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蛋白酶抗性肽.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201480067307.1 (22)申请日 2014.12.10 (30)优先权数据 61/915662 2013.12.13 US (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2016.06.08 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/EP2014/077240 2014.12.10 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2015/086686 EN 2015.06.18 (71)申请人 免疫医疗有限公司 地址 英国剑桥郡 (72)发明人 J.雷维尔M.贝纳雷 (74)专利代理

2、机构 中国专利代理(香港)有限公 司 72001 代理人 梁谋彭昶 (51)Int.Cl. C07K 14/62(2006.01) C07K 14/605(2006.01) C07K 14/575(2006.01) A61K 38/28(2006.01) A61K 38/26(2006.01) A61K 38/22(2006.01) A61P 3/10(2006.01) (54)发明名称 蛋白酶抗性肽 (57)摘要 本发明提供了蛋白酶抗性肽、 制备此类肽的 方法, 以及包括蛋白酶抗性肽的组合物和利用此 类肽进行治疗的方法。 已经确定在标准肽合成过 程中将 -甲基-官能化氨基酸经由在此所描述的

3、方法直接掺入主链中以产生蛋白酶抗性肽。 优选 的该 -甲基-官能化氨基酸是 -甲基-苯丙氨酸, 并且优选的该肽是胰高血糖素样肽(GLP-1)。 权利要求书3页 说明书28页 附图14页 CN 105849123 A 2016.08.10 CN 105849123 A 1.一种合成肽, 包括用 -甲基官能化氨基酸对天然氨基酸残基的至少一个取代, 其中 该合成肽维持与对应的不包括这些取代的合成肽基本上相同的受体效价和选择性。 2.如权利要求1所述的合成肽, 其中该至少一个 -甲基官能化氨基酸对应于被取代的 该天然氨基酸残基。 3.如权利要求1所述的合成肽, 其中该至少一个 -甲基官能化氨基酸选自下

4、组, 该组由 以下各项组成: -甲基组氨酸、 -甲基丙氨酸、 -甲基异亮氨酸、 -甲基精氨酸、 -甲基亮氨 酸、 -甲基天冬酰胺、 -甲基赖氨酸、 -甲基天冬氨酸、 -甲基甲硫氨酸、 -甲基半胱氨酸、 -甲基苯丙氨酸、 -甲基谷氨酸、 -甲基苏氨酸、 -甲基谷氨酰胺, -甲基色氨酸、 -甲基甘 氨酸、 -甲基缬氨酸、 -甲基鸟氨酸、 -甲基脯氨酸、 -甲基硒代半胱氨酸、 -甲基丝氨酸以 及 -甲基酪氨酸。 4.如权利要求1-3中任一项所述的合成肽, 其中该合成肽对蛋白降解是实质上有抗性 的。 5.如权利要求4所述的合成肽, 其中该合成肽对DPP-IV、 脑啡肽酶、 胰凝乳蛋白酶、 纤溶 酶、

5、凝血酶、 激肽释放酶、 胰蛋白酶、 弹性蛋白酶和/或胃蛋白酶降解是实质上有抗性的。 6.如权利要求1-5中任一项所述的合成肽, 其中该天然氨基酸残基是对蛋白水解裂解 敏感的位点。 7.如权利要求1-6中任一项所述的合成肽, 其中该肽是肠降血糖素类肽。 8.如权利要求7所述的合成肽, 其中该肽选自下组, 该组由以下各项组成: 胰高血糖素 样肽1(GLP-1)、 葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)、 艾塞那肽加胰高血糖素、 促胰液素、 腱调蛋 白、 胃泌酸调节素和血管活性肠肽(VIP)。 9.如权利要求1所述的合成肽, 其中该肽是胰岛素。 10.一种包括用 -甲基官能化氨基酸对天然氨基酸残基的至少三

6、个取代的合成GLP-1 肽, 其中该合成GLP-1肽维持与对应的不包括这些取代的合成GLP-1肽基本上相同的受体效 价。 11.如权利要求10所述的合成GLP-1肽, 其中该至少三个 -甲基官能化氨基酸是 -甲基 苯丙氨酸。 12.如权利要求10所述的合成GLP-1肽, 包括四个 -甲基官能化氨基酸。 13.如权利要求12所述的合成GLP-1肽, 其中该四个 -甲基官能化氨基酸是在Phe6、 Try13、 Phe22和Trp25位置处取代的 -甲基苯丙氨酸。 14.如权利要求10-13中任一项所述的合成GLP-1肽, 进一步包括在位置2(Aib2)处的氨 基异丁酸取代。 15.如权利要求10-

