的诺瓦生物化学(Novabiochem)。使用该Fmoc/tBu方案通过自动化合成(PTI Prelude)制备所有肽。天冬酰胺(Asn)与谷氨酰胺(Gln)作为它们的侧链三苯甲基(Trt)衍生物掺入。色氨酸(Trp)与赖氨酸(Lys)作为它们的侧链Boc衍生物掺入。丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)与酪氨酸(Tyr)作为侧链tBu醚掺入，并且天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)作为它们的侧链OtBu酯掺入。精氨酸(Arg)作为侧链Pbf衍生物掺入。合成试剂获自英国多赛特(Dorset)的西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。溶剂以可获得的最高等级获自德国达姆施塔特市(Darmstadt)的默克公司(Merck)，并且未经进一步纯化而使用。
3.1.2用于包含α-甲基氨基酸的肽的化学合成的通用程序
除非另外说明，将所有肽在TGR树脂上制备为C-末端甲酰胺(最初取代0.24mmole/g)。在环境温度下，将所有氨基酸(天然和非天然两者)使用在NMP中的HCTU/DIPEA偶联，用乙酸酐和吡啶的溶液加帽残余官能团。在环境温度下，使用DMF中的哌啶(20％v/v)将Fmoc解封闭。
3.1.3线性肽的裂解和纯化
在环境温度下，伴随着搅拌，将粗肽通过使用TFA(95％v/v)、TIPS(2.5％v/v)、水(2.5％v/v)的混合物处理从树脂支持体上裂解。将裂解等分部分合并，通过旋转蒸发进行浓缩并且通过添加冷二乙醚进行沉淀，通过离心来分离固体。将粗肽在干氮流下干燥，在20％MeCN/水(v/v)中重构并过滤。经30分钟将粗肽使用安捷伦(Agilent)Polaris C8-A固定相(21.2x 250mm，5微米)、用从10％至70％MeCN(0.1％TFA v/v)于水(0.1％TFA v/v)中的线性溶剂梯度洗脱、使用Varian SD-1制备型星双泵系统、通过在210nm的UV吸收监测进行色谱分析。将含有所希望的肽的部分合并，冷冻(干冰/丙酮)并冻干。
3.1.4肽分析和表征(合成后)
通过单四极LC/MS、使用沃特斯质量Lynx 3100平台表征纯化的肽。在环境温度下，将分析物通过在沃特斯X-桥C18固定相(4.6x 100mm，3微米)上、使用10％-90％MeCN(0.1％TFA v/v)于水(0.1％TFA v/v)中的线性二元梯度以1.5mL min-1-经10分钟洗脱进行色谱分析。通过在210nm处的UV吸收以及通过使用沃特斯3100质量检测器(ESI+模式)的电离化两者检测分析物，该质量检测器对比计算的理论值验证分子量。使用安捷伦1260Infinity系统记录分析型RP-HPLC谱。在40℃下，将分析物通过在沃特斯Polaris C8-A固定相(4.6x100mm，3微米)上、以10％-90％MeCN(0.1％TFA v/v)于水(0.1％TFA v/v)中的线性二元梯度以1.5mL min-1经15分钟洗脱进行色谱分析。
4酶促裂解研究
4.1评价包含α-甲基残基的肽的蛋白水解抗性
评估以下可商购的纯化蛋白酶在已知有倾向的位点处裂解野生型肠降血糖素和经修饰的含有α-甲基氨基酸的肠降血糖素的能力。
表1：可商购的纯化蛋白酶的实例
中性肽链内切酶(脑啡肽酶)：将1.0μg rhNEP在900μL的测定缓冲液中重构，该测定缓冲液包括：50mM Tris、50mM NaCl、50mM NaHCO3，使用NaOH(1.0M)调节至pH 8.3。
胃蛋白酶：将1.0mg的来自猪胃粘膜的冻干胃蛋白酶在900μL的以下测定缓冲液中重构：10mM HCl，提供在pH 2.0下的0.4％(w/v)溶液。
