技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种小麦成熟胚愈伤组织基因 枪遗传转化方法。
背景技术
小麦是重要的粮食作物之一，自1992年Vasil等将GUS/Bar基因导入 小麦幼胚愈伤组织、通过转化细胞的再生获得首例转基因小麦以来，转基因 小麦研究有了长足的发展，尽管小麦转基因方法报道不少，但基因枪转化 （microprojectile bombardment）仍然是小麦遗传转化最有效的技术。目 前，小麦基因枪遗传转化的主要受体为发育13天左右的小麦幼胚诱导的愈 伤组织，但这一重要外植体的来源受到小麦生长季节及时段的影响，应用上 很不方便，小麦成熟胚主要来自于收获或储藏的小麦种子，其取材不受小麦 生长季节和时段的影响，非常方便，但小麦成熟胚愈伤组织诱导及再生能力 极差，影响了这一技术的应用，尽管目前通过培养条件和培养基的改进，是 小麦成熟胚诱导的愈伤组织基本可以达到基因枪遗传转化的水平，但与幼胚 愈伤组织相比，还有巨大差距。研究、探索小麦成熟胚高效离体培养、再生 和转化的条件，使其达到小麦幼胚愈伤组织诱导、再生和转化的水平，可为 小麦外源基因的遗传转化和应用建立重要的技术基础。
发明内容
针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种小 麦成熟胚愈伤组织高效诱导、再生和转化的方法，该方法主要通过小麦成熟 胚培养的前处理、有机物的添加及培养、转化技术过程的优化，获得了与小 麦幼胚愈伤组织诱导、再生和转化效率相近的技术效果，克服小麦成熟胚愈 伤组织诱导难、再生特性差、转化效率低及转化受体组织取材受生长季节、 时段影响的缺陷。
为实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：
一种小麦成熟胚愈伤组织基因枪遗传转化方法，其特征在于，包括以下 步骤：
1）成熟胚的选择与预处理：
选取当年收获或储藏1年左右、籽粒饱满的小麦种子，用无菌水冲洗2 次，在无菌条件下，用质量分数为70%的酒精消毒5min，然后在浓度为0.1% 的升汞溶液中浸泡种子15min，无菌水冲洗4次；
消毒后的小麦种子置10mg/L的噻二唑苯基脲（TDZ）溶液中于25℃室 温条件下预处理15h；
2）接种与愈伤组织的诱导：
预处理后的小麦种子用浓度为0.1%的升汞溶液再次消毒10min，无菌 水洗4次，于无菌条件下剥取成熟胚，接种于成熟胚愈伤组织诱导培养基上 诱导愈伤组织；
所述的小麦成熟胚愈伤组织诱导培养基以通用MS培养基为基准，添加 以下物质：2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）：2.0mg/L，盐酸硫胺素（VB1）： 8.0mg/L，水解酪蛋白：500mg/L，L-天门冬酰胺：250mg/L，L-谷氨酰胺： 200mg/L，蔗糖：15000mg/L，麦芽糖：15000mg/L，琼脂：5000mg/L；
通用培养基MS的配方为：硝酸钾（KNO3）：1900mg/L，硝酸氨（NH4NO3）： 1650mg/L，氯化钙（CaCl2·2H2O）：440mg/L，硫酸镁（MgSO4·7H2O）：370mg/L， 磷酸二氢钾（KH2PO4）：170mg/L，硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）：27.8mg/L，乙二 酸四乙钠（Na2EDTA）：37.3mg/L，硫酸锰（MnSO4·4H2O）：22.3mg/L，硫酸 锌（ZnSO4·7H2O）：8.6mg/L，硼酸（H3BO3）：6.2mg/L，碘化钾（KI）：0.83mg/L， 钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）：0.25mg/L，硫酸铜（CuSO4·5H2O）：0.025mg/L， 氯化钴（CoCl2·6H2O）：0.025mg/L，肌醇100mg/L，盐酸硫胺素：0.5mg/L， 盐酸吡哆锌：0.5mg/L，烟酸：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L。