7、14中任一项所述的合成GLP-1肽, 进一步包括在位置5(Ser5)处的丝 氨酸修饰。 16.如权利要求10-15中任一项所述的合成GLP-1肽, 进一步包括在位置Lys20和Lys28 处取代的 -甲基赖氨酸。 17.如权利要求10-16中任一项所述的合成GLP-1肽, 进一步包括取代亮氨酸26的缬氨 酸。 18.如权利要求10-17中任一项所述的合成GLP-1肽, 进一步包括C-末端脂化。 19.如权利要求10-18中任一项所述的合成GLP-1肽, 其中该合成GLP-1肽对蛋白降解是 权利要求书 1/3 页 2 CN 105849123 A 2 实质上有抗性的。 20.如权利要求19所述的

8、合成GLP-1肽, 其中该合成GLP-1肽对DPP-IV、 脑啡肽酶、 胰凝 乳蛋白酶、 纤溶酶、 凝血酶、 激肽释放酶、 胰蛋白酶、 弹性蛋白酶和/或胃蛋白酶降解是实质 上有抗性的。 21.一种制备合成肽的方法, 该方法包括: a.在该肽中鉴别用于取代的至少一个天然氨基酸残基; 并且 b.用 -甲基官能化氨基酸取代所鉴别的天然氨基酸残基, 其中该合成肽维持与对应的不包括该取代的合成肽基本上相同的受体效价和选择性, 并且 其中该合成肽对蛋白降解是实质上有抗性的。 22.如权利要求21所述的方法, 其中该取代的 -甲基官能化氨基酸对应于该被取代的 天然氨基酸残基。 23.如权利要求21所述的方法

9、, 其中该取代的 -甲基官能化氨基酸是 -甲基苯丙氨酸。 24.如权利要求21-23中任一项所述的方法, 其中该合成肽对DPP-IV、 脑啡肽酶、 胰凝乳 蛋白酶、 纤溶酶、 凝血酶、 激肽释放酶、 胰蛋白酶、 弹性蛋白酶和/或胃蛋白酶降解是实质上 有抗性的。 25.如权利要求21所述的方法, 其中该鉴别包括鉴别在对酶促裂解敏感的位点处的氨 基酸。 26.如权利要求21所述的方法, 其中该肽是肠降血糖素类肽。 27.如权利要求26所述的方法, 其中该肽选自下组, 该组由以下各项组成: 胰高血糖素 样肽1(GLP-1)、 胰高血糖素、 葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)、 以及艾塞那肽。 28.如

10、权利要求21所述的方法, 其中该肽是胰岛素。 29.一种制备蛋白水解性稳定的肽的方法, 该方法包括: a.将肽暴露于一种或多种蛋白酶; b.鉴别是对蛋白水解裂解敏感的位点的至少一个天然氨基酸残基; 并且 c.用 -甲基官能化氨基酸取代所鉴别的氨基酸残基, 其中该合成肽维持与对应的不包括该取代的合成肽基本上相同的受体效价和选择性, 并且 其中该合成肽对蛋白降解是实质上有抗性的。 30.如权利要求29所述的方法, 其中该取代的 -甲基官能化氨基酸对应于该被取代的 天然氨基酸残基。 31.如权利要求29所述的方法, 其中该取代的 -甲基官能化氨基酸是 -甲基苯丙氨酸。 32.如权利要求29-31中任

11、一项所述的方法, 其中该合成肽对DPP-IV、 脑啡肽酶、 胰凝乳 蛋白酶、 纤溶酶、 凝血酶、 激肽释放酶、 胰蛋白酶、 弹性蛋白酶和/或胃蛋白酶降解是实质上 有抗性的。 33.如权利要求32所述的方法, 其中该肽是肠降血糖素类肽。 34.如权利要求33所述的方法, 其中该肽选自下组, 该组由以下各项组成: 胰高血糖素 样肽1(GLP-1)、 葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)、 以及艾塞那肽。 35.如权利要求29所述的方法, 其中该肽是胰岛素。 权利要求书 2/3 页 3 CN 105849123 A 3 36.一种治疗患者的方法, 该方法包括向该患者给予药学上有效量的如权利要求1所述 的

12、合成肽。 37.一种治疗被诊断为患有糖尿病的患者的方法, 该方法包括向该患者给予治疗有效 量的如权利要求10所述的合成GLP-1肽。 38.一种治疗被诊断为患有糖尿病的患者的方法, 该方法包括向该患者给予治疗有效 量的如权利要求9所述的合成胰岛素。 39.如权利要求36-38中任一项所述的方法, 其中该给予是口服。 40.一种合成GLP-1肽, 包括以下氨基酸序列: R1-His-X1-Glu-Gly-X2-X3-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-X4-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- Ala-X5-Glu-X6-Ile-Ala-X7-X8-X9-X10-X11-X12-

