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1、(10)授权公告号 CN 202401074 U (45)授权公告日 2012.08.29 CN 202401074 U *CN202401074U* (21)申请号 201120569496.6 (22)申请日 2011.12.31 C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (73)专利权人 浙江爱易生物医学科技有限公司 地址 316000 浙江省舟山市定海区兴舟大道 157 号 101 室 (72)发明人 任峻 张华忠 (54) 实用新型名称 人体内肥胖基因位点检测的试剂盒 (57) 摘要 本实用新型提供了一种检测人体内肥胖基因 位点是否发生突变从而达到。
2、对个体进行体重管理 目的的试剂盒， 由包装盒体 1、 衬垫 2、 装有检测两 个 SNP 位点的荧光定量 PCR 反应液的两个试管 3、 装有阳性对照品的一个试管 4、 装有阴性对照品 的一个试管 5 组成， 衬垫上设有容器孔， 分别放置 两管荧光定量 PCR 反应液 3、 阳性对照品 4 和阴性 对照品5。 本实用新型试剂盒运用荧光定量PCR技 术实现了同时检测两个人体内肥胖基因 SNP 位点 基因型的目的， 相对于现有的荧光定量 PCR 试剂 盒只检测一个 SNP 位点， 本实用新型试剂盒将与 同一疾病的两个 SNP 位点检测整合在一个试剂盒 内， 使用更方便而且成本更低， 对个体进行体重。
3、管 理也更便捷。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)实用新型专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种人体内肥胖基因位点检测的试剂盒， 其特征是由包装盒体 （1） 、 衬垫 （2） 、 装有 检测两个 SNP 位点的荧光定量 PCR 反应液的两个试管 （3） 、 装有阳性对照品的一个试管 （4） 、 装有阴性对照品的一个试管 （5） 组成， 衬垫 （2） 上设有容器孔， 分别放置两管荧光定量 PCR 反应液 （3） 、 阳性对照品 （4） 和阴性对照品 （5） 。 权 。
4、利 要 求 书 CN 202401074 U 2 1/5 页 3 人体内肥胖基因位点检测的试剂盒 技术领域 0001 本实用新型涉及分子生物学和医学领域， 具体涉及检测人体内肥胖基因位点是否 发生突变的试剂盒， 通过同时检测与肥胖密切相关的过氧化酶基因 （FTO） 和黑皮质素家族 受体基因 （MC4R） 的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体肥胖程度从而达到对个体体重 管理的目的。 背景技术 0002 从人类开始关注体重问题到现在经历了数次革命， 而现在欧美国家正处于第三次 革命， 这就是风行欧美的 “体重管理” ， 维持体重管理强调的是一种健康的生活理念， 因为人 类已经清楚认识到了肥胖对生活。
5、带来的巨大影响。肥胖 （obesity） 已成为严重危害人类健 康的社会问题。现有大约十亿的成年人是超重， 体重指数 （body mass index， BMI） 超过 25， 并且有3亿成年人是肥胖， BMI超过30。 肥胖会导致严重的健康问题， 降低生活期盼， 对生活 质量造成重要影响。 肥胖和超体重会导致高血压、 2型糖尿病、 冠状动脉心脏病等严重疾病， 从而大量增加死亡的风险。 肥胖对阻塞性睡眠呼吸暂停和呼吸系统疾病、 胆囊疾病、 骨关节 炎、 非酒精性脂肪肝疾病、 结肠癌等疾病的发展也很重要。因此， 了解肥胖的原因并且有效 控制肥胖的方法是现在肥胖和超体重人群所迫切需要的。随着 “基。
