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1、(10)授权公告号 CN 102618607 B (45)授权公告日 2013.12.18 CN 102618607 B *CN102618607B* (21)申请号 201110446353.0 (22)申请日 2011.12.28 C12P 21/06(2006.01) C07K 1/34(2006.01) (73)专利权人 广东省食品工业研究所 地址 510308 广东省广州市新港东路 146 号 (72)发明人 钟细娥 李春荣 高展炬 詹耀才 (74)专利代理机构 广州知友专利商标代理有限 公司 44104 代理人 李海波 CN 101886107 A,2010.11.17, 全文 .。
2、 CN 101987864 A,2011.03.23, 全文 . CN 101096698 A,2008.01.02, 全文 . CN 101012472 B,2010.09.15, 权利要求 1. Juan Bautista 等 .Low Molecular Weight Sunflower Protein Hydrolysate with Low Concentration in Aromatic Amino Acids.J. Agric. Food Chem .1996, 第 44 卷 ( 第 4 期 ), 摘要， 第 967 页第 2 栏第 2-3 段 . 王婷等 . 酶解葵花籽粕蛋白。
3、制备降血压肽的 工艺研究 .食品工业科技 .2010, 第 31 卷 ( 第 11 期 ), 第 268-271 页 . Juan Bautista 等 .Sunflower protein hydrolysates for dietary treatment of patients with liver failure. Journal of the American Oil Chemists Society .2000, 第 77 卷 ( 第 2 期 ), 第 121-126 页 . (54) 发明名称 一种高 F 值葵花低聚肽的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种高 F 值葵花低聚。
4、肽的制备 方法， 该方法是以葵花粕蛋白为原料， 采用多酶法 联合水解技术酶解， 将葵花浓缩蛋白水解成以芳 香族氨基酸为端基的多肽， 然后用第二种酶水解 多肽成芳香族氨基酸、 游离氨基酸和低聚肽， 进而 采用微滤和纳滤二级膜技术进行脱盐以及除去游 离氨基酸和芳香族氨基酸， 提高 F 值的比例， 最 后经脱盐、 浓缩、 冷冻干燥获得高 F 值的葵花低聚 肽。本发明具有以下技术效果 ：（1） 反应条件温 和、 获得的产品活性高 ；（2） 制备方法清洁环保， 无污染， 符合国家清洁生产的相关政策 ；（3） 制得 的产品具有显著的生理功效， 能充分适用于保健 品行业。 (51)Int.Cl. (56)对。
5、比文件 审查员 孙跃辉 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 (10)授权公告号 CN 102618607 B CN 102618607 B *CN102618607B* 1/1 页 2 1. 一种高 F 值葵花低聚肽的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： （1） 混和 ： 取葵花粕蛋白， 加水搅拌形成酶解体系 ； （2） 一酶水解 ： 在步骤 （1） 中所得的酶解体系中， 加入碱性蛋白酶， 调节温度 4055， pH7.59， 反应时间为 30240min， 然后升温至 8590， 保持 1520min，。