13、R2(SEQIDNO:2), 其中: R1是Hy、 Ac或pGlu; R2是-NH2或-OH; X1是Ala、 Aib、 Pro或Gly; X2是Thr、 Pro或Ser; X3是Aib、 Bip、 , -Dip、 F5-Phe、 Phe、 PhG、 Nle、 高Phe、 高Tyr、 N-MePhe、 -MePhe、 -Me- 2F-Phe、 Tyr、 Trp、 Tyr-OMe、 4I-Phe、 2F-Phe、 3F-Phe、 4F-Phe、 1-NaI、 2-NaI、 Pro或二- , - Me-Phe; X4是Aib、 Ala、 Asp、 Arg、 Bip、 Cha、 , -Dip、 Gl

14、n、 F5-Phe、 PhG、 Nle、 高Phe、 高Tyr、 - MePhe、 -Me-2F-Phe、 Phe、 Thr、 Trp、 Tyr-OMe、 4I-Phe、 2F-Phe、 3F-Phe、 4F-Phe、 Tyr、 1-NaI、 2-NaI、 Pro或二- , -Me-Phe; X5是Aib、 Lys、 D-pro、 Pro或 -MeLys; X6是Aib、 Asp、 Arg、 Bip、 Cha、 Leu、 Lys、 2Cl-Phe、 3Cl-Phe、 4Cl-Phe、 PhG、 高Phe、 2Me- Phe、 3Me-Phe、 4Me-Phe、 2CF3-Phe、 3CF3-P

15、he、 4CF3-Phe、 -Phe、 -MePhe、 D-phe、 4I-Phe、 3I- Phe、 2F-Phe、 , -Dip、 -Ala、 Nle、 Leu、 F5-Phe、 高Tyr、 -MePhe、 -Me-2F-Phe、 Ser、 Tyr、 Trp、 Tyr-OMe、 3F-Phe、 4F-Phe、 Pro、 1-NaI、 2-NaI或二- , -Me-Phe; X7是Aib、 Arg、 Bip、 Cha、 , -Dip、 F5-Phe、 PhG、 Phe、 Tyr、 高Phe、 高Tyr、 -MePhe、 -Me- 2F-Phe、 2Me-Phe、 3Me-Phe、 4Me-P

16、he、 Nle、 Tyr-OMe、 4I-Phe、 1-NaI、 2-NaI、 2F-Phe、 3F-Phe、 4F-Phe、 Pro、 N-MeTrp、 -MeTrp或二- , -Me-Phe; X8是Aib、 Ala、 Arg、 Asp、 Glu、 Nle、 Pro、 Ser、 N-MeLeu、 -MeLeu或Val; X9是Aib、 Glu、 Lys、 -MeVal或Pro; X10是Aib、 Glu、 -MeLys或Pro; X11是Aib、 Glu、 Pro或Ser; 并且 X12是Aib、 Gly、 Glu、 Pro或 -MeArg。 权利要求书 3/3 页 4 CN 105849

17、123 A 4 蛋白酶抗性肽 发明背景 发明领域 0001 本发明提供了蛋白酶抗性肽、 制备此类肽的方法, 以及包括蛋白酶抗性肽的组合 物和利用此类肽进行治疗的方法。 在标准肽合成过程中将 -甲基-官能化氨基酸经由在此 所描述的方法直接掺入主链中。 背景技术 0002 长效肽疗法的开发受以下因素阻碍, 例如短血浆半衰期和口服生物利用度较差, 主要是肽对酶降解的天然敏感性的结果。 大部分蛋白水解功能是必要的, 包括调节基本的 生物分子过程, 例如关闭在细胞表面的肽信号传导事件、 或蛋白和肽在消化过程中的胃分 解。 因此, 负责蛋白酶的活性不能简单地被抑制, 同时在许多情况下不引起其他代谢紊乱。

18、0003 因此为了克服降解, 增强感兴趣的肽的酶抗性是令人希望的。 通常, 利用两个主要 方法来增强酶抗性: 序列特异性修饰, 即影响肽本身的一级结构的那些; 以及整体有效修 饰, 即改变肽的某些总体物理化学特征的那些。 策略上引入的此类修饰可以降低自然生理 过程的影响, 否则这些过程就会消除或失活其作用令人希望的肽, 例如酶降解和/或通过肾 超滤的清除。 0004 序列特异修饰包括抗蛋白水解的特殊氨基酸的掺入, 或更复杂的修饰, 包括天然 存在的侧链功能之间的环化例如二硫键形成(Cys-Cys)、 或内酰胺化(Lys-Glu或Lys-Asp)。 另外的修饰包括在肽主链之内的非天然氨基酸替代物

19、之间的环化, 例如烯烃复分解钉合 (stapling)。 0005 整体修饰包括过程如肽脂化, 例如棕榈酰化和/或聚乙二醇化。 棕榈酰化具有产生 肽的循环储器的作用, 该肽在血液血清中与天然丰富的白蛋白微弱地缔合。 与白蛋白缔合 的肽有效地逃过肾超滤, 因为缔合的复合物的尺寸高于肾小球滤过截取值。 当该肽从白蛋 白的表面解离时, 其再次游离, 以便与内源受体相互作用。 聚乙二醇化具有物理地屏蔽肽免 于蛋白水解的作用并赋予显著亲水性, 当水合时所述亲水性大大增加治疗性分子的流体动 力学半径以克服肾清除。 然而, 脂化和聚乙二醇化对主要肽链针对蛋白水解的敏感性均不 具有显著影响。 0006 虽然这