6、因时代” 的到来， 人类已 发现了数个与肥胖相关的基因， 其中过氧化酶基因 （FTO） 和黑皮素家族受体基因 （MC4R） 与 肥胖有显著关联。 0003 过氧化酶基因 （FTO） ， 在下丘脑中的表达与调节食物摄取有关， 是目前发现与体重 变化相关性最强的基因。FTO 基因位于染色体 16q12.2 上， 是非 - 血红素加双氧酶超家族 （non-heme dioxygenase superfamily） 的一个成员。 0004 Gerken等进行实验得出， FTO mRNA在脑组织中表达最高， 而在脑组织中， 最高表达 又是在下丘脑， 下丘脑是控制能量平衡起关键作用的区域。在对下丘脑片段进。
7、行原位杂交 时得出 FTO mRNA 高表达于弓状核、 室旁核、 背内侧核、 腹侧正中核。这些都是控制能量平衡 的关键部位。 Robbens等得出FTO基因主要表达在神经元， 而在星形胶质细胞和神经胶质细 胞中则不表达， FTO 基因表达与一些食物相关调节基因存在关联， 如胃肽等。这些表达差异 说明 FTO 基因在神经调节饮食方面起到一个特殊的作用。 0005 FTO 基因的变异会导致肥胖， 变异表现为单核苷酸多态性 （SNP） ， 最近许多人在 研究 FTO 基因的单核苷酸多态性的变异位点与肥胖的关联。Hinney 等对 487 个极度肥胖 的德国年轻人和 442 个健康瘦弱的德国年轻人进行。
8、全基因组扫描相关分析 （genome wide association， GWA） 得出 ： 证实有 15 种 SNPs， 其 P 值最低。15 种 SNPs 中有 6 种 SNPs 存在同 一连锁不平衡模块中， 并包括 GWA SNP 的最低 P 值。而另外的 9 种低 P 值 SNPs 在肥胖家族 中没有得到证实， 且这 9 种 SNPs 与连锁不平衡不相关。这说明了 FTO 的变异对早期肥胖有 很大的作用。 Sculeri等利用全基因相关扫描显示了FTO基因变异与肥胖相关性状 （BMI， 臀 围， 总体重） 的关联。通过对 4000 名以上的撒丁人的检测， 发现了在染色体 16 上具体的。
9、基 因变异 ： rs9930506 和其它附近的基因变异与体重指数、 臀围和总体重的关联。并且这种相 说 明 书 CN 202401074 U 3 2/5 页 4 关性不但在撒丁人中显示出来， 同样也在欧美和西班牙美国人独立样本中显示出来。研究 结果得出有 8 个单核苷酸 （SNPs） 重叠于肥胖的 3 个数量性状中。尤其是 rs9930506 和其附 近的一簇 SNPs 与体重指数、 臀围、 总体重有很强的关联。在这些 SNPs 中的 2 个， rs9939609 和 rs9926289， 是位于 1 个内含子区域， FTO 基因中的多种 SNP 为肥胖相关性提供了证据。 0006 FTO 。
10、中的 rs9939609SNP 是单核苷酸多态性中置换的共同位点， 近年来许多人都 在研究这个位点的 SNPs。Waln 等实验得出 ： 对 FTO 基因的 rs9939609 与脂肪细胞功能 和组织基因表达关联在 306 个健康妇女不同体重指数研究结果中现实 FTO rs9939609 的 mRNA在肥胖人中表达增加。 并且rs9939609的mRNA在脂肪细胞中比脂肪组织要高出很多。 Frayling 等利用全基因组相关研究对在美国患有 2- 型糖尿病的人群进行 490 000 正常染 色体 SNPs 分析得出 ： FTO 基因中的 SNPrs9939609 与 2- 型糖尿病有很强的关联。
11、， 而且这个 等位基因也与增长的 BMI 有很强的关联， 这种 SNP 与 2- 型糖尿病的关联会被增长的 BMI 取 消。这点说明 FTO 中的 SNP 是和 BMI 相关的。这个变异体已经在超过 38000 中的 13 种人 群反应出来了。在带有这个变异体的成人与没带有这个变异体的成人相比， 体重要重 3kg 多并多出 1.6 倍得肥胖的风险， 而且 rs9939609 这种相关性在 7 岁之后会上升并且反映了 在肥胖中具体的增长。Lpez-Bermejo 等对 rs9939609SNP 研究得出 ： FTO rs9939609 与出 生时的体重无关联， 但是在出生后 2 周婴儿的全身、 。