胰蛋白酶：将1mg/mL来自猪胰腺的冻干胰蛋白酶的溶液在以下测定缓冲液中重构：50mM Tris、10mM CaCl2、150mM NaCl、1mM HCl，调节到pH 7.8。
胰凝乳蛋白酶：将1.0μg rhCTRC在900μL的以下测定缓冲液中重构：50mM Tris、10mM CaCl2、150mMNaCl、1mM HCl，调节至pH 7.8。
4.1.2程序
将用于评价的肽制备成于纯水、注射用无菌盐水(0.9％w/v NaCl/水)或1X PBS(达尔伯克(Dulbecco))中的浓度为1.0mg/mL的溶液。将100μL(100μg/mL肽)的这些溶液添加至900μL的每种蛋白酶溶液中。进行另外的实验，检验在暴露于血清和胃液过程中的蛋白降解。对于血清研究，将肽与50％雌性斯普拉-道来(Sprague-Dawley)品系大鼠血清(SD大鼠血清)进行孵育。对于胃液研究，将肽与新鲜大鼠胃液1:1(体积:体积)进行孵育。
将肽和酶(或血清或胃液)在37℃的温度调节水浴中共孵育实验的持续时间。在每个实验过程中，将100μL等分部分(10μg肽)的经孵育的肽-酶混合物周期性地取出，通过添加等体积的5％TFA(v/v)于1:1水/乙腈中淬灭，以阻滞蛋白水解活性，并且通过液相色谱-质谱法(LC/MS)：安捷伦Polaris C8-A柱(4.6x 100mm，3微米)、使用10％-90％MeCN(0.1％TFA v/v)于水(0.1％TFA v/v)中的线性二元梯度以1.5mL min-1经30分钟在环境温度下进行分析。通过在210nm处的UV吸收以及通过使用沃特斯3100质量检测器(ESI+模式)的电离化两者来检测分析物。将源自肽的酶促裂解的新肽种类(片段)进行后处理分析，并且使用它们的分子质量来鉴别精确的裂解位置(在每一情况下突出显示易断开的键)。
适当地针对生物学活性(例如，一种或多种细胞受体应答的刺激)，检测在此描述的合成GLP-1肽的生物活性/受体效价。通过标准方法在HEK293细胞或CHO细胞中产生表达人、小鼠、大鼠、或狗GLP-1受体(GLP-1R)、胰高血糖素受体(GCGR)或葡萄糖依赖性促胰岛素肽(抑胃多肽)受体(GIPR)的稳定细胞系。这些不同受体的肽活化导致下游的cAMP第二信使的累积，其可以在功能活性测定中测得。
使用“测定缓冲液”进行cAMP测定：测定缓冲液：在含有25mM HEPES的HBSS(西格玛公司(Sigma)编号H8264)中的0.1％BSA(西格玛公司编号A3059)，pH 7.4并且含有0.5mMIBMX(西格玛公司编号I7018)。
使用低蛋白结合的384孔板(格瑞纳公司(Greiner)编号781280)来进行制作在测定缓冲液中的测试样品的十一次1比5连续稀释。所有样品稀释度均制作一式两份。
将表达感兴趣受体的细胞的冻结的冷冻小瓶在水浴中迅速解冻，转移到预加温的测定缓冲液中并且在240xg旋转离心5分钟。以批次依赖性优化的浓度将细胞重新悬浮在测定缓冲液中(例如，hGCGR细胞为2x 105个细胞/ml，hGLP-1R和hGIPR细胞为1x 105个细胞/ml)。
从稀释板上将5μL重复样品压印到黑色浅孔u型底部的384孔板(康宁公司(Corning)编号3676)上。为此，添加5μL细胞悬液，并且将这些板在室温下孵育30分钟。
使用可商购的cAMP动态2HTRF试剂盒(Cisbio，目录号62AM4PEJ)，遵循按照制造商的建议的两步方案测定cAMP水平。简要地说，通过将抗cAMP穴状化合物(供体荧光团)和cAMP-d2(受体荧光团)各1/20稀释于提供在该试剂盒中的缀合与裂解缓冲液中而单独地将它们制成。将5μL抗cAMP穴状化合物添加到测定板的所有孔中，并且将5μL cAMP-d2添加到除了非特异性结合(NSB)孔之外的所有孔中，向其上添加缀合与裂解缓冲液。将这些板在室温下孵育一个小时，并且然后在易美逊(Envision)(珀金埃尔默(Perkin Elmer))上使用320nm的激发波长和620nm与665nm的发射波长进行读数。然后确定在cAMP测定中确定的合成肽的EC50值。