20、些技术总体上可以广泛适用于治疗性肽, 并在某一程度能够延伸循环半衰 期, 但仍然存在着对于增加肽和蛋白质对酶降解的稳定性的方法的需要, 特别是鉴于产生 可口服给予的肽的期望时。 发明概述 0007 通篇描述了满足上述需要的实施例。 0008 在一个实施例中, 提供了合成肽, 该合成肽包括用 -甲基官能化氨基酸对天然氨 基酸残基的至少一个取代。 适当地, 该合成肽维持与对应的不包括任何取代的合成肽基本 上相同的受体效价和选择性。 说明书 1/28 页 5 CN 105849123 A 5 0009 在实施例中, 该至少一个 -甲基官能化氨基酸对应于被取代的该天然氨基酸残 基。 适当地, 该至少一

21、个 -甲基官能化氨基酸包括 -甲基组氨酸、 -甲基丙氨酸、 -甲基异 亮氨酸、 -甲基精氨酸、 -甲基亮氨酸、 -甲基天冬酰胺、 -甲基赖氨酸、 -甲基天冬氨酸、 -甲基甲硫氨酸、 -甲基半胱氨酸、 -甲基苯丙氨酸、 -甲基谷氨酸、 -甲基苏氨酸、 -甲基 谷氨酰胺, -甲基色氨酸、 -甲基甘氨酸、 -甲基缬氨酸、 -甲基鸟氨酸、 -甲基脯氨酸、 - 甲基硒代半胱氨酸、 -甲基丝氨酸和/或 -甲基酪氨酸。 0010 在实施例中, 该合成肽对蛋白降解, 包括例如DPP-IV、 脑啡肽酶、 胰凝乳蛋白酶、 纤 溶酶、 凝血酶、 激肽释放酶、 弹性蛋白酶、 胰蛋白酶和/或胃蛋白酶降解是实质上有抗性的

22、。 0011 适当地, 该天然氨基酸残基是对蛋白水解裂解敏感的位点。 0012 在实施例中, 该肽是一种肠降血糖素类肽, 包括但不限于, 胰高血糖素样肽1(GLP- 1)、 葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)、 艾塞那肽(exenatide)加胰高血糖素、 促胰液素、 腱调 蛋白、 胃泌酸调节素和血管活性肠肽(VIP)。 0013 在其他实施例中, 该肽是胰岛素。 0014 在另外的实施例中, 提供了一种GLP-1肽, 该GLP-1肽适当地包括用 -甲基官能化 氨基酸对天然氨基酸残基的至少三个取代, 其中该合成GLP-1肽维持与对应的不包括这些 取代的合成GLP-1肽基本上相同的受体效价和选择性

23、。 在实施例中, 至少三个、 或至少四个 -甲基官能化氨基酸是 -甲基苯丙氨酸。 适当地, 该 -甲基官能化氨基酸是在位置Phe6、 Try13、 Phe22和Trp25处取代的 -甲基苯丙氨酸。 0015 适当地, 这些GLP-1肽进一步包括在位置2(Aib2)处的氨基异丁酸取代、 在位置5 (Ser5)处的丝氨酸修饰、 在位置20( -MeLys20)和28( -MeLys28)处取代的 -甲基赖氨酸、 位置26(Val26)处的缬氨酸修饰、 和/或羧基末端脂化或聚乙二醇化。 0016 还提供了制备合成肽的方法, 这些方法包括在肽中鉴别用于取代的至少一种天然 氨基酸残基, 并且用 -甲基官

24、能化氨基酸取代所鉴别的天然氨基酸残基。 其中该合成肽维 持与对应的不包括该取代的合成肽基本上相同的受体效价和选择性, 并且其中该合成肽对 蛋白降解是实质上有抗性的。 0017 在另外的实施例中, 提供了制备一种蛋白水解性稳定的肽的方法, 这些方法包括 将肽暴露于一种或多种蛋白酶、 鉴别是对蛋白水解裂解敏感的位点的至少一个天然氨基酸 残基, 并且用 -甲基官能化氨基酸取代所鉴别的氨基酸残基。 其中该合成肽维持与对应的 不包括该取代的合成肽基本上相同的受体效价和选择性, 并且其中该合成肽对蛋白降解是 实质上有抗性的。 0018 还提供了治疗患者的方法, 这些方法包括给予药学上有效量的如在此描述的合