6、 灭酶， 获得以芳香族 氨基酸为端基的多肽溶液， 其中的碱性蛋白酶是指通过枯草杆菌发酵提取或动物胰脏提取 而得的碱性蛋白酶， 其添加量是底物质量的 0.11% ； （3） 二酶水解 ： 在步骤 （2） 中所得的多肽溶液中加入肌动蛋白酶， 调节温度 4565， pH3.57， 反应时间为 30240min， 然后升温至 8590， 保持 1520min， 灭酶， 获得低芳香族 氨基酸肽和游离氨基酸 ； （4）离心 ： 将步骤 （3）中所得的酶解液进行离心， 采用高速离心机， 离心速度 20004500rpm， 离心时间 530min， 获得酶解离心液 ； （5） 一级膜技术 ： 将步骤 （4） 。
7、中所得的酶解离心液进行微滤， 除去分子量较大的物质， 获得澄清的多肽滤液， 其中微滤采用的滤膜的孔径范围是 0.110 微米 ； （6） 二级膜技术 ： 在步骤 （5） 中所得的多肽滤液中进一步采用纳米过滤， 纳米过滤采用 的滤膜是 NF-1014S、 NF-1015S 或 NF-1016S， 截留分子量 3002000， 操作压差 0.52.0MPa， 将低聚肽与芳香族氨基酸、 游离氨基酸、 盐分离出同时起到浓缩的作用， 获得高 F 值的葵花 低聚肽。 2. 根据权利要求 1 所述的高 F 值葵花低聚肽的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （1） 中 酶解底物体系调配至质量比为 120%。 。
8、权 利 要 求 书 CN 102618607 B 2 1/3 页 3 一种高 F 值葵花低聚肽的制备方法 技术领域 0001 本发明属于植物深加工技术领域， 具体涉及到一种高 F 值葵花低聚肽的制备方 法。 背景技术 0002 葵花籽的产量在世界主要植物油料资源中占第二位。我国葵花籽产量也比较丰 富， 东北是我国葵花籽的主要产区。 制油后的葵花粕是较好的食用蛋白质资源 （蛋白质含量 在 4060%） ， 并且不具有其它植物油中典型的有毒成份， 是一种很理想的植物蛋白资源。但 由于葵花籽中有显色酚， 限制了其在食品中的直接使用。因此， 以葵花籽蛋白为资源， 通过 生物技术制备具有显著生理功效的低。
9、聚肽是非常有前景的， 尤其是对于制备成高 F 值低聚 肽来说是一个非常好的资源。 0003 高F值低聚肽是指一类由37个氨基酸残基所组成的低聚肽， 其中支链氨基酸 （主 要指必需氨基酸亮氨酸、 异亮氨酸和缬氨酸） 的含量与芳香族氨基酸 （主要指苯丙氨酸、 酪 氨酸和色氨酸） 含量的比值大于 20。高 F 值低聚肽在改善肝功能方、 抗疲劳、 降血清胆固醇 浓度方面具有显著的生理功效。它在抗疲劳方面主要作用机理在于， 高 F 值低聚肽具有含 量较高的支链氨基酸， 通过补充高 F 值低聚肽， 支链氨基酸进入肌肉组织中氧化脱氨， 一方 面生成相应的 - 酮酸进入三羧酸而氧化供能， 另一方面， 脱下来的。
10、氨基与丙酮酸或谷氨 酸偶联， 促进丙氨酸和谷氨酰胺的形成， 从而成为可提供能量的物质， 从而减轻疲劳。 0004 目前， 国内外较多的研究人员是采用动物蛋白 （如鱼蛋白、 乳清蛋白） 、 植物蛋白 （玉米黄粉、 玉米醇溶蛋白、 大豆分离蛋白） 为原料， 尚未见有报道是采用葵花粕蛋白为提取 原料。在精制分离时国内外常采用活性碳色谱法和凝胶过滤法除去芳香族氨基酸来提高 F 值 ， 然后再蒸汽加热浓缩， 这些方法存在一定的产业化局限 ： 色谱法会会消耗大量的水淋 洗液， 水洗液中肽类浓度较低 (0.1%0.5%)， 由此需要较长时间进行浓缩， 不仅浓缩成本高， 而且浓缩时间过长， 易破坏产品的活性。。