在用于确定生物活性/受体效价的另外的实验中，将具有人、小鼠或大鼠GCGR或GLP-1受体的稳定重组表达的CHO细胞在如上文的测定缓冲液中培养。在1x细胞冷冻培养基-DMSO无血清(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))中以1x 107或2x 107/小瓶制备冷冻保存细胞母液并且在-80℃下保存。将细胞在37℃迅速解冻，并且然后稀释在含有血清白蛋白(对于人、大鼠、和小鼠血清白蛋白分别为4.4％、3.2％和3.2％)的测定缓冲液(如上文的缓冲液)中。将肽连续稀释在100％DMSO中，并且然后按照规定的终浓度在含有血清白蛋白的测定缓冲液(如上文)中稀释100倍。然后将稀释的肽转移到384黑色浅孔微量滴定测定板中。将细胞添加到测定板上并且在室温孵育30分钟。孵育之后停止测定，并且按照制造商的指南使用可获自CisBio生物测定公司(CisBio Bioassays)的动力d2cAMP测定试剂盒测量cAMP水平。将板在珀金埃尔默的荧光读板仪上进行读数。人和大鼠血清白蛋白购自西格玛奥德里奇公司，而小鼠血清白蛋白购自Equitech生物有限公司。
如制造商的指南中所述将数据转化成％ΔF，并且通过4-参数逻辑拟合法进行分析以确定EC50值。所确定的EC50值取决于所测试的肽在重组细胞系中的GLP-1受体和胰高血糖素受体两者上的效价并且取决于该肽对血清白蛋白的亲和力，该亲和力决定游离肽的量。与血清白蛋白的结合增加所获得的EC50值。可基于cAMP产生随着SA浓度的变化来计算处于血浆浓度的白蛋白的游离肽的部分以及在0％血清白蛋白(SA)的EC50。为了比较在不同肽之间并且在经过不同的条件下在GLP-1R和GCGR上的活性的平衡，可使这些活性相关联，其中EC50与比较物肽的活性有关。
适当地针对生物学活性(例如，一种或多种细胞受体应答的刺激)，检测在此描述的合成GLP-1肽的生物活性/受体效价。通过标准方法在HEK293s或CHO细胞中产生表达人、小鼠、大鼠、或狗GLP-1受体(GLP-1R)、胰高血糖素受体(GCGR)或葡萄糖依赖性促胰岛素肽(抑胃多肽)受体(GIPR)的稳定细胞系。这些不同受体的肽活化导致下游的cAMP第二信使的产生，其可以在功能活性测定中测得。
使用“测定培养基”进行cAMP测定：
测定培养基：在DMEM(吉布科公司(Gibco)编号41966)中的10％FBS，含有0.5mM IBMX(西格玛公司(Sigma)编号I7018)。
使用低蛋白结合的384孔板(格瑞纳公司(Greiner)编号781280)来进行制作在测定培养基中的测试样品的十一次1比5连续稀释。所有样品稀释度均制作一式两份。
将表达感兴趣受体的细胞的冻结的冷冻小瓶在水浴中迅速解冻，转移到预加温的测定培养基中并且在240xg旋转离心5分钟。以优化的浓度将细胞重新悬浮在测定培养基中(例如，hGCGR细胞为1x 105个细胞/ml，hGLP-1R和hGIPR细胞为0.5x 105个细胞/ml)。
从稀释板上将5μL重复样品压印到黑色浅孔u型底部的384孔板(康宁公司(Corning)编号3676)上。为此，添加5μL细胞悬液，并且将这些板在室温下孵育30分钟。
使用可商购的cAMP动态2HTRF试剂盒(Cisbio，目录号62AM4PEJ)，遵循按照制造商的建议的两步方案测定cAMP水平。简要地说，通过将抗cAMP穴状化合物(供体荧光团)和cAMP-d2(受体荧光团)各1/20稀释于提供在该试剂盒中的缀合与裂解缓冲液中而单独地将它们制成。将5μL抗cAMP穴状化合物添加到测定板的所有孔中，并且将5μL cAMP-d2添加到除了非特异性结合(NSB)孔之外的所有孔中，向其上添加缀合与裂解缓冲液。将这些板在室温下孵育一个小时，并且然后在易美逊(Envision)(珀金埃尔默(Perkin Elmer))上使用320nm的激发波长和620nm与665nm的发射波长进行读数。然后确定在cAMP测定中确定的合成肽的EC50值。