25、成 肽。 0019 在其他实施例中, 提供了一种包括以下氨基酸序列的合成GLP-1肽: R1-His-X1-Glu-Gly-X2-X3-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-X4-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- Ala-X5-Glu-X6-Ile-Ala-X7-X8-X9-X10-X11-X12-R2(SEQIDNO:2), 其中: R1是Hy、 Ac或pGlu; R2是-NH2或OH; X1是Ala、 Aib、 Pro或Gly; X2是Thr、 Pro或Ser; 说明书 2/28 页 6 CN 105849123 A 6 X3是Aib、 Bip、 , -Dip、 F5-P

26、he、 Phe、 PhG、 Nle、 高Phe、 高Tyr、 N-MePhe、 -MePhe、 -Me- 2F-Phe、 Tyr、 Trp、 Tyr-OMe、 4I-Phe、 2F-Phe、 3F-Phe、 4F-Phe、 1-NaI、 2-NaI、 Pro或二- , - MePhe; X4是Aib、 Ala、 Asp、 Arg、 Bip、 Cha、 , -Dip、 Gln、 F5-Phe、 PhG、 Nle、 高Phe、 高Tyr、 - MePhe、 -Me-2F-Phe、 Phe、 Thr、 Trp、 Tyr-OMe、 4I-Phe、 2F-Phe、 3F-Phe、 4F-Phe、 Tyr

27、、 1-NaI、 2-NaI、 Pro、 二- , -MePhe、 -MeTyr或二- , -MeTyr; X5是Aib、 Lys、 D-pro、 Pro或 -MeLys或二- , -MeLys; X6是Aib、 Asp、 Arg、 Bip、 Cha、 Leu、 Lys、 2Cl-Phe、 3Cl-Phe、 4Cl-Phe、 PhG、 高Phe、 2Me- Phe、 3Me-Phe、 4Me-Phe、 2CF3-Phe、 3CF3-Phe、 4CF3-Phe、 -Phe、 -MePhe、 D-phe、 4I-Phe、 3I- Phe、 2F-Phe、 , -Dip、 -Ala、 Nle、 Le

28、u、 F5-Phe、 高Tyr、 -MePhe、 -Me-2F-Phe、 Ser、 Tyr、 Trp、 Tyr-OMe、 3F-Phe、 4F-Phe、 Pro、 1-NaI、 2-NaI或二- , -MePhe; -MeTyr、 二- , -MeTyr、 -MeTrp或二- , -MeTyr; X7是Aib、 Arg、 Bip、 Cha、 , -Dip、 F5-Phe、 PhG、 Phe、 Tyr、 高Phe、 高Tyr、 -MePhe、 -Me- 2F-Phe、 2Me-Phe、 3Me-Phe、 4Me-Phe、 Nle、 Tyr-OMe、 4I-Phe、 1-NaI、 2-NaI、 2

29、F-Phe、 3F-Phe、 4F-Phe、 Pro、 N-MeTrp、 -MeTrp、 二- , -MeTrp、 二- , -Me-Phe; -MeTyr或二- , -MeTyr; X8是Aib、 Ala、 Arg、 Asp、 Glu、 Nle、 Pro、 Ser、 N-MeLeu、 -MeLeu、 Val或 -MeVal; X9是Aib、 Glu、 Lys、 Pro、 -MeVal或 -MeLeu; X10是Aib、 Glu、 Lys、 Pro或 -MeLys; X11是Aib、 Glu、 Pro或Ser; 并且 X12是Aib、 Gly、 Glu、 Lys、 Pro、 -MeArg或 -

30、MeLys。 0020 参照附图, 下文详细地描述了这些实施例的另外的实施例、 特征、 和优点, 连同不 同实施例的结构和操作。 附图简要说明 0021 图1示出胰高血糖素样肽1(GLP-1)中的氨基酸取代的示例性位点。 (SEQIDNO:3) 0022 图2A-2C示出GLP-1比较物的脑啡肽酶降解。 0023 图3A-3D示出根据在此描述的实施例的合成GLP-1蛋白暴露于脑啡肽酶的稳定性。 0024 图4A-4D示出在暴露于脑啡肽酶240小时后根据在此描述的实施例的合成GLP-1蛋 白的稳定性。 0025 图5A-5C示出GLP-1比较物的胰凝乳蛋白酶降解。 0026 图6A-6D示出根据

31、在此描述的实施例的合成GLP-1蛋白暴露于胰凝乳蛋白酶的稳 定性。 0027 图7A-7D示出根据在此描述的实施例的合成GLP-1蛋白暴露于胰凝乳蛋白酶的稳 定性。 0028 图8A-8C示出GLP-1比较物的胰蛋白酶降解。 0029 图9A-9C示出根据在此描述的实施例的合成GLP-1蛋白暴露于胰蛋白酶的稳定性。 0030 图10A-10C示出根据在此描述的实施例的合成GLP-1蛋白暴露于胰蛋白酶的稳定 性。 0031 图11A-11B示出GLP-1比较物的血清降解。 0032 图12A-12B示出根据在此描述的实施例的合成GLP-1蛋白暴露于血清的稳定性。 说明书 3/28 页 7 CN

