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1、(10)申请公布号 CN 102676607 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102676607 A *CN102676607A* (21)申请号 201210176998.1 (22)申请日 2012.05.31 C12P 19/02(2006.01) (71)申请人 东华大学 地址 201620 上海市松江区松江新城人民北 路 2999 号 (72)发明人 朱利民 石萌 权静 (74)专利代理机构 上海泰能知识产权代理事务 所 31233 代理人 黄志达 谢文凯 (54) 发明名称 一种混合溶剂中酶促合成阿魏酸糖酯的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种混合溶剂中酶促合成。
2、阿魏 酸糖酯的方法， 包括 ：（1）将活化后的分子筛加 入到有机溶剂中， 进行脱水处理 24-96h， 得到脱 水后的有机溶剂 ；（2）酶促转酯反应 ： 按摩尔比 2 11 6 将阿魏酸乙烯酯和葡萄糖加入到上 述脱水后的有机溶剂， 然后加入酶和活化后的分 子筛， 于 3070下震荡反应 10144h ； 反应结束 后过滤， 取澄清的滤液旋转蒸发出去有机溶剂， 经 过硅胶柱提纯， 即可。本发明的制备方法操作简 单， 对环境友好， 并且催化剂酶可以重复利用， 得 到的产物结构单一性好。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 。
3、(12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种混合溶剂中酶促合成阿魏酸糖酯的方法， 包括 ： （1） 将活化后的分子筛加入到有机溶剂中， 进行脱水处理 24-96h， 得到脱水后的有机溶 剂 ； （2） 按摩尔比 2 11 6 将阿魏酸乙烯酯和葡萄糖加入到上述脱水后的有机溶剂， 然 后加入酶和活化后的分子筛， 于 3070下震荡反应 10144h ； 反应结束后过滤， 取澄清的 滤液旋转蒸发出去有机溶剂， 经过硅胶柱提纯， 即可。 2. 根据权利要求 1 所述的一种混合溶剂中酶促合成阿魏酸糖酯的方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中所述的分。
4、子筛为分子筛。 3. 根据权利要求 1 所述的一种混合溶剂中酶促合成阿魏酸糖酯的方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 和 （2） 中所述的活化后的分子筛的制备方法为将分子筛于 500活化 4 个小时， 之 后真空干燥并冷却至室温， 备用。 4. 根据权利要求 1 所述的一种混合溶剂中酶促合成阿魏酸糖酯的方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中所述的有机溶剂为叔丁醇和吡啶的混合溶剂， 其中叔丁醇和吡啶的体积比为 1 1。 5. 根据权利要求 1 所述的一种混合溶剂中酶促合成阿魏酸糖酯的方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中分子筛的用量为 200mg/mL。 6. 根据权利要求 1 所述的一种混。
5、合溶剂中酶促合成阿魏酸糖酯的方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中所述的酶为枯草芽孢杆菌产的碱性蛋白酶、 Lipase from Candida Cylindacea、 Lipase from Candida rugosa、 Lipase from Rhizopus oryzae、 脂肪酶 Novozym 435、 Lipase from Pseudomonas fluorescens、 Lipase from Aspergillus niger 中的一种， 其 中每种酶的加入量与有机溶剂的比例为 5mg40mg 1mL， 每种酶的加入量与阿魏酸乙烯酯 的质量比为 1 2-2 1。 7. 根。