12、躯干、 腹部等发现其与血清脂肪因子、 体重相关， 并且AA纯合子比T携带者的血清脂肪因子的聚积要高出37%， 且全身、 躯干、 腹部 的脂肪堆积相应高出17%、 20%、 17%。 这些证实了共同的rs9939609SNP在人类早期阶段脂肪 合成的作用， 并揭示了这个 SNP 和血清脂肪因子， 以及腹部脂肪堆积在出生后的显著关系。 0007 因 FTO 基因与肥胖有关而成为近年来的研究热点， FTO 基因分布于下丘脑， 参与调 节饮食， 其变异导致肥胖的发生。随着研究的深入， 将进一步揭示 FTO 基因在人体内的功能 和特异调控机制， 以及基因变异与疾病的关系， 为疾病的防治提供新的治疗靶点。。
13、 0008 黑皮质素激素受体 4（Melanorcortin 4 Receptor， MC4R）基因属于黑皮质素 激素受体 （Melanorcortin Receptors， MCR） 家族 （Gantz et al.,1993） 。这个家族是一 类细胞膜上的 G 蛋白偶联受体 （G-Protein-Coulped Receptor， GPCR）蛋白 （Hadley et al.,1996） 。到目前为止， 在人体中， 总共克隆到 5 个该家族成员， 他们分别是 MC1R、 MC2R、 MC3R、 MC4R 和 MC5R。所有这些蛋白都能结合黑皮质素激素类配体， 包括从前阿黑皮素原 （Pro-。
14、opiomelanocortin， POMC）中获取的促肾上腺皮质激素 （Adrenocorticotrophin， ATCH） 和 、 、 型黑皮质素激素 （Melanocyte-stimulating Hormones， MSH） （Hadley and Haskell-Luevano， 1999） 。所以， 被称作黑皮质素激素受体家族。 0009 肥胖病是一个常见的流行病， 关于对它机理的研究进行了很多年， 现在比较 成熟的理论是， 肥胖病的产生很大程度上是体内能量代谢失衡的结果 （Schwartz et al.,2000） 。 能量消耗和食物摄入是研究肥胖病的两个主要环节， 如果这两个。
15、环节长期在体 内无法得到平衡， 将不可避免的导致肥胖。当然具体的情况需要对不同的病例进行具体的 分析， 环境和遗传的因素也会对肥胖病症造成影响 （Clement et al.,2002） 。 0010 1994 年瘦素 （Leptin）发现后， 越来越多的生理学证据表明 Leptin 参与到体内 能量代谢的过程， Leptin 及其所在通路是影响肥胖的一个主要生理途径 （Friedman and Halaas， 1998） 。黑皮质素激素系统 （Melanocortin system， MC） 在 Leptin 通路之中， 通过 若干激动或拮抗性质的激素与相应的黑皮质素激素受体结合， 激活细胞。
16、内下游信号传导通 说 明 书 CN 202401074 U 4 3/5 页 5 路， 在中枢神经系统中调节摄食和能量代谢， 从而在控制肥胖病症的发生过程中发挥重要 作用 （Cone， 1999） ； 同时， 动物和人的遗传学的证据也证明 MC4R 和肥胖病相关。它已成为重 要的治疗肥胖病的基因靶体 （MacNeil et al.,2002） 。值得注意的是 MC4R 与 MC1R， MC2R 和 MC5R 不同， 只在中枢神经系统内参与对体内能量代谢的调节， 它和 MC3R 共同属 Leptin-MC 通路 （Vergoni and Bertolini， 2000） 。 0011 促黑激素皮质。
17、素受体 -4（MC4R） 单核苷多态性位点 rs17782313 位于 MC4R 基因下 游 188kb 处， 在对欧洲白人的研究中发现 MC4R 的 rs17782313 危险等位基因 C 与体重指数 （BMI） 相关， 并且携带危险等位基因 C 会增加肥胖的发生风险。而后， 为了分析在中国汉族 人群中， MC4R单核苷酸多态性rs17782313对BMI有无影响， 及rs17782313是否能够提高肥 胖的发生风险， 是否能够提高2型糖尿病的患病风险， 国内的研究机构采用病例-对照研究 设计， 对 2280 人进行了糖尿病筛查， 其中， 2 型糖尿病组 1107 人 年龄 5310 （me。