32、105849123 A 7 0033 图13A-13D示出脂化的比较物和脂化的根据在此描述的实施例的合成GLP-1蛋白 暴露于胃液的稳定性。 0034 图14A-14E示出可商购的GLP-1蛋白和根据在此描述的实施例的合成GLP-1蛋白暴 露于胃液的稳定性研究。 0035 图15A-15E示出一种放大的谱图, 其证明可商购的GLP-1肽和根据在此描述的实施 例的合成GLP-1肽暴露于胃液的稳定性研究。 发明详述 0036 应该领会的是在此展示和描述的这些具体的实现方式是实例, 并且不旨在以任何 方式在其他方面限制本申请的范围。 0037 在此提及的这些公开的专利、 专利申请、 网站、 公司名称

33、、 以及科学文献特此以其 全文形式通过引用而结合, 达到如同每个被确切并单独地表明而通过引用结合的相同程 度。 在此引用的任何参考文件与本说明书的具体传授之间的任何冲突应以有利于后者的方 式来解决。 同样, 在单词或短语的领域理解的定义与如在本说明书中确切传授的该单词或 短语的定义之间的任何冲突应以有利于后者的方式来解决。 0038 如在本说明书中所使用, 单数形式 “一个/种(a, an)” 以及 “该” 具体地还涵盖它们 所提及的术语的复数形式, 除非本内容清楚地另外指明。 在此使用术语 “约” 以意指大约 (approximately)、 在的附近(intheregionof)、 粗略地

34、(roughly)、 或左右 (around)。 当术语 “约” 与一个数值范围结合使用时, 它通过扩展列举的数值的上限和下限 将该范围加以修饰。 通常, 在此使用术语 “约” 以将一个数值以高于和低于该规定值的20 的变化加以修饰。 0039 在此使用的技术术语和科学术语具有由本申请涉及的领域的普通技术人员通常 理解的含义, 除非另外定义。 在此参考了本领域的普通技术人员已知的不同方法和材料。 陈 述肽合成的一般原理的标准参考包括W.C.钱(W.C.Chan)和P.D.怀特(P.D.White).,“Fmoc 固相肽合成: 实用方法” ( “FmocSolidPhasePeptideSynt

35、hesis:APractical Approach” ), 牛津大学出版社(OxfordUniversityPress), 牛津(Oxford)(2004)。 0040 术语 “多肽” 、“肽” 、“蛋白质” 以及 “蛋白质片段” 在此可以互换使用以便表示氨基 酸残基的聚合物。 这些术语适用于氨基酸聚合物, 其中一个或多个氨基酸残基是一种对应 的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物, 并且适用于天然存在的氨基酸聚合物以及非天然 存在的氨基酸聚合物。 0041 术语 “氨基酸” 是指天然存在的以及合成的氨基酸, 连同与天然存在的氨基酸功能 类似的氨基酸类似物以及氨基酸模拟物。 天然存在的氨基酸是通过

36、遗传密码编码的那些氨 基酸, 以及随后被修饰的那些氨基酸, 例如羟脯氨酸、 -羧基谷氨酸盐、 以及O-磷酸丝氨 酸。 氨基酸类似物是指以下化合物, 这些化合物具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学 结构, 例如与氢相结合的碳、 羰基基团、 氨基基团、 以及R基团, 例如高丝氨酸、 正亮氨酸、 甲 硫氨酸亚砜、 甲硫氨酸甲基锍。 这些类似物能具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰 的肽骨架, 但保留了与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。 氨基酸模拟物是指以下化学 化合物, 这些化合物具有不同于通常的氨基酸的化学结构的、 但与天然存在的氨基酸的功 能相类似的结构。 术语 “氨基酸” 和 “氨基酸

37、残基” 通篇可互换地使用。 0042 在合成主要肽链之后, 旨在改进肽的代谢稳定性的大部分的化学修饰涉及另外的 说明书 4/28 页 8 CN 105849123 A 8 化学操作, 例如内酰胺化、 二硫键闭合、 脂化或聚乙二醇化。 此类修饰常常是耗时的并且很 可能显著地增加任何产物的最终商品成本。 0043 如在此所描述的, 在标准肽合成期间, -甲基-官能化氨基酸直接掺入主链中使得 在此描述的方法更简单并易于进行大规模制备。 关于天然螺旋的肽(例如肠降血糖素类, 如 在此所描述的, 包括GLP-1、 胰高血糖素、 GIP、 VIP和促胰液素)的化学合成, 认为 -甲基氨基 酸的天然转角诱导