11、 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种高 F 值葵花低聚肽的制备方法， 该方法采用新原料制备 高 F 值低聚肽， 进一步提高葵花籽蛋白的利用价值， 解决目前这类产品不足的问题。 0006 本发明是以葵花浓缩蛋白为原料， 配以缓冲溶液形成酶解体系， 然后采用三酶法 联合水解技术水解， 即将葵花浓缩蛋白水解成以芳香族氨基酸为端基的多肽， 然后用第二 种酶水解多肽成芳香族氨基酸肽和游离氨基酸， 进而采用微滤和超滤二级膜技术进行脱盐 以及除去游离氨基酸， 提高 F 值的比例， 最后经脱盐、 浓缩、 冷冻干燥而成。具体包括以下步 骤 ： 0007 （1） 混和 ： 取葵花粕蛋白， 加水搅拌形成酶解。
12、体系 ； 0008 （2）一酶水解 ： 在步骤 （1）中所得的酶解体系中， 加入碱性蛋白酶， 调节温度 4055， pH7.59， 反应时间为 30240min， 然后升温至 8590， 保持 1520min， 灭酶， 获得 说 明 书 CN 102618607 B 3 2/3 页 4 以芳香族氨基酸为端基的多肽溶液 ； 0009 （3）二酶水解 ： 在步骤 （2）中所得的多肽溶液中加入肌动蛋白酶， 调节温度 4565， pH3.57， 反应时间为 30240min， 然后升温至 8590， 保持 1520min， 灭酶， 获得 低芳香族氨基酸肽和游离氨基酸 ； 0010 （4）离心 ： 将步。
13、骤 （3）中所得的酶解液进行离心， 采用高速离心机， 离心速度 20004500rpm， 离心时间 530min， 获得酶解离心液 ； 0011 （5） 一级膜技术 ： 将步骤 （4） 中所得的酶解离心液进行微滤， 除去分子量较大的物 质， 获得澄清的多肽滤液 ； 0012 （6） 二级膜技术 ： 在步骤 （5） 中所得的多肽滤液中进一步采用纳米过滤， 将低聚肽 与芳香族氨基酸、 游离氨基酸、 盐分离出同时起到浓缩的作用， 获得高 F 值的葵花低聚肽。 0013 所述步骤 （1） 中酶解底物体系调配至质量比为 120%。 0014 所述步骤 （2） 中采用的碱性蛋白酶是指通过枯草杆菌发酵提取或。
14、动物胰脏提取而 得的碱性蛋白酶， 其添加量是底物质量的 0.11%。 0015 所述步骤 （5） 中微滤采用的滤膜的孔径范围是 0.110 微米。 0016 所述步骤 （6） 中纳米过滤采用的滤膜是 NF-1014S、 NF-1015S 或 NF-1016S， 截留分 子量 3002000， 操作压差 0.52.0MPa。 0017 与现有的技术相比， 本发明具有以下技术效果 ： 0018 （1） 本发明制备方法反应条件温和、 获得的产品活性高 ； 0019 （2） 本发明制备方法清洁环保， 无污染， 符合国家清洁生产的相关政策 ； 0020 （3） 本发明制备方法制得的产品具有显著的生理功效。
15、， 能充分适用于保健品行业。 具体实施方式 0021 以下实施例仅用于阐述本发明， 而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施 例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开内容和各参数所取范围， 均可实现 本发明的目的。 0022 实施例 1 0023 称取 10 克葵花粕蛋白， 加入 50 亳升水， 用氢氧化钠调节 pH7.5， 加入 0.05 克碱 性蛋白酶， 升温到 40， 保持 40 分钟， 然后将酶解液继续升温到 90， 保持 15 分钟进行灭 酶， 灭酶后将酶解液冷却到 45， 用柠檬酸调节 pH4， 加入 0.05 克肌动蛋白酶， 保持 40 分 钟， 然后将酶解液继续升温到 。
16、90， 保持 15 分钟进行灭酶， 灭酶后进行离心， 调整离心速度 2000rpm， 离心时间保持 10 分钟， 然后倒出离心液选择膜孔径 0.5 微米的膜进行微滤， 获得 澄清的多肽溶液。 将滤液进一步纳滤， 选择NF-1014S膜， 截留分子量300， 操作压差0.6MPa， 将芳香族氨基酸和游离氨基酸以及盐分分离出来， 同时将葵花低聚肽溶液进行浓缩， 最后 进行冷冻干燥获得高 F 值的葵花低聚肽。 0024 实施例 2 0025 称取 50 克葵花粕蛋白， 加入 500 亳升水， 用氢氧化钠调节 pH7.6， 加入 0.1g 碱性 蛋白酶， 升温到 45， 保持 60 分钟， 然后将酶解。