调整成熟胚愈伤组织诱导培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅（压 力：1.0kg／cm2）灭菌20分钟；
3）高渗培养：
小麦成熟胚组织诱导培养5天后陆续产生成熟胚愈伤组织，挑选诱导 12天、质地致密的成熟胚愈伤组织转移到高渗培养基中，于20℃黑暗条件 高渗培养6h；
所述的高渗培养基为上述小麦成熟胚愈伤组织诱导培养基中再附加 0.2mol/L的甘露醇和0.2mol/L的山梨醇；
4）基因枪轰击转化：
经高渗处理后的成熟胚愈伤组织用常规的基因枪转化方法进行轰击转 化，基因枪轰击参数为：金粉直径1.0μm，阻挡网与轰击材料之间的距离 为9.0cm，可裂膜压力为1100Pa，每枪金粉/DNA用量为1μg/60μg，每皿 材料轰击2次；
5）恢复培养：
基因枪轰击后的成熟胚愈伤组织在上述高渗培养基上继续暗培养18h 后，将愈伤组织从高渗培养基转移至恢复培养基中，于26℃暗培养13天；
所述的小麦成熟胚愈伤组织恢复培养基以通用MS培养基为基准，添加 以下物质：2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）：1.5mg/L，6-呋喃基氨基嘌呤（KT）： 0.5mg/L，水解酪蛋白：500mg/L，L-天门冬酰胺：250mg/L，L-谷氨酰胺： 200mg/L，盐酸硫胺素（VB1）：8.0mg/L，蔗糖：15000mg/L，麦芽糖：15000 mg/L，琼脂：5000mg/L；
调整小麦成熟胚愈伤组织恢复培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅 （压力：1.0kg／cm2）灭菌20分钟；
6）抗性筛选：
恢复培养后的愈伤组织转移到抗性筛选培养基上，于26℃、3000lx光 照下进行抗性细胞筛选，所述抗性筛选培养基以通用MS培养基为基准，添 加以下物质：2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）：1.0mg/L，6-呋喃基氨基嘌呤 （KT）：0.5mg/L，α-萘乙酸（NAA）：0.01mg/L，水解酪蛋白：500mg/L， L-天门冬酰胺：250mg/L，L-谷氨酰胺：200mg/L，盐酸硫胺素（VB1）：8.0mg/L， 卡拉霉素：100mg/L，蔗糖：15000mg/L，麦芽糖：15000mg/L，琼脂：5000mg/L；
调整抗性筛选培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅（压力：1.0kg／ cm2）灭菌20分钟；
7）分化培养：
恢复及筛选培养后的成熟胚愈伤组织转至分化培养基上进行分化培养； 培养温度为25～28℃，光照度3000lx，每天光照12h；筛选获得的成熟胚 愈伤组织，在分化培养基上分化出芽苗；
所述的分化培养基以通用培养基MS为基准，添加以下物质：6－呋喃基 氨基嘌呤（KT）：2.0mg/L，α-萘乙酸（NAA）：0.01mg/L，酪蛋白：500mg/L， 生物素：0.5mg/L，盐酸硫胺素（VB1）：8.0mg/L，蔗糖：15000mg/L，麦芽 糖：15000mg/L，琼脂：5000mg/L；
调整分化培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅(压力：1.0kg／cm2) 灭菌20分钟；
8）壮苗、生根培养：
待成熟胚愈伤组织分化的芽苗长至2～3片叶时转移到生根、壮苗培养 基上，于25℃、3000Lx光照条件下进行壮苗、生根培养；
所述的生根、壮苗培养基以通用培养基MS为基准，且将MS通用培养的 无机盐浓度降低一半，其中添加α－奈乙酸（NAA）0.5mg/L，蔗糖：30000 mg/L，琼脂：5000mg/L；
调整壮苗、生根培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅(压力：1.0kg／ cm2)灭菌20分钟；
9）移植：