38、效应改进了肽在合成过程中的粗品产量。 0044 如在此所描述的, -甲基氨基酸在合成肽的合成过程中在所希望的一个或多个位 点处被策略性地掺入。 经修饰的氨基酸允许肽保持天然侧链官能性, 这常常对肽的受体效 价是关键的。 0045 在此提供了解决肽的天然酶倾向性的组合物和方法。 通过用 -甲基官能化氨基酸 的位点特异性掺入来屏蔽敏感位点(例如, 易裂开的键), 提供了如下肽, 其证明对酶降解增 加的抗性, 同时仍然保持与野生型肽基本上相同的受体效价和选择性。 证明蛋白酶抗性的合成肽 0046 在实施例中, 提供了包括用 -甲基官能化氨基酸对天然氨基酸残基的至少一个取 代的合成肽。 在其他实施例中

39、, 提供了包括用 -甲基官能化氨基酸对天然氨基酸残基的至 少两个取代的合成肽。 0047 如在此所描述的,“合成肽” 是指氨基酸残基的聚合物, 其已经通过将一个氨基酸 的羧基基团或C-末端化学偶联至另一个氨基酸的氨基基团或N-末端而产生。 化学肽合成在 肽的C-末端开始并且在N-末端结束。 用于肽合成以产生合成肽的各种方法是本领域熟知 的。 0048 如在此所描述的,“ -甲基官能化氨基酸” 是指如下氨基酸, 其中该氨基酸的第一 ()碳原子包括结合至该 碳的一个甲基基团(CH3)取代基。 -甲基官能化氨基酸包括含这 种官能化的二十一种氨基酸中的任一者。 0049 如通篇所述, -甲基官能化氨基

40、酸可以取代, 即, 可以替换肽中的任何天然氨基 酸。“天然” 氨基酸是指存在于天然肽或野生型肽中的氨基酸, 其将被取代。 0050 取代是指用 -官能化氨基酸替换天然氨基酸。 在合成肽的化学合成过程中, 该天 然氨基酸可以容易地被 官能化氨基酸所替换。 0051 虽然在此描述的合成肽可以是任何长度的, 即, 长度是任意数目的氨基酸, 适当 地, 合成肽的长度是近似约5个氨基酸至约200个氨基酸, 长度适当地是约10个氨基酸至约 150个氨基酸, 长度是约20个氨基酸至约100个氨基酸, 长度是约30个氨基酸至约75个氨基 酸, 或长度是约20个氨基酸、 约30个氨基酸、 约40个氨基酸、 约5

41、0个氨基酸、 约60个氨基酸、 约70个氨基酸、 约80个氨基酸、 约90个氨基酸或约100个氨基酸。 0052 如通篇所述, 在此描述的包含取代天然氨基酸的一种或多种 -官能化氨基酸的合 成肽维持与对应的不包括这些取代的合成肽基本上相同的受体效价和选择性。 在一些情况 下, 这些合成肽包含取代天然氨基酸的两个或更多个 -官能化氨基酸。 0053 术语 “受体效价” 是指肽的半数最大(50)有效浓度(EC50)的倒数。 EC50是指肽在 指定的暴露时间之后诱导介于对于肽的选定靶标的基线应答与最大应答之间的一半的生 物应答的浓度。 因此, 表现出小的EC50值的肽具有相应高的受体效价, 然而表现

42、出大的EC50 值的肽具有相应低的受体效价, 即诱导与受体相关的应答所需要的肽越多, 该肽对该受体 说明书 5/28 页 9 CN 105849123 A 9 的效价就越小。 0054 用于确定受体效价和EC50的方法是本领域中已知的并且适当地涉及确定一种或多 种细胞受体应答的刺激。 例如, 通过标准方法产生表达GLP-1受体(GLP-1R)、 胰高血糖素受 体(GCGR)或葡萄糖依赖性促胰岛素肽(抑胃多肽)受体(GIPR)的合适的细胞系。 这些不同受 体的肽活化导致下游的cAMP第二信使的产生, 其可以在功能活性测定中测得。 从这些测量, EC50值可容易地确定。 0055 如通篇所述, 包

43、括 -官能化氨基酸的一个或多个取代的合成肽(在此也称为 “经取 代的肽” )维持与对应的不包括取代的合成肽 “基本上相同的” 受体效价。 如在此所使用,“基 本上相同的” 当是指受体效力时意指当将这些经取代的肽与不包含任何取代并且最好包含 原始的未经修饰的野生型序列、 或其他适合的比较物序列(即对照)的肽的受体效价进行比 较时, 这些经取代的肽表现出适当地约75的受体效价。 在另外的实施例中, 当将经取代的 肽与不包含任何取代并且最好包含原始的未经修饰的野生型序列、 或其他适合的比较物序 列(即对照)的肽的受体效价进行比较时, 这些经取代的肽表现出适当地约80的受体效 价、 或约85的受体效价