18、anSD） ： BMI 25.233.17， 健康组 1173 人 年龄 5910 ： BMI 25.273.09。在分析 rs17782313 对肥胖发生风险的影响时， BMI 28kg/m2者纳入肥胖组， BMI 25kg/m2者作为对照组。采 用 sequenom MassARRAY SNP 分型技术对 rs17782313 位点进行基因分型。线性回归模型应 用于 rs17782313 多态性对 BMI 影响的分析， 用 logistic 回归分析 rs17782313 对肥胖及糖 尿病发生风险的影响。 0012 研究结果表明， 本研究人群危险等位基因 C 的频率为 24%， 携带危险等。
19、位基因 C 可 以使BMI增加， =0.24 （P=0.043） ， rs17782313对BMI的影响无性别差异。 在显性遗传模式 下， 携带危险等位基因 C 可使肥胖发生风险增加 25%95% CI （1.006-1.547） （P=0.043） 。 rs17782313 与 2 型糖尿病的发生率无统计学相关性 （P=0.797） 。 0013 最终得出结论是中国汉族人群 MC4R 基因单核苷酸多态性 rs17782313 与 BMI 相 关， 携带危险等位基因使 BMI 增加。在显性遗传模式下， rs17782313 会增加肥胖发生的风 险。 发明内容 0014 本实用新型针对目的是提供。
20、一种采用荧光定量 PCR 技术同时检测两个人体内肥 胖基因 SNP 位点的试剂盒。该试剂盒由包装盒体、 衬垫、 装有检测两个 SNP 位点的荧光定量 PCR 反应液的两个试管、 装有阳性对照品的一个试管、 装有阴性对照品的一个试管组成， 衬 垫上设有容器孔， 分别放置两管荧光定量 PCR 反应液、 阳性对照品和阴性对照品。 0015 其中荧光定量 PCR 反应液的成分包含 ： PCR 缓冲液、 MgCl2、 dNTPs、 SNP 位点检测用 上游引物、 SNP 位点检测用下游引物、 SNP 位点基因型一荧光探针、 SNP 位点基因型二荧光探 针、 Taq DNA 聚合酶。 0016 其中， 0。
21、017 过氧化酶基因 （FTO） 上的 SNP 位点检测引物和探针为 ： 0018 上游引物序列 ： 5 - GGTTCCTTGCGACTG -3 0019 下游引物序列 ： 5 - AACAGAGACTATCCA -3 0020 基因型一荧光探针序列 ： 5 -FAM GAATTTaGTGATG TAMRA -3 0021 基因型二荧光探针序列 ： 5 -VIC- GAATTTtGTGATG TAMRA -3 0022 黑皮质素家族受体基因 （MC4R） 上的 SNP 位点检测引物和探针为 ： 说 明 书 CN 202401074 U 5 4/5 页 6 0023 上游引物序列 ： 5 - 。
22、GTTTAAAGCAGGAGAG -3 0024 下游引物序列 ： 5 - TGAAGCTTTTCTTGTC -3 0025 基因型一荧光探针序列 ： 5 -FAM TGTATCCcGATGGA - TAMRA -3 0026 基因型二荧光探针序列 ： 5 -VIC TGTATCCtGATGGA TAMRA -3 0027 对照品分为阳性对照品和阴性对照品， 阴性对照品为无菌双蒸水样品， 阳性对照 品为口腔粘膜细胞 DNA 样品。 0028 本试剂盒保存于 -20， 尽量减少反复冻融。 0029 本实用新型试剂盒使用方法 ： 0030 每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。 0031 扩增检测在。
23、荧光定量 PCR 仪上进行， 分为 6 个反应管， 每一个 SNP 位点检测使用 3 个反应管， 其中 1 个反应管为被检测样品， 阳性对照和阴性对照各使用 1 个反应管， 每管中 总体积 10l， 其中 8l PCR 反应液， 2l 检测样品 （基因组 DNA、 阳性对照或阴性对照） 。 反应条件为 50、 2 分钟， 95、 10 分钟， 再进行 60 个循环的 95、 30 秒， 60、 1 分钟。反 应完成后在荧光定量 PCR 仪上进行终点荧光读取， 根据得到的二维荧光图和实时扩增曲线 读取被检测样品的 SNP 位点基因型。 0032 本实用新型提供的该试剂盒主要用于检测人体内肥胖基因。