17、液继续升温到 90， 保持 15 分钟进行灭 酶， 灭酶后将酶解液冷却到 50， 用柠檬酸调节 pH4， 加入 0.1g 肌动蛋白酶， 保持 120 分 钟， 然后将酶解液继续升温到 90， 保持 15 分钟进行灭酶， 灭酶后进行离心， 调整离心速度 说 明 书 CN 102618607 B 4 3/3 页 5 2500rpm， 离心时间保持 15 分钟， 然后倒出离心液选择膜孔径 0.3 微米的膜进行微滤， 获得 澄清的多肽溶液。 将滤液进一步纳滤， 选择NF-1001T膜， 截留分子量500， 操作压差0.5MPa， 将芳香族氨基酸和游离氨基酸以及盐分分离出来， 同时将葵花低聚肽溶液进行浓。
18、缩， 最后 进行冷冻干燥获得高 F 值的葵花低聚肽。 0026 实施例 3 0027 称取 100 克葵花粕蛋白， 加入 2000 亳升水， 用氢氧化钠调节 pH8.5， 加入 0.5g 碱 性蛋白酶， 升温到 45， 保持 45 分钟， 然后将酶解液继续升温到 90， 保持 15 分钟进行 灭酶， 灭酶后将酶解液冷却到 45， 用柠檬酸调节 pH4， 加入 0.5g 肌动蛋白酶， 保持 45 分 钟， 然后将酶解液继续升温到 90， 保持 15 分钟进行灭酶， 灭酶后进行离心， 调整离心速度 3000rpm， 离心时间保持 15 分钟， 然后倒出离心液选择膜孔径 8 微米的膜进行微滤， 获得。
19、澄 清的多肽溶液。将滤液进一步纳滤， 选择 NF-1016S 膜， 截留分子量 1000， 操作压差 0.5MPa， 将芳香族氨基酸和游离氨基酸以及盐分分离出来， 同时将葵花低聚肽溶液进行浓缩， 最后 进行冷冻干燥获得高 F 值的葵花低聚肽。 0028 实施例 4 0029 称取300克葵花粕蛋白， 加入5000亳升水， 用氢氧化钠调节pH8， 加入1g碱性蛋白 酶， 升温到 50， 保持 55 分钟， 然后将酶解液继续升温到 90， 保持 15 分钟进行灭酶， 灭酶 后将酶解液冷却到 50， 用柠檬酸调节 pH5， 加入 1g 肌动蛋白酶， 保持 120 分钟， 然后将酶 解液继续升温到 9。
20、0， 保持 15 分钟进行灭酶， 灭酶后进行离心， 调整离心速度 3500rpm， 离 心时间保持 20 分钟， 然后倒出离心液选择膜孔径 6 微米的膜进行微滤， 获得澄清的多肽溶 液。将滤液进一步纳滤， 选择 NF-1016S 膜， 截留分子量 500， 操作压差 1MPa， 将芳香族氨基 酸和游离氨基酸以及盐分分离出来， 同时将葵花低聚肽溶液进行浓缩， 最后进行冷冻干燥 获得高 F 值的葵花低聚肽。 0030 实施例 5 0031 称取 500 克葵花粕蛋白， 加入 6000 亳升水， 用氢氧化钠调节 pH8.2， 加入 1.3g 碱 性蛋白酶， 升温到 53， 保持 100 分钟， 然后。
21、将酶解液继续升温到 90， 保持 15 分钟进行 灭酶， 灭酶后将酶解液冷却到 50， 用柠檬酸调节 pH6， 加入 1.3g 肌动蛋白酶， 保持 60 分 钟， 然后将酶解液继续升温到 90， 保持 15 分钟进行灭酶， 灭酶后进行离心， 调整离心速度 4000rpm， 离心时间保持 10 分钟， 然后倒出离心液选择膜孔径 5 微米的膜进行微滤， 获得澄 清的多肽溶液。将滤液进一步纳滤， 选择 NF-1015S 膜， 截留分子量 1500， 操作压差 1MPa， 将 芳香族氨基酸和游离氨基酸以及盐分分离出来， 同时将葵花低聚肽溶液进行浓缩， 最后进 行冷冻干燥获得高 F 值的葵花低聚肽。 说 明 书 CN 102618607 B 5 。