在生根、培壮苗养基上，生长健壮的成熟胚愈伤组织再生植株及时移栽 到营养钵中，于15℃、3000Lx光照条件下缓苗，待完全缓苗且进一步生长 10天后，在3-4℃低温春化条件下处理20天，即得到转化的转基因株；
10）分子检测并筛选：
用常规的分子检测技术对转化的转基因的抗性个体进行分子检测。
本发明的小麦成熟胚愈伤组织基因枪遗传转化方法，与报道的成熟胚愈 伤组织基因抢转化相比，成熟胚愈伤组织遗传转化效率高，其诱导、分化及 转化能力接近于幼胚愈伤组织，克服了以往小麦成熟胚愈伤组织基因抢转化 中愈伤组织诱导率、再生频率和转化效率低的技术弊端，使小麦遗传转化不 受受体组织取材季节、时段的限制，利用当年收获或储藏1年种子成熟胚随 时进行高效转化研究成为可能，提高了小麦遗传转化和分子育种效率。
附图说明
图1是小麦成熟胚诱导的能高效再生的愈伤组织图片；
图2是基因枪转化后成熟胚抗性愈伤组织的再生图片；
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
本实施例给出一种小麦成熟胚愈伤组织基因枪遗传转化方法，包括以下 步骤：
1）成熟胚的选择与预处理：
选取当年收获或储藏1年左右、籽粒饱满的小麦种子，用无菌水冲洗2 次，在无菌条件下，用质量分数为70%的酒精消毒5min，然后在浓度为0.1% 的升汞溶液中浸泡种子15min，无菌水冲洗4次；
消毒后的小麦种子置10mg/L的噻二唑苯基脲（TDZ）溶液中于25℃室 温条件下预处理15h；
2）接种与愈伤组织的诱导：
预处理后的小麦种子用浓度为0.1%的升汞溶液再次消毒10min，无菌 水洗4次，于无菌条件下剥取成熟胚，接种于成熟胚愈伤组织诱导培养基上 诱导愈伤组织；
所述的小麦成熟胚愈伤组织诱导培养基以通用MS培养基为基准，添加 以下物质：2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）：2.0mg/L，盐酸硫胺素（VB1）： 8.0mg/L，水解酪蛋白：500mg/L，L-天门冬酰胺：250mg/L，L-谷氨酰胺： 200mg/L，蔗糖：15000mg/L，麦芽糖：15000mg/L，琼脂：5000mg/L；
通用培养基MS的配方为：硝酸钾（KNO3）：1900mg/L，硝酸氨（NH4NO3）： 1650mg/L，氯化钙（CaCl2·2H2O）：440mg/L，硫酸镁（MgSO4·7H2O）：370mg/L， 磷酸二氢钾（KH2PO4）：170mg/L，硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）：27.8mg/L，乙二 酸四乙钠（Na2EDTA）：37.3mg/L，硫酸锰（MnSO4·4H2O）：22.3mg/L，硫酸 锌（ZnSO4·7H2O）：8.6mg/L，硼酸（H3BO3）：6.2mg/L，碘化钾（KI）：0.83mg/L， 钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）：0.25mg/L，硫酸铜（CuSO4·5H2O）：0.025mg/L， 氯化钴（CoCl2·6H2O）：0.025mg/L，肌醇100mg/L，盐酸硫胺素：0.5mg/L， 盐酸吡哆锌：0.5mg/L，烟酸：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L；
调整成熟胚愈伤组织诱导培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅（压 力：1.0kg／cm2）灭菌20分钟；
3）高渗培养：
小麦成熟胚组织诱导培养5天后陆续产生成熟胚愈伤组织，挑选诱导 12天、质地致密的成熟胚愈伤组织转移到高渗培养基中，于20℃黑暗条件 高渗培养6h；
所述的高渗培养基为上述小麦成熟胚愈伤组织诱导培养基中再附加 0.2mol/L的甘露醇和0.2mol/L的山梨醇；
4）基因枪轰击转化：经高渗处理后的成熟胚愈伤组织用常规的基因枪 转化方法进行轰击转化，基因枪轰击参数为：金粉直径1.0μm，阻挡网与 轰击材料之间的距离为9.0cm，可裂膜压力为1100Pa，每枪金粉/DNA用量 为1μg/60μg，每皿材料轰击2次；