6、据权利要求 1 所述的一种混合溶剂中酶促合成阿魏酸糖酯的方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中所述的活化后的分子筛的加入量与有机溶剂的比例为 200mg 1mL。 8. 根据权利要求 1 所述的一种混合溶剂中酶促合成阿魏酸糖酯的方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中所述的反应时的震荡速率为 220r/min。 权 利 要 求 书 CN 102676607 A 2 1/3 页 3 一种混合溶剂中酶促合成阿魏酸糖酯的方法 技术领域 0001 本发明属于阿魏酸糖酯的制备领域， 特别涉及一种混合溶剂中酶促合成阿魏酸糖 酯的方法。 背景技术 0002 阿魏酸糖酯具有良好的抗氧化效果， 它能够螯合金属。
7、离子， 清除自由基离子 DPPH， 以及 OH 和 H2O2， 且其抗氧化性能与阿魏酸糖酯的计量呈现剂量依赖关系， 而且比游离的阿 魏酸有更高的抗氧化性质。阿魏酸糖酯具有两亲的性能， 使得其应用范围从水溶性扩展到 了脂溶性， 使得其可应用到抗氧化的化妆品中。 0003 阿魏酸糖酯最初是通过酶法， 酸法， 蒸煮法从小麦麸皮等成品纤维中提取出来的， 提取出来的阿魏酸糖酯大多是阿魏酸低聚糖。而关于阿魏酸葡糖酯的化学制备法， 涉及到 葡萄糖羟基的一个选择性结合， 不好控制， 需要进行羟基的保护和去保护， 步骤繁琐且条件 要求苛刻。关于阿魏酸糖酯的酶促合成方法中， 利用的阿魏酸直接与葡萄糖进行合成。由 。
8、于阿魏酸具有顺反两种结构， 结构不稳定， 易发生顺反结构的互变， 但是经过一步阿魏酸到 阿魏酸乙烯酯， 就会避免了这种情况的发生， 同时提高了脂溶性。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是提供一种混合溶剂中酶促合成阿魏酸糖酯的方法， 该方法步骤简单对环境友好， 并且催化剂酶可以重复利用。 0005 本发明制备阿魏酸糖酯的反应如下 ： 0006 0007 本发明的一种混合溶剂中酶促合成阿魏酸糖酯的方法， 包括 ： 0008 （1） 将活化后的分子筛加入到有机溶剂中， 进行脱水处理 24-96h， 得到脱水后的有 机溶剂 ； 0009 （2） 酶促转酯反应 ： 按摩尔比2116将阿魏酸乙。
9、烯酯和葡萄糖加入到上述脱 水后的有机溶剂， 然后加入酶和活化后的分子筛， 于 3070下震荡反应 10144h ； 反应结 束后过滤， 取澄清的滤液旋转蒸发出去有机溶剂， 经过硅胶柱提纯得到纯的阿魏酸葡糖酯。 0010 步骤 （1） 中所述的分子筛为分子筛。 0011 步骤 （1） 和 （2） 中所述的活化后的分子筛的制备方法为将分子筛于 500活化 4 个小时， 之后真空干燥并冷却至室温， 备用。 0012 步骤 （1） 中所述的有机溶剂为体积比为 1 1(v/v) 的叔丁醇和吡啶的混合溶剂。 0013 步骤 （1） 中分子筛的用量为 200mg/mL。 说 明 书 CN 102676607。
10、 A 3 2/3 页 4 0014 步骤 （2）中所述的酶为枯草芽孢杆菌产的碱性蛋白酶 (20 万， 无锡雪梅科技 有 限 公 司 )、 Lipase from Candida Cylindacea（5.18u/mg， sigma-Aldrich） 、 Lipase from Candida rugosa(1104u/mg,sigma)、 Lipase from Rhizopus oryzae(55.7u/ mg,sigma-Aldrich)、 脂肪酶 Novozym435(7u/mg， 广州明远工贸有限公司 )、 Lipase from Pseudomonas fluorescens(2.2。
11、u/mg， sigma-Aldrich)、 Lipase from Aspergillus niger （187u/g， fluka） 中的一种， 其中每种酶的加入量与有机溶剂的比例为 5mg40mg 1mL， 每 种酶的加入量与阿魏酸乙烯酯的质量比为 1 2-2 1。 0015 步骤 （2） 中所述的活化后的分子筛的加入量与有机溶剂的比例为 200mg 1mL。 0016 步骤 （2） 中所述的反应时的震荡速率为 220r/min。 0017 本发明中底物阿魏酸乙烯酯为实验室化学合成的， 合成方法为 ： 将阿魏酸 5g， 醋 酸汞0.22g， 醋酸乙烯酯68ml依次加入到150ml反应烧瓶中。
12、， 搅拌30min之后滴加0.2ml浓 硫酸， 于 80油浴锅中下回流 3h。反应结束冷却至室温加 2g 醋酸钠充分搅拌后静置过夜， 过滤取上清旋蒸， 得到黄色油状物， 经柱层析分离纯得到阿魏酸乙烯酯， 纯度达 98%。 0018 反应溶剂为分析级的吡啶和叔丁醇 , 溶剂参数分别为 ： 0.65 和 1.31。两种底物是 分别溶于这两种有机溶剂中， 避免了直接混溶有底物不能完全溶解的尴尬， 使得底物在一 个全溶解的状态下经酶催化合成阿魏酸糖酯。 0019 本发明反应底物阿魏酸乙烯酯是利用市售阿魏酸合成的， 纯度高达 98% ； 葡萄糖 也为市售葡萄糖 ； 各种酶类制剂酶活力单位各不相同 ； 反。
