技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于鉴定黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的引 物及应用。
背景技术
黄曲霉毒素（Aflatoxins）是一类主要由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉 （Aspergillus parasiticus）等真菌产生的次级代谢产物，在我国，黄曲霉毒素主要由黄 曲霉产生。黄曲霉毒素具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用，仅0.294mg/kg 剂量就能引起敏感动物的急性中毒死亡，其主要的作用靶标是肝脏，是诱发恶性肿瘤 原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma）的主要因素之一，最短24周内就能够导 致肝脏坏死癌变等，此外还可以引起肾脏和肾上腺的急性病变。因此，有效防控黄曲 霉毒素污染，对于保障我国食品安全和维护国家经济利益具有重要意义。
不同黄曲霉菌株在产黄曲霉毒素能力上有很大差异，其中不产毒黄曲霉可以占到 0%-80%。最近，利用不产毒黄曲霉来抑制产毒黄曲霉的生长从而控制农产品中黄曲霉 毒素的含量在美国、非洲等国家和地区得到了较好的应用。可见，如何鉴定黄曲霉是 否产毒是非常重要的。目前，对黄曲霉是否产毒主要是先培养黄曲霉菌株，然后再提 取毒素，最后对毒素含量进行检测，非常费时费力。因此，开发一种快速鉴定黄曲霉 是否产毒的方法对于筛选不产毒黄曲霉，从而控制农产品中黄曲霉毒素的污染具有重 要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴定黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的引物及应用。
本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的引物 对组，具体由如下4个引物对组成：序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA 组成的引物对1、序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2、序 列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对3，以及序列表中序列7和 序列8所示的两条单链DNA组成的引物对4。
黄曲霉毒素主要是由黄曲霉3号染色体内一个70kb左右基因簇上的29个基因参 与其合成与调控的。研究表明不产毒黄曲霉主要是由于其毒素合成基因缺失造成的。 其中，所述引物对1特异于aflT基因；所述引物对2特异于nor-1基因；所述引物对3 特异于aflR基因；所述引物对4特异于hypB基因。
在所述引物对组中，每个引物对的两条引物在PCR反应体系中等量使用。
含有所述引物对组的试剂盒也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供所述引物对组的制备方法。
所述引物对组的制备方法，具体可包括将所述引物对组中各引物对的所述两条单 链DNA分别单独包装的步骤。
本发明的还一个目的是提供所述试剂盒的制备方法。
所述试剂盒的制备方法，具体可包括如下步骤：将所述引物对组中各引物对的所 述两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内： PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
所述引物对组，或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒 素中的应用，或在制备用于鉴定或辅助鉴定待测黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的产品 中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的再一个目的是提供一种利用所述引物对组，或所述试剂盒鉴定或辅助鉴 定待测黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的方法。
该方法具体可包括如下步骤：
（1）从待测黄曲霉菌株中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对组中的4 个引物对分别进行PCR扩增，得到4份PCR产物；
（2）根据步骤（1）所得4份PCR产物，按照如下方法确定待测黄曲霉菌株是否 产黄曲霉毒素：若所述4份PCR产物中目的DNA片段的数目为3个以下，则所述待 测黄曲霉菌株不产黄曲霉毒素，或候选不产黄曲霉毒素；若所述4份PCR产物中目的 DNA片段的数目为4个，则所述待测黄曲霉菌株产黄曲霉毒素，或候选产黄曲霉毒素；
所述目的DNA片段为如下任一：利用所述引物对1扩增得到的大小为1141bp 的DNA片段；利用所述引物对2扩增得到的大小为977bp的DNA片段；利用所述 引物对3扩增得到的大小为629bp的DNA片段；利用所述引物对4扩增得到的大小 为422bp的DNA片段。