在用于确定生物活性/受体效价的另外的实验中，将具有人、小鼠或大鼠GlucR或GLP-1受体的稳定重组表达的CHO细胞在DMEM 10％FBS和遗传霉素(100μg/ml)中培养。在1x细胞冷冻培养基-DMSO无血清(西格玛奥德里奇公司)中以2x 107/小瓶制备冷冻保存细胞母液并且在-80℃下保存。将细胞在37℃迅速解冻，并且然后稀释在含有血清白蛋白(对于人、大鼠、和小鼠血清白蛋白分别为4.4％、3.2％和3.2％)的测定缓冲液(DMEM)中。将肽连续稀释在DMSO中，然后按照规定的终浓度在含有血清白蛋白的DMEM中稀释100倍。然后将稀释的肽转移到384黑色浅孔微量滴定测定板中。将细胞添加到测定板上并且在室温孵育30分钟。孵育之后停止测定，并且按照制造商的指南使用可获自CisBio生物测定公司(CisBioBioassays)的动力d2cAMP测定试剂盒测量cAMP水平。将板在珀金埃尔默的荧光读板仪上进行读数。人和大鼠血清白蛋白购自西格玛奥德里奇公司，而小鼠血清白蛋白购自Equitech生物有限公司。
如制造商的指南中所述将数据转化成％ΔF，并且通过4-参数逻辑拟合法进行分析以确定EC50值。所确定的EC50值取决于所测试的肽在重组细胞系中的GLP-1受体和胰高血糖素受体两者上的固有效价并且取决于所述肽对血清白蛋白的亲和力，该亲和力决定游离肽的量。与血清白蛋白的结合增加所获得的EC50值。可基于cAMP产生随着HSA浓度的变化来计算处于血浆浓度的白蛋白的游离肽的部分以及在0％HSA的EC50。为了比较在不同肽之间并且在经过不同的条件下在GLP-1R和GlucR上的活性的平衡，可使这些活性相关联，其中EC50与比较物肽的活性有关。
4.1.3结果
胰高血糖素样肽1的酶促裂解的分析指明用于取代的适合的位点，如在图1中所示为Aib2、Phe6、Tyr13、Lys20、Phe22、Trp25、Lys28、以及Arg30。在下表2中示出的是一个示例性设计流，其展示用于开发一种如在此描述的合成的、胰高血糖素样肽1(GLP-1)的迭代，其中这些氨基酸位点连同其他被取代。应该认识到，这种设计流可以容易地应用于任何所希望的肽，以产生如所希望的蛋白酶保护肽。
表2
然后使用这些不同肽在暴露于选择蛋白酶之后的稳定性连同EC50测定来引导所希望的合成肽的选择。
图2A-2C示出对标准GLP-1比较物的脑啡肽酶稳定性研究的结果，针对该标准GLP-1比较物将经修饰的类似物的稳定性/效价进行比较，该标准GLP-1比较物为H-(Aib)2-EGT5FTSDV10SSYLE15GQAAK20EFIAW25LVKGR30(SEQ ID NO:4)。箭头展示原始峰的位置，以及在用该蛋白酶孵育之后的4小时、21小时和68小时处的降解。如所示的，快速降解发生在所有四种芳香族残基的氨基-末端，其中该肽经24小时被完全降解。
图3A-3D示出对合成GLP-1肽(H-(Aib)2-EG-(S)5-(α-MeF)6-TSDV10SS-(α-MeF)13-LE15GQAAK20E-(α-MeF)22-IA-(α-MeF)25LVKGR30，SEQ ID NO:38)的脑啡肽酶稳定性研究的结果。如所证明的，具有在位置Phe6、Tyr13、Phe22和Trp25处取代的α-甲基苯丙氨酸连同在位置5处用丝氨酸取代苏氨酸的合成GLP-1肽经96小时时程展示无蛋白降解。如在此描述进行的效力测量指示合成GLP-1肽与GLP-1比较物肽(SEQ ID NO:4)等效。