5）恢复培养：基因枪轰击后的成熟胚愈伤组织在上述高渗培养基上继 续暗培养18h后，将愈伤组织从高渗培养基转移至恢复培养基中，于26℃ 暗培养13天；
所述的小麦成熟胚愈伤组织恢复培养基以通用MS培养基为基准，添加 以下物质：2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）：1.5mg/L，6-呋喃基氨基嘌呤（KT）： 0.5mg/L，水解酪蛋白：500mg/L，L-天门冬酰胺：250mg/L，L-谷氨酰胺： 200mg/L，盐酸硫胺素（VB1）：8.0mg/L，蔗糖：15000mg/L，麦芽糖：15000 mg/L，琼脂：5000mg/L；
调整小麦成熟胚愈伤组织恢复培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅 （压力：1.0kg／cm2）灭菌20分钟；
6）抗性筛选：恢复培养后的愈伤组织转移到抗性筛选培养基上，于 26℃、3000lx光照下进行抗性细胞筛选，所述抗性筛选培养基以通用MS培 养基为基准，添加以下物质：2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）：1.0mg/L，6- 呋喃基氨基嘌呤（KT）：0.5mg/L，α-萘乙酸（NAA）：0.01mg/L，水解酪蛋 白：500mg/L，L-天门冬酰胺：250mg/L，L-谷氨酰胺200mg/L，盐酸硫胺素 （VB1）8.0mg/L，卡拉霉素：100mg/L，蔗糖：15000mg/L，麦芽糖：15000 mg/L，琼脂：5000mg/L；
调整抗性筛选培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅（压力：1.0kg／ cm2）灭菌20分钟；
7）分化培养：恢复及筛选培养后的成熟胚愈伤组织转至分化培养基上 进行分化培养；培养温度为25～28℃，光照度3000lx，每天光照12，所 述的分化培养基选用通用培养基MS，以通用培养基MS为基准，添加以下物 质：6－呋喃基氨基嘌呤（KT）：2.0mg/L，α-萘乙酸（NAA）：0.01mg/L， 酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，盐酸硫胺素（VB1）8.0mg/L，蔗糖： 15000mg/L，麦芽糖：15000mg/L，琼脂粉：5000mg/L。
调整分化培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅(压力：1.0kg／cm2) 灭菌20分钟；经基因枪轰击、恢复生长、筛选、再生的成熟胚愈伤组织在 分化培养基上分化出芽苗。
8）壮苗、生根培养：待成熟胚愈伤组织分化的芽苗长至2～3片叶时转 移到生根、壮苗培养基上，于25℃、3000Lx光照条件下进行壮苗、生根培 养；壮苗、生根培养基选用通用培养基MS，以通用培养基MS为基准，MS 通用培养的无机盐浓度降低一半，添加α－奈乙酸（NAA）0.5mg/L，蔗糖： 30000mg/L，琼脂粉：5000mg/L；调整壮苗、生根培养基的pH值为5.6，置 于高压灭菌锅(压力：1.0kg／cm2)灭菌20分钟；
9）移植：在壮苗、生根培养基上根、苗生长健壮的成熟胚愈伤组织再 生植株及时移栽到营养钵中，于15℃、3000Lx光照条件下缓苗，待完全缓 苗且进一步生长10天后，经低温（3-4℃）春化处理20天。
10）分子检测并筛选：用常规的分子检测技术对抗性个体进行分子检测， 筛选转化的转基因株。
以下是发明人给出的实施例：
如图1、2所示，发明人2012年以普通小麦西农1013和西农1376品种 （系）当年收获的小麦种子为材料，经10mg/L TDZ常温处理15h后，分离 成熟胚组织离体培养诱导愈伤组织，选取质地致密的500块成熟胚愈伤组织 用本发明技术进行基因枪轰击转化，经恢复培养、抗性筛选与再生，获得了 52个再生苗，经RT-PCR检测，获16个转基因阳性植株，转化效率达3.2%。