在步骤（1）中，采用所述4个引物对分别进行PCR扩增时采用的退火温度均为 55℃。
在所述方法的步骤（1）中，进行所述PCR扩增的反应条件具体为：95℃预变性 2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环；最后72℃延 伸7min。
在所述方法的步骤（1）中，在进行所述PCR扩增的每个反应体系中，所述引物 对中每条单链DNA分子的终浓度均可为0.2-0.5μM，具体如0.5μM。
进一步，进行所述PCR扩增的反应体系具体为：模板1μL，10μM的上下游引 物各1μL（终浓度均为0.5μM），2×ColorlessReaction Buffer10μL，补双蒸 水7μL至20μL体系。其中，2×ColorlessReaction Buffer Gotag为美国promega 公司产品，其产品目录号为M7132。
在所述方法中，所述大小为1141bp的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中序 列9所示；所述大小为977bp的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中序列10所示； 所述大小为629bp的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中序列11所示；所述大小 为422bp的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中序列12所示。
在本发明中，所述待测黄曲霉菌株具体为如下中的任一种：黄曲霉菌（Aspergillus flavus）DW-12、黄曲霉菌（Aspergillus flavus）DW-14、黄曲霉菌（Aspergillus flavus） XinZ-11、黄曲霉菌（Aspergillus flavus）XinZ-27、黄曲霉菌（Aspergillus flavus）XinZ-33、 黄曲霉菌（Aspergillus flavus）YC-19、黄曲霉菌（Aspergillus flavus）HG-14、黄曲霉 菌（Aspergillus flavus）QD-1、黄曲霉菌（Aspergillus flavus）JZ-2、黄曲霉菌（Aspergillus flavus）GZ-17、黄曲霉菌（Aspergillus flavus）DW-5、黄曲霉菌（Aspergillus flavus） DW-6、黄曲霉菌（Aspergillus flavus）XinZ-15、黄曲霉菌（Aspergillus flavus）XinZ-24、 黄曲霉菌（Aspergillus flavus）YC-10、黄曲霉菌（Aspergillus flavus）HG-12、黄曲霉 菌（Aspergillus flavus）HG-24、黄曲霉菌（Aspergillus flavus）QD-15、黄曲霉菌（Aspergillus flavus）FX-1和黄曲霉菌（Aspergillus flavus）GZ-9。
在本发明中，以上所有的所述黄曲霉毒素均可为如下中的至少一种：黄曲霉毒素 B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2。
实验证明，本发明提供了用于鉴定黄曲霉菌株是否产毒的引物序列，这些序列特 异性高，通过利用该引物序列PCR扩增鉴定产毒黄曲霉和不产毒黄曲霉，具有速度快， 可信度度高等特点，为快速、准确、高通量筛选不产毒黄曲霉菌株提供了很好的技术 手段，对控制农产品中黄曲霉毒素的污染具有十分重要的意义。
附图说明
图1为特异性检测各菌株PCR扩增产物的凝胶电泳图谱。
图2为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合标准品的HPLC图谱。其中，1为黄曲霉 毒素标准品中AFG2，保留时间为7.861min；2为黄曲霉毒素标准品中AFG1，保留时 间为8.793min；3为黄曲霉毒素标准品中AFB2，保留时间为10.293min；4为黄曲霉 毒素标准品中AFB1，保留时间为11.735min。
图3为不产毒黄曲霉菌株DW-12发酵滤液的HPLC图谱。
图4为产毒黄曲霉菌株DW-5发酵滤液的HPLC图谱。
图5为不产毒黄曲霉菌株DW-12、XinZ-11、XinZ-27和QD-1的C3，aflT，norA 和hypA四个基因PCR扩增产物的凝胶电泳图谱。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
黄曲霉菌（Aspergillus flavus）菌株DW-12、DW-14、XinZ-11、XinZ-27、XinZ-33、 YC-19、HG-14、QD-1、JZ-2、GZ-17，以及DW-5、DW-6、XinZ-15、XinZ-24、YC-10、 HG-12、HG-24、QD-15、FX-1、GZ-9：记载于“张初署.2013.中国四个生态区花生 土壤中黄曲霉菌分布、产毒特征及遗传多样性研究[D]博士学位论文.北京:中国农 业科学院农产品加工研究所”一文，公众可从中国农业科学院农产品加工研究所获得。
黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合标准品（LB96951）：购于SUPELCO公司。
实施例1、用于鉴定黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的引物的设计与合成
根据毒素合成基因aflT，nor-1，aflR和hypB的序列，设计4组PCR引物，分别 为aflT-F/aflT-R，nor-1-F/nor-1-R，aflR-F/aflR-R和hypB-F/hypB-R。具体如表1所示。 引物由上海生工合成，也可通过常规的引物合成方法合成。
表1不同毒素合成基因引物序列
实施例2、黄曲霉菌株是否产毒的鉴定
供试菌株：黄曲霉菌（Aspergillus flavus）菌株DW-12、DW-14、XinZ-11、XinZ-27、 XinZ-33、YC-19、HG-14、QD-1、JZ-2、GZ-17，以及DW-5、DW-6、XinZ-15、XinZ-24、 YC-10、HG-12、HG-24、QD-15、FX-1、GZ-9。
一、菌株DNA提取
用接种针从PDA平板上刮取0.2g的菌丝，放入离心管中，倒入液氮，然后放于 高速组织捣碎机中，把菌丝体研磨成粉末状。将研磨后的菌丝体粉末移至2mL离心 管中，加入750μL的提取液（配方：溶剂为水，溶质及其浓度为：100mmol/L Tris-HCl， 150mmol/L EDTA，pH8.0），50℃静置2min，再加入150μL10%（10g/100ml）SDS 水溶液，混匀后，加入450μL氯化苄，剧烈振荡离心管，使管内混合物成乳状。置 50℃水浴锅中保温1h。加入450μL浓度为3mol/L的NaAc水溶液，混匀后冰浴15min。 4℃，12000r/min离心10min后收集上清液至1.5mL离心管中。加入等体积氯仿∶异 戊醇（24∶1）（v/v），充分混匀后，4℃，12000r/min离心5min，吸出上清液至1.5mL 新的离心管中，加入等体积异丙醇沉淀30min左右，4℃，12000r/min离心10min， 沉淀用70%（体积分数）的乙醇洗涤，室温放置干燥10min，溶于100μL的TE缓冲 液，-20℃保存备用。各供试黄曲霉菌株的DNA均采用上述方法提取。
二、本发明所提供的引物扩增法鉴定供试黄曲霉菌株是否产毒
1、操作方法及结果判定方法
以待测黄曲霉菌株的DNA为模板，用实施例1中设计合成的4组引物 aflT-F/aflT-R，nor-1-F/nor-1-R，aflR-F/aflR-R和hypB-F/hypB-R分别进行PCR反应， 每个反应均设阴性对照（以无菌水作为模板）。
PCR反应体系均为：1μL DNA模板，浓度为10μM的上下游引物各1μL（上下 游引物在反应体系中的终浓度为0.5μM），2×Colorless Reaction Buffer Gotag 10μL，双蒸水补足至20μL。其中，2×Colorless Reaction Buffer Gotag为美国 promega公司产品，其产品目录号为M7132。
反应条件均为：95℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 30s，进行30个循环；最后72℃延伸7min。
PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳后，用凝胶成像系统进行 拍照。
结果判定方法：
若经步骤1的PCR扩增所得的4份PCR产物中目的DNA片段的数目为3个以下， 则判定所述待测黄曲霉菌株不产黄曲霉毒素；若所述4份PCR产物中目的DNA片段 的数目为4个，则判定所述待测黄曲霉菌株产黄曲霉毒素。
其中，所述目的DNA片段为如下任一：利用所述引物对aflT-F/aflT-R扩增得到 的大小为1141bp的DNA片段（序列9）；利用所述引物对nor-1-F/nor-1-R扩增得到 的大小为977bp的DNA片段（序列10）；利用所述引物对aflR-F/aflR-R扩增得到的 大小为629bp的DNA片段（序列11）；利用所述引物对hypB-F/hypB-R扩增得到的 大小为422bp的DNA片段（序列12）。
2、对供试黄曲霉菌株是否产毒的鉴定
分别以步骤一提取的各供试黄曲霉菌株的DNA为模板，参照步骤1所述的方法 进行PCR扩增，并按照步骤1所述的结果判定方法对扩增结果进行判定。实验重复三 次。
电泳结果如图1所示，黄曲霉菌（Aspergillus flavus）菌株DW-12和QD-1有3条 电泳条带，即1141bp（aflT）、977bp（nor-1）和629bp（aflR），说明缺失毒素合成基 因hypB；菌株XinZ-11和XinZ-27有2条电泳条带，即1141bp（aflT）和977bp（nor-1）， 说明缺失毒素合成基因aflR和hypB；菌株YC-19有2条电泳条带，即977bp（nor-1） 和422bp（hypB），说明缺失毒素合成基因aflT和aflR；菌株DW-14只有1条电泳条 带，即629bp（aflR），说明缺失毒素合成基因aflT，nor-1和hypB；菌株XinZ-33和 JZ-2只有1条电泳条带，即422bp（hypB），说明缺失毒素合成基因aflT，nor-1和aflR； 菌株HG-14和GZ-17没有电泳条带，说明上述4个毒素合成基因均缺失；因此，判定 黄曲霉菌（Aspergillus flavus）菌株DW-12、DW-14、XinZ-11、XinZ-27、XinZ-33、 YC-19、HG-14、QD-1、JZ-2和GZ-17为不产毒黄曲霉。黄曲霉菌（Aspergillus flavus） 菌株DW-5、DW-6、XinZ-15、XinZ-24、YC-10、HG-12、HG-24、QD-15、FX-1和 GZ-9都有4条条带，表明它们极有可能是产毒黄曲霉。