13、应溶剂为吡啶， 叔丁醇， 或者是无 溶剂体系直接用液态酶做反应体系的溶剂。 0020 本发明的酶促合成阿魏酸葡萄糖酯的方法主要是利用不同的酶和不同的溶剂组 合来合成具有双亲特性的阿魏酸葡萄糖酯衍生物。 0021 本发明是应用了一种比较温和的酶促方法， 合成了一种具有双亲特性的抗氧化物 质， 相对于化学合成中繁杂的糖羟基的保护脱保护过程， 实验步骤简单对环境友好， 并且催 化剂酶可以重复利用， 且合成产物结构单一性好。 0022 有益效果 0023 (1) 采用酶促合成的方法， 反应条件温和， 相对于化学反应， 避免了苛刻危险的反 应条件 ； 0024 (2) 酶促反应的选择性较强， 避免了葡萄。
14、糖的羟基保护和脱保护步骤， 反应步骤简 单 ； 0025 (3) 反应过程应用的反应溶剂沸点都比较低， 易于分离 ； 0026 (4) 反应是在一个没有游离水的状态下进行的， 防止了由于水的存在导致酶的水 解作用的产生 ； 0027 (5) 合成的阿魏酸葡糖酯同时提高了阿魏酸的抗氧化性， 得到了双亲的含糖化合 物， 拓宽了应用范围。 附图说明 0028 图 1 ： 阿魏酸糖酯的红外光谱图 ； 0029 图 2 ： 阿魏酸糖酯的化学结构式。 说 明 书 CN 102676607 A 4 3/3 页 5 具体实施方式 0030 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说。
15、明本发明 而不用于限制本发明的范围。 此外应理解， 在阅读了本发明讲授的内容之后， 本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。 0031 实施例 1 0032 不同酶催化的阿魏酸葡萄糖酯的合成， 具体步骤如下 ： 0033 （1） 将分子活化干燥之后， 添加到待用的反应溶剂中， 进行溶剂的干燥， 四天后 得到脱水的有机溶剂， 分子筛的用量为 200mg/ml。 0034 （2） 酶促转酯反应 ： 取3.8g葡萄糖和1g阿魏酸乙烯酯分别加到100ml脱水的等体 积有机溶剂吡啶和叔丁醇中震荡溶解后混合， 再加入 2g 的各种酶类， 枯草。
16、芽孢杆菌产的碱 性蛋白酶 (20 万， 无锡雪梅科技有限公司 ) ； Lipase from Candida Cylindacea （5.18u/mg， sigma-Aldrich） ;Lipase from Candida rugosa(1104u/mg,sigma);Lipase from Rhizopus oryzae(55.7u/mg,sigma-Aldrich); 脂肪酶 Novozym 435(7u/mg， 广州明远工贸有限公 司 );Lipasefrom Pseudomonas fluorescens(2.2u/mg， sigma-Aldrich);Lipase from Asp。
17、ergillus niger （187u/g， fluka） 。加入分子筛 20g， 于 50下， 220r/min 震荡 72h。反 应结束后用滤纸过滤除去分子筛和酶， 得到的滤液经旋蒸仪蒸发出去有机溶剂， 之后经硅 胶柱提纯得到阿魏酸葡糖酯， 纯度为 90%95%。 0035 实施例 2 0036 不同有机溶剂催化阿魏酸糖酯的酶促合成反应， 具体步骤如下 ： 0037 （1） 将分子筛活化 4 干燥之后， 添加到待用的反应溶剂中， 进行溶剂的干燥， 四 天后得到脱水的有机溶剂， 分子筛的用量为 200mg/ml。 0038 （2） 酶促转酯反应 ： 取 3.8g58g 葡萄糖和 1g 阿魏酸分别加到 100ml 不同的脱水 有机溶剂吡啶， 叔丁醇， 以及100ml等体积的叔丁醇和吡啶混合溶剂中， 再加入2g的脂肪酶 Novozyon 435(7u/mg) ； 加入分子筛 20g， 于 50下， 220r/min 震荡 72h。反应结束后用滤纸 过滤除去分子筛和酶， 得到的滤液经旋蒸仪蒸发出去有机溶剂， 之后经硅胶柱提纯得到阿 魏酸葡糖酯， 纯度为 90%95%。 说 明 书 CN 102676607 A 5 1/1 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102676607 A 6 。