为了证明脑啡肽酶在该实验中仍然是活性的，在240小时之后添加GLP-1比较物肽(SEQ ID NO:4)。如图4A中所示，SEQ ID NO:38的GLP-1合成肽在10天之后仍是稳定的。(参见图4A-4D中的方框1。)在图4B-4D中，比较物肽的添加在仅1小时之后很快开始降解(参见方框2)，其中在24小时之前显著降解发生(参见方框3)。
图5A-5C示出对标准GLP-1比较物(SEQ ID NO:4)的胰凝乳蛋白酶稳定性研究的结果。箭头展示原始峰的位置，以及在用该蛋白酶孵育45分钟和2小时之后的降解。如所示的，快速降解发生在所有疏水残基的羧基-末端，其中该肽在45分钟之前被完全降解。
图6A-6C示出对合成GLP-1肽(SEQ ID NO:38)的胰凝乳蛋白酶稳定性研究的结果。如所证明的，合成GLP-1肽展示在48小时之前降解发生，其中仅仅在Leu26/Val27处观察到裂解。
图7A-7C示出对合成GLP-1肽(H-(Aib)2-EG-(S)5-(α-MeF)6-TSDV10SS-(α-MeF)13-LE15GQAA-(α-MeK)20E-(α-MeF)22-IA-(α-MeF)25-(V)26-V-(α-MeK)28-G-(G)30，SEQ ID NO:51)的胰凝乳蛋白酶稳定性研究的结果。如所证明的，用缬氨酸取代亮氨酸26导致合成GLP-1肽展示超过60小时的稳定性，而未观察到主要裂解产物。
图8A-8C示出对标准GLP-1比较物(SEQ ID NO:4)的胰蛋白酶稳定性研究的结果。在90分钟之前，快速蛋白降解发生在Lys20、Lys28和Arg30的羧基侧。
图9A-9C示出对合成GLP-1肽(SEQ ID NO:38)的胰蛋白酶稳定性研究的结果。如所证明的，合成GLP-1肽展示在90分钟之前降解发生在Lys20、Lys28和Arg30的羧基侧。
图10A-10C示出对合成GLP-1肽(SEQ ID NO:51)的胰蛋白酶稳定性研究的结果。如所证明的，Lys20和Lys28两者被α-甲基赖氨酸、Arg30被Gly30以及Leu26被Val26的取代导致合成GLP-1肽展示显著超过18小时的延长的稳定性。
图11A-11B示出对标准GLP-1比较物(SEQ ID NO:4)的血清稳定性研究的结果。快速蛋白降解发生在60小时之后，得到痕量完整肽，其中血清蛋白酶的显著自溶产生了肽片段，这些肽片段挡住了该谱图。
图12A-12B示出对合成GLP-1肽(SEQ ID NO:38)的血清稳定性研究的结果。在60小时之后，大约64％的肽保持完整，其中血清蛋白酶的自溶产生肽片段，这些肽片段挡住了该谱图。
图13A-13D示出对脂化的比较物GLP-1肽(H-(Aib)2-EGT5FTSDV10SSYLE15GQAAK20EFIAW25LVKGR30-(K-棕榈)，SEQ ID NO:5)以及一种脂化的、蛋白酶保护的GLP-1肽(H-(Aib)2-EG-(S)5-(α-MeF)6-TSDV10SS-(α-MeF)13-LE15GQAA-(α-MeK)20E-(α-MeF)22-IA-(α-MeF)25-(V)26-V-(α-MeK)28-G-(G)30-K(棕榈)，SEQ ID NO:52)的胃液稳定性研究的结果。该脂化的、蛋白酶保护的GLP-1蛋白的稳定性显著超过脂化的比较物的稳定性。
图14A-14E示出对一种可商购的GLP-1激动剂(利拉鲁肽，诺和诺德公司(NovoNordisk))的胃液稳定性研究的结果，如与该脂化的、蛋白酶抗性SEQ ID NO:52相比的。该脂化的、蛋白酶抗性的GLP-1肽的稳定性显著超过利拉鲁肽的稳定性。甚至进一步在示出放大谱图的图15A-15E中证明了稳定性的显著差异，指示该受保护的GLP-1肽(SEQ IDNO:52)随着时程几乎未改变的谱图。
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