进一步，本发明的发明人对各供试菌株的相应目的条带进行回收测序，结果显示， 1141bp（aflT）的目的条带的核苷酸序列正如序列表中序列9所示；977bp（nor-1） 的目的条带的核苷酸序列正如序列表中序列10所示；629bp（aflR）的目的条带的核 苷酸序列正如序列表中序列11所示；422bp（hypB）的目的条带的核苷酸序列正如序 列表中序列12所示。
三、高效液相色谱法检测供试黄曲霉菌株是否产毒
将各供试黄曲霉菌株接种于MEA斜面试管培养基（配方：每升培养基中含有麦 芽浸粉30.0g，大豆蛋白胨3.0g，琼脂15.0g；pH5.8）上，28℃培养5天，将5mL 无菌生理盐水加入MEA斜面试管培养基冲洗，制得菌悬液。将菌悬液加入50mL的 试管中，再加入10mL的培养液（配方：溶剂为水，溶质及其浓度为：蔗糖150g/L， 酵母提取物20g/L，大豆蛋白胨10g/L，pH5.9），30℃培养5天。将液体发酵液用滤 纸过滤，将滤液稀释10倍，取10mL滤液加入到加入到免疫亲和柱（北京华安麦科 生物技术有限公司产品，其产品目录号为HCM0125）中，待液体排干后，用蒸馏水或 去离子水洗涤2次，每次10mL，流速2～3滴/秒；待液体排干后，上样1mL甲醇， 用样品瓶接洗脱液，洗脱后液体用于HPLC。高效液相色谱条件：C18色谱柱（4.6 mm×150mm，5μm）；荧光检测器2475型，激发波长360nm，发射波长：440nm； 柱温：30℃；流动相：以甲醇：水（1:1，V:V）为流动相；进样量：20μL；流速： 1.0mL/min。
同时以黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合标准品（LB96951）作为对照，用甲醇配 制成溶液，按照如上条件进行高效液相色谱检测。看取自各供试黄曲霉菌株的待测样 品的色谱图在与黄曲霉毒素标准品相同的保留时间处是否有色谱峰出现。
实验重复三次。
黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合标准品（LB96951）的HPLC图谱如图2所示， 从图中可以看出，黄曲霉毒素标准品中AFG2的保留时间为7.861min，AFG1的保留时 间为8.793min，AFB2的保留时间为10.293min，AFB1的保留时间为11.735min。
各供试菌株中，黄曲霉菌（Aspergillus flavus）菌株DW-12、DW-14、XinZ-11、 XinZ-27、XinZ-33、YC-19、HG-14、QD-1、JZ-2和GZ-17的HPLC图谱在与黄曲霉 毒素标准品对应的以上四个保留时间处均没有色谱峰产生。由此可见，这10个菌株不 产黄曲霉毒素。其中黄曲霉菌（Aspergillus flavus）菌株DW-12的HPLC图谱如图3 所示。
各供试菌株中，黄曲霉菌（Aspergillus flavus）菌株DW-5、DW-6、XinZ-15、XinZ-24、 YC-10、HG-12、HG-24、QD-15、FX-1和GZ-9的HPLC图谱在与黄曲霉毒素标准品 对应的以上四个保留时间处均至少有一个色谱峰产生。由此可见，这10个菌株产黄曲 霉毒素。其中黄曲霉菌（Aspergillus flavus）菌株DW-5的HPLC图谱如图4所示。
对于各供试黄曲霉菌株来说，采用高效液相色谱法的检测结果与步骤二中采用本 发明提供的引物扩增法的鉴定结果完全一致。这证实了本发明所提供的引物扩增法鉴 定待测黄曲霉菌株是否产毒的方法的准确性。
对比例1、现有其他PCR扩增法鉴定待测黄曲霉菌株是否产毒的对照
供试菌株：黄曲霉菌（Aspergillus flavus）菌株DW-12、DW-14、XinZ-11、XinZ-27、 XinZ-33、YC-19、HG-14、QD-1、JZ-2、GZ-17。
采用专利申请（发明名称：多重PCR鉴定不产黄曲霉毒素黄曲霉的引物序列及方 法；申请号：200910154898.7）中公开的方法，以各供试黄曲霉菌菌株的基因组DNA 为模板进行PCR扩增。PCR扩增的靶基因与本发明不同，为C3，aflT，norA和hypA。
结果显示，其中供试菌株DW-12、XinZ-11、XinZ-27和QD-1的C3，aflT，norA 和hypA4个基因都存在（如图5所示），即按照专利（发明名称：多重PCR鉴定不产 黄曲霉毒素黄曲霉的引物序列及方法；申请号：200910154898.7）中记载的方法，这 些菌株将被判定可能是产毒菌，但其实这四株菌用HPLC检测均为不产毒菌。可见， 相比之下，本发明所提供的方法的准确性更高一些。