24、 SNP 位点， 从而告知被 检者患肥胖症风险数值， 提前预防和控制， 指导医师选择正确的临床治疗方案， 有利于被检 者进行体重管理。 0033 本实用新型的特点是 ： 该试剂盒运用荧光定量 PCR 技术实现了同时检测两个人体 内肥胖基因 SNP 位点基因型的目的， 相对于现有的荧光定量 PCR 试剂盒只检测一个 SNP 位 点， 本实用新型试剂盒将同一疾病的所有 SNP 位点检测整合在一个试剂盒内， 使用更方便 而且成本更低， 对个体进行体重管理也更便捷。 附图说明 0034 图 1 为本实用新型的结构示意图。 具体实施方式 0035 本实用新型结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解， 。
25、这些实施例仅用于 说明目的， 而不用于限制本实用新型范围。 0036 实施例 1 0037 参见图 1， 本实用新型试剂盒由包装盒体 1、 衬垫 2、 装有检测两个 SNP 位点的荧光 定量 PCR 反应液的两个试管 3、 装有阳性对照品的一个试管 4、 装有阴性对照品的一个试管 5 组成， 衬垫上设有容器孔、 分别放置两管荧光定量 PCR 反应液 3、 阳性对照品 4 和阴性对照 品 5。 0038 其中荧光定量 PCR 反应液的成分包含 ： PCR 缓冲液、 MgCl2、 dNTPs、 SNP 位点检测用 上游引物、 SNP 位点检测用下游引物、 SNP 位点基因型一荧光探针、 SNP 位。
26、点基因型二荧光探 针、 Taq DNA 聚合酶。 0039 本试剂盒保存于 -20， 尽量减少反复冻融。 0040 实施例 2 说 明 书 CN 202401074 U 6 5/5 页 7 0041 1 材料 ： 0042 血样总 DNA 提取试剂盒购于美国 Qiagen 公司， Taq DNA 聚合酶、 dNTPs 等 PCR 相关 试剂购于美国 Promega 公司， 7900 型荧光定量 PCR 仪为美国 ABI 公司产品。 0043 2 引物及探针 ： 0044 过氧化酶基因 （FTO） 上的 SNP 位点检测引物和探针为 ： 0045 上游引物序列 ： 5 - GGTTCCTTGCG。
27、ACTG -3 0046 下游引物序列 ： 5 - AACAGAGACTATCCA -3 0047 基因型一荧光探针序列 ： 5 -FAM GAATTTaGTGATG TAMRA -3 0048 基因型二荧光探针序列 ： 5 -VIC- GAATTTtGTGATG TAMRA -3 0049 黑皮质素家族受体基因 （MC4R） 上的 SNP 位点检测引物和探针为 ： 0050 上游引物序列 ： 5 - GTTTAAAGCAGGAGAG -3 0051 下游引物序列 ： 5 - TGAAGCTTTTCTTGTC -3 0052 基因型一荧光探针序列 ： 5 -FAM TGTATCCcGATGGA。
28、 - TAMRA -3 0053 基因型二荧光探针序列 ： 5 -VIC TGTATCCtGATGGA TAMRA -3 0054 3 样本检测 ： 0055 选取 30 例血液样本， 其中已确定患肥胖症的为 18 例。样本用血样总 DNA 提取试 剂盒提取总 DNA。每一例检测为 12 个反应管， 每管中总体积 10l， 其中 8l PCR 反应液， 每一个 SNP 位点检测使用 3 个反应管， 1 个反应管中加入 2l 被检测 DNA， 另外 2 个反应管 中加入 2l 阳性对照和阴性对照， 在 ABI7900 荧光定量 PCR 仪上进行扩增。反应条件为 50、 2 分钟， 95、 10 分钟， 再进行 60 个循环的 95、 30 秒， 60、 1 分钟。反应完成后在荧 光定量 PCR 仪上进行终点荧光读取。 说 明 书 CN 202401074 U 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 202401074 U 8 。