44、、 或约90的受体效价、 或约91的受体效价、 或约92的受体效 价、 或约93的受体效价、 或约94的受体效价、 或约95的受体效价、 或约96的受体效 价、 或约97的受体效价、 或约98的受体效价、 或约99的受体效价、 或约99.1的受体 效价、 或约99.2的受体效价、 或约99.3的受体效价、 或约99.4的受体效价、 或约 99.5的受体效价、 或约99.6的受体效价、 或约99.7的受体效价、 或约99.8的受体效 价、 或约99.9的受体效价、 或适当地约100的受体效价。 0056 如通篇所述, 包括 -官能化氨基酸的一个或多个取代的合成肽还适当地维持与对 应的不包括这些取

45、代的合成肽 “基本上相同的选择性” 。 如在此所使用,“选择性” 是指肽结 合其靶标(即激动剂, 该肽其被设计成结合至激动剂), 同时不结合至其他非靶标蛋白的能 力。 适当地, 当将经取代的肽与不包含任何取代并最好包含原始的未经修饰的野生型序列、 或其他适合的比较物序列(即对照)的肽的受体效价进行比较时, 这些经取代的肽表现出 “基本上相同的选择性” 并从而表现出约75的选择性。 在另外的实施例中, 当将经取代的 肽与不包含任何取代并且最好包含原始的未经修饰的野生型序列、 或其他适合的比较物序 列(即对照)的肽的选择性进行比较时, 这些经取代的肽表现出适当地约80的选择性、 或 约85的选择性

46、、 或约90的选择性、 或约91的选择性、 或约92的选择性、 或约93的 选择性、 或约94的选择性、 或约95的选择性、 或约96的选择性、 或约97的选择性、 或 约98的选择性、 或约99的选择性、 或约99.1的选择性、 或约99.2的选择性、 或约 99.3的选择性、 或约99.4的选择性、 或约99.5的选择性、 或约99.6选择性的、 或约 99.7的选择性、 或约99.8的选择性、 或约99.9的选择性、 或适当地约100的选择性。 0057 适当地, 该 -甲基官能化氨基酸对应于野生型蛋白中的被取代的天然氨基酸。 也 就是说, 原始的野生型肽序列中的氨基酸被具有相同侧链的

47、-甲基官能化氨基酸取代。 换 言之, 例如, Phe、 Trp、 Tyr等分别被 -MePhe、 -MeTrp、 -MeTyr等取代。 0058 在另外的实施例中, -甲基官能化氨基酸对应于与被取代的天然氨基酸相同的类 别。 例如, 脂肪族 -甲基官能化氨基酸取代脂肪族天然氨基酸; 羟基 -甲基官能化氨基酸取 代羟基天然氨基酸; 含硫的 -甲基官能化氨基酸取代含硫天然氨基酸; 环状 -甲基官能化 氨基酸取代环状天然氨基酸; 芳香族 -甲基官能化氨基酸取代芳香族天然氨基酸; 碱性 - 说明书 6/28 页 10 CN 105849123 A 10 甲基官能化氨基酸取代碱性天然氨基酸; 和/或酸性

48、 -甲基官能化氨基酸取代酸性天然氨 基酸。 0059 在另外的实施例中, 该 -甲基官能化氨基酸不对应于被取代的天然氨基酸。 0060 -甲基官能化氨基酸的商业来源包括, 例如, 瑞士的巴亨公司(BachemAG)。 0061 在示例性实施例中, 在此描述的合成肽中的至少一个 -甲基官能化氨基酸是 -甲 基苯丙氨酸。 0062 在又另外的实施例中, 在此描述的合成肽中的至少一个 -甲基官能化氨基酸选自 -甲基官能化组氨酸、 -甲基官能化丙氨酸、 -甲基官能化异亮氨酸、 -甲基官能化精氨 酸、 -甲基官能化亮氨酸、 -甲基官能化天冬酰胺、 -甲基官能化赖氨酸、 -甲基官能化天 冬氨酸、 -甲基官

49、能化甲硫氨酸、 -甲基官能化半胱氨酸、 -甲基官能化苯丙氨酸、 -甲基 官能化谷氨酸, -甲基官能化苏氨酸、 -甲基官能化谷氨酰胺、 -甲基官能化色氨酸、 -甲 基官能化甘氨酸、 -甲基官能化缬氨酸、 -甲基官能化鸟氨酸、 -甲基官能化脯氨酸、 -甲 基官能化硒代半胱氨酸、 -甲基官能化丝氨酸以及 -甲基官能化酪氨酸。 0063 如通篇所述, 在此描述的合成肽对蛋白降解是实质上有抗性的。 0064 如在此所使用,“蛋白降解” 意指将肽分解为更小的肽或甚至氨基酸, 通常由肽键 通过酶的水解所引起。 0065 通篇所提供的对蛋白降解 “实质上有抗性” 的合成肽表明在酶通常有活性的(即, 适合的pH、 温度、 其他环境条件)的条件中暴露于该酶中持续一段限定的时间之后, 至少约 50的合成肽保持完整。 适当地, 在此提供的合成肽对持续以下时间的蛋白降解是实质上 有抗性的: 至少4小时, 更